способ массового получения микроклубней картофеля

Формула изобретения

1. Способ массового получения микроклубней картофеля, предусматривающий индукцию свободных от вируса микроклубнегенных ростков вида "Супфиор" на среде для индукции микроклубней, обработку микроклубнегенных ростков при низкой температуре и культивирование обработанных ростков на модифицированной среде для индукции микроростков, содержащей дополнительно ингибитор роста, для получения микроростков, отличающийся тем, что осуществляют индукцию микроклубнегенных ростков и получение микроклубней на твердой среде, содержащейся в укладываемых соответственно сосудах плоских чашках Петри, выдерживают ростки в течение 1 недели на свету при 30^oС и в течение следующей недели в темноте примерно при 10^oС и получают микроклубни культивированием указанных выдержанных ростков в течение 6 ч при 20^oС на свету и в течение 18 ч при 12^oС в темноте.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроклубнегенные ростки индуцируют на твердой среде, имеющей следующий состав, мг/л:

Аммония нитрат 2000

Калия нитрат 2500

Кальция хлорид двуводный 440

Магния сульфат семиводный 370

Калия фосфат 170

Натрий ЭДТА 37,25

Железа сульфат семиводный 27,85

Марганца сульфат одноводный 16,9

Борная кислота 6,2

Цинка сульфат семиводный 8,6

Калия иодид 0,83

Натрия молибдат двуводный 0,25

Меди сульфат пятиводный 0,025

Кобальта хлорид шестиводный 0,025

Миоинозитол 100

Аскорбиновая кислота 50

Гибберелловая кислота 0,1

Зеатина рибозид 0,1

Сахароза 20000

Агар 10000

Цианокобаламин 1,5

Фолиевая кислота 0,5

Рибофлавин 0,5

Биотин 1

Холинхлорид 1

Кальция пантотенат 1

Тиамина хлористоводородная соль 1

Никотинамид 2

Пиридоксин HCl 2

Парааминобензойная кислота 0,5

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроклубни получают на твердой среде, имеющей следующий состав, мг/л:

Аммония нитрат 1000

Калия нитрат 1500

Кальция хлорид двуводный 440

Магния сульфат семиводный 370

Калия фосфат 500

Na₂ ЭДТА 37,25

Железа двухвалентного сульфат семиводный 27,85

Марганца сульфат одноводный 16,9

Борная кислота 6,2

Цинка сульфат семиводный 8,6

Калия иодид 0,83

Натрия молибдат двуводный 0,25

Меди сульфат пятиводный 0,025

Кобальта хлорид шестиводный 0,025

Миоинозитол 100

Зеатина рибозид 0,1

Аскорбиновая кислота 50

Хлорхолинхлорид, или фосфон D, или Amo-1618, или В-905 100

Сахароза 90

Агар 10

Цианокобаламин 1,5

Фолиевая кислота 0,5

Рибофлавин 0,5

Биотин 1

Хлорид холина 1

Кальция пантотенат 1

Тиамина хлористоводородная соль 1

Никотинамид 2

Пиридоксин HCl 2

Парааминобензойная кислота 0,5о

Описание изобретения к патенту

Это изобретение относится к новому способу массового производства искусственного семенного картофеля (микроклубней картофеля), свободного от патогенов (особенно вирусов), использующему технику культивирования растительной ткани.

Картофель является видом растения, который принадлежит к семейству пасленовых и характеризуется вегетативным размножением посредством клубней. Одной из самых серьезных проблем, обычно имеющихся для большинства технических культур вегетативного размножения, является снижение уровня, вызванное вирусной инфекцией, и в случае картофеля урон, вызванный им, является особенно серьезным (Manzer F.E. Merriam D.C. and Helper P.R. 1978. Am. Potato Jour. 55: 601 609. Schultz E.C. and Bonde R. 1944. Am. potato J. 21: 278 283. Wright N. S. 1977. Am. potato J. 54: 147 149. Корейская программа семенного картофеля: организация, воздействие, результаты. 1987. Международный центр картофеля. стр. 19 24). Поэтому обеспечение поставок свободного от вируса семенного картофеля играет решающую роль в решении урожайности технической культуры картофеля каждый год.

Хорошо известно, что большинство вирусной инфекции вызывается растительной тлей, которая может легко переносить вирус через свой рот. Поэтому для того, чтобы производить свободный от вируса семенной картофель, производственная площадь должна быть расположена на высокогорной площади, где популяция растительной тли, переносящая вирусы, является очень низкой. Однако при использовании этого традиционного метода эффективность производства свободного от вируса семенного картофеля так низка, что очень трудно производить огромное количество семенного картофеля хорошего качества, которое необходимо ежегодно.

Недавно благодаря быстрому развитию техники культивирования растительной ткани стало возможным массовое разведение многих разновидностей растений, используя in vitro технику. В случае картофеля система быстрого разведения свободных от вируса растеньиц, используя технику культивирования точки роста, хорошо подтверждена (Goodwin P.B. Kim Y.C. and Adisarwanto, T. 1980. Potato Res. 23 9 23. Hussey G. and Stacey N.J. 1981. Ann. Bot. 48: 787 796. Roset S. and Bokelmann G.S. 1976. Potato Res 19: 173 178) и уже используется на коммерческой основе в некоторой степени. Однако, исходя из эффективности производства, вышеупомянутая система имеет несколько серьезных недостатков, один из которых заключается в том, что процесс трансплантации из in vitro в почву является процессом, требующим такого времени и труда, что всегда необходима интенсивная забота и таким образом во время этого процесса многие in vitro проросшие нежные картофельные ростки не могут выдержать внезапного изменения окружающей среды.

С 1970 имеется несколько сообщений об образовании микроклубеньков картофеля in vitro, но эффективность производства оказалась настолько низкой, что исследователи использовали явление образования микроклубней только в качестве экспериментального инструмента для изучения физиологии клубнеобразования картофеля (Garcia-Torres L. and Gomez-Campo C. 1973. Potato Res. 16: 732 79. Abbott A. J. and Belcher A.R. 1986. Jnplant Tissue Culture and its Agricultural application wortus Butter, pp. 113 122. Hussey G. and Stacey N.J. 1984. Ann. Bot. 53: 565 578).

Недавно также предпринято несколько попыток получить в больших количествах свободный от вируса хорошего качества семенной картофель путем выращивания микроклубней картофеля, произведенного in vitro с использованием способа культивирования в жидкой питательной среде (Wang P.J. and HU. C.Y. 1982. Amer Potato Jour 59: 33 39. International patent application Number: PCT/HU 86/00053, 1986). Однако эффективность производства микроклубней с использованием вышеупомянутых методов все еще слишком низка, для того чтобы заменить натуральный семенной картофель. Более того, микроклубни, которые были получены вышеупомянутыми способами культивирования в жидкой питательной среде, имеют несколько решающих недостатков, таких как легкое высушивание во время хранения и часто встречающееся остекление микроклубней, что делает непригодным искусственный семенной картофель. Несмотря на эти проблемы, микроклубеньки картофеля, которые образуются во время культивирования растительной ткани ростков картофеля, по-видимому, могут быть использованы в качестве одного из путей замены точек роста картофеля, потому что микроклубни картофеля являются значительно менее нежными и с ними легче манипулировать на стадии трансплантации, чем с растеньицами, полученными при культивировании растительной ткани. В конце концов благодаря характерной черте вегетативного размножения картофеля количество семенного картофеля, требуемого ежегодно, так огромно, что, даже если микроклубни должны доказать свое практическое значение, важность будет сводиться к нулю, если не развивать какой-либо путь массового производства огромного количества микроклубеньков на малой площади и таким образом снабжать ими фермеров по низкой цене, достаточной, чтобы заменить натуральный семенной картофель.

Поэтому в этом изобретении мы намереваемся развить новый способ массового производства микроклубней картофеля по цене, достаточно низкой, чтобы обеспечить ими непосредственно фермеров в качестве реальных заменителей натурального семенного картофеля.

В соответствии с этим некоторые цели и преимущества нашего изобретения заключаются в развитии нового способа культивирования растительной ткани для массового производства искусственного семенного картофеля (микроклубеньков картофеля), свободного от патогена, который будет способен заменить натуральный семенной картофель или быть использованным в качестве заменяющего семенной картофель, непосредственно предшествуя производству натурального семенного картофеля. Как результат этого изобретения сейчас становится возможным массовое производство искусственного семенного картофеля, по крайней мере более чем в 30 раз более эффективное, чем уже известный способ производства микроклубеньков. Таким образом, благодаря этому изобретению возможно производить искусственный семенной картофель по значительно более дешевой цене, достаточной, чтобы обеспечить фермеров в качестве заменителя натурального семенного картофеля. Другие цели и преимущества нашего изобретения станут очевидными из рассмотрения фигур и детального описания изобретения.

Фиг. 1. Ростки, дающие микроклубеньки сорта "Супериор", которые быстро проросли на искусственных средах для культивирования в чашке Петри.

Фиг. 2. Микроклубеньки картофеля сорта "Супериор", которые быстро образовались на искусственных средах для культивирования в чашке Петри.

Фиг. 3. Микроклубеньки картофеля сорта "Супериор", которые хранились стерильно в чашке Петри при низкой температуре в течение длительного периода хранения.

Фиг. 4. Картофель непосредственно перед сбором урожая, полученный прорастанием микроклубеньков.

Фиг. 5. Средний выход картофеля, собранного с растения, полученного из одного микроклубенька сорта "Супериор".

Весь способ массового производства искусственного семенного картофеля нашего изобретения составляет несколько стадий. Следующие эксперименты проиллюстрируют более детально, что реально представляет собой изобретение, но из этого не следует, что это изобретение ограничивается ими.

Экспериментальный пример 1. Основа способа для индукции, уход и массовое прорастание ростков, дающих микроклубеньки свободного от вируса картофеля.

В качестве экспериментального материала используют свободный от вируса картофель сорта "Супериор", который получают от Horticultural Experiment Station of the Rural Development Administration. Его очищают промывкой в проточной воде из крана, замачивают в 70% этиловом спирте в течение 3 минут, поверхность стерилизуют 20 Клороксом (промышленный) в течение 10 минут и в конце концов высевают в квадратные горшки, содержащие автоклавированную почву (вермикулит перлит 1:1). Приблизительно через неделю начинается прорастание клубеньков, которое наблюдается в камере для роста в режиме 16-часового светового дня при постоянной температуре культивирования (25^oC).

Через две недели, когда ростки вырастут в среднем до длины 5 10 см, точки роста (1 2 см длины) срезают и используют в качестве базового материала для культивирования точек роста. Срезанные ростки промывают стерилизованной дистиллированной водой 3 раза, замачивают в 70 этиловом спирте в течение 30 секунд, поверхность стерилизуют 10 Клороксом в течение 10 минут и высевают в конце концов на жидкой или твердой средах специфической формулы (см. таблицы 1, 2) для индукции и разрастания ростков, дающих микроклубеньки.

Условия окружающей среды камер для роста были в это время идентичны условиям прорастания материнского клубня. Через неделю после высевания при этих же самых внешних условиях культивирования пазушные ростки начинают появляться и в большинстве случаях через 3 4 недели они растут так быстро, как это требуется для субкультуры. В то же самое время применяют технику размножения отводками для того, чтобы стимулировать максимально индукцию пазушных ростков, но в случае сосудов или испытательных трубок техника требует так много искусности, что в этом эксперименте ростки культивируют в плоских чашках Петри (диаметр 10 см, высота 1,5 см), получая таким образом in vitro размножение автоматически, приводящее в результате к значительному увеличению числа пазушных ростков (см. таблицу 3). В общем, скорость роста ростков в жидкой питательной среде для культивирования превосходила скорость роста ростков в твердой питательной среде. Но когда субкультуры оставались в течение длительного периода в жидкой питательной среде, часто происходила дегенерация или остекловывание ростков, обусловленное избыточной абсорбцией влаги, препятствуя нормальному росту ростков картофеля in vitro. В результате, используют на начальной стадии только жидкие питательные среды и затем применяют главным образом твердые питательные среды.

Отмечается, что дело в том, что не все ростки, размноженные на искусственных средах для культивирования, способны образовывать микроклубеньки при переносе на следующую стадию для формирования микроклубеньков, но только ростки с уникальными признаками, другими словами, со слабо удлиненными междоузлиями с не имеющими стебля листьями, с сильными корнями и особенно ростки с почками на концах побегов (см. фиг. 1), способны образовывать микроклубеньки в больших количествах (см. таблицу 5). Следовательно, мы назвали ростки с такими специфическими признаками, как "ростки микроклубеньков" и их зарегистрировали и депонировали в Korean Type Culture Sollection в качестве патентованных линий растительных клеток ("Супериор", патентованная линия клеток N 8445 р). Такие ростки, дающие микроклубеньки картофеля, образуются исключительно на индукционных средах для образования микроклубеньков специфического состава и, будучи однажды сформированы, они сохраняют свои характеристики даже после по меньшей мере 24-разового последовательного культивирования в год.

Экспериментальный пример 2. Способ массового производства микроклубеньков картофеля.

Ростки микроклубеньков в стадии быстрого размножения, проиллюстрированные в экспериментальном примере 1, были сначала перенесены в высокотемпературный сосуд для роста (30^oC) (другие условия культивирования идентичны с вышеупомянутыми средами быстрого размножения ростков микроклубеньков) на неделю и затем были передвинуты в низкотемпературную (10^oC) камеру роста в полную темноту в течение другой недели. После низкотемпературной обработки ростки микроклубеньков были засеяны на индукционные среды для образования микроклубеньков (см. таблицы 2 и 4), плотно заплавлены парафином и культивированы в камере роста, в которой дневную температуру поддерживали при 20^oC и температуру в ночное время поддерживали при 12^oC, в то время как фотопериод составлял 6 часов света и 18 часов темноты. Интенсивность света составляла около 500 люкс. Для того, чтобы использовать полностью пространство камеры роста, мы штабелировали чашки Петри настолько, насколько это было возможно. В большинстве случаев после примерно 10 дней их переносили в такие условия для индукции микроклубеньков, что начинали формироваться микроклубеньки картофеля и после от 40 до 50 дней периода культивирования образовывались микроклубеньки, такие маленькие, как соевые бобы, в количестве более чем 10 штук в среднем на чашку Петри. (см. фиг. 2).

При росте добавляют к средам культивирования ингибитор роста, такой как фосфон D, Amo 1618, В-905 (N-диметил-аминополуамид янтарной кислоты) и Хлор Холин Хлорид (ХХХ) при концентрации 50 ппм. Эффективность производства микроклубеньков значительно увеличивается.

В случае сорта "Супериор" было проведено сравнительное изучение относительно эффективности производства на единицу пространства культивирования одним сосудом, которое показало различие результатов между традиционным способом культивирования в сосуде с жидкой питательной средой с использованием немикроклубеньковых ростков и способом культивирования на твердой питательной среде в чашке Петри с использованием дающих микроклубеньки ростков, развитым в этом изобретении, включая все другие обработки для увеличения скорости индукции микроклубеньков. И результаты представлены в таблице 6 и таблице 7.

Экспериментальный пример 3. Способ длительного хранения микроклубеньков картофеля и способы ингибирования и стимулирования прорастания во время хранения.

Микроклубеньки сорта "Супериор", полученные количественно в чашках Петри, стерильно собирают, промывают стерилизованной дистиллированной водой 3 и 4 раза, очищая таким образом от сред культивирования, оставшихся на поверхности. Затем их раскладывают и сушат внутри чистого стеллажа до тех пор, пока влага полностью не удалится с поверхности. После высушивания микроклубеньки помещают в пустые стерильные чашки Петри и плотно закрывают тремя слоями парафинированной пленки и выдерживают в холодильнике при низкой температуре 4^oC (см. фиг. 3). После примерно 2 месяцев выдержки в холодильнике покой нарушают и затем проращивают с легкостью, оставляя при комнатной температуре или в течение двух недель или около этого при необходимости (см. таблицу 8). Когда требуется сохранить их в течение длительного времени без проращивания, их предварительно обрабатывают раствором абсцизовой кислоты 5 мг/л в течение 3 часов до окончательного хранения при низкой температуре. Таким путем возможно сохранить микроклубеньки в здоровых условиях в течение более года, пока не подтвердится, что потеряна способность к прорастанию или нанесен вред (см. таблицу 9). Когда требуется получить прорастание вскоре после сбора урожая, легкое прорастание оказывается возможным способом нарушения покоя посредством обработки гиббереллиновой кислотой или наряду с обработкой на теплой водяной бане при температуре 38^oC до обработки гиббереллиновой кислотой (см. таблицу 8). Этот вид обработок гиббереллином и высокой температурой был также использован для сокращения периода, требуемого для прорастания в случае микроклубеньков, покой которых уже нарушен (см. таблицу 10).

Экспериментальный пример 4. Тест на выход микроклубеньков картофеля сорта "Супериор".

Мы провели контрольный эксперимент, чтобы сравнить урожай, выращенный с помощью натурального сменного картофеля, с урожаем, выращенным с помощью микроклубеньков картофеля. Когда длина побегов прорастающих микроклубеньков достигала 2 3 мм длины после обработки для прорастания, как описано в экспериментальном примере 3, микроклубеньки высаживали непосредственно в почву. На ранней стадии рост микроклубеньков был довольно слабым по сравнению с ростом натурального сменного картофеля, но после средней стадии они обнаруживали очень быстрый рост и ко времени сбора урожая, через 3 месяца после посадки, микроклубеньки над почвой выросли на две трети выше, чем натуральный семенной картофель. Конечный выход на растение также показывает примерно то же самое отношение, как скорость роста над почвой. Растение, полученное из микроклубеньков, производит примерно 507 г картофеля на растение, в то время как натуральный семенной картофель приблизительно 812 г на растение (см. таблицу 11 на фиг. 4 и фиг. 5). Другими словами, средний выход микроклубеньков картофеля достигал около 60 70% от натурального семенного картофеля, если их высаживали тем же самым способом, как и натуральный семенной картофель. Однако поскольку растения, полученные из микроклубеньков, были много меньше, чем растения, полученные из натурального семенного картофеля, то, по-видимому, возможна более плотная посадка для того, чтобы увеличить выход на акр.