способ разделения аминокислот в биологических жидкостях

Формула изобретения

Способ разделения аминокислот в биологических жидкостях с помощью тонкослойной хроматографии, включающий нанесение пробы и стандартной смеси аминокислот на пластинку с силикагелем, помещение пластины в хроматографическую камеру с водно-органической системой растворителей, детектирование аминокислот нингидриновым реагентом и идентификация аминокислот путем сравнения полученной хроматограммы анализируемой смеси аминокислот с хроматограммой стандартной смеси аминокислот, отличающийся тем, что разделение аминокислот проводят одновременно на двух пластинах, помещенных в две камеры, в одной из которых для разделения аминокислот с коэффициентом подвижности 0,3 используют систему растворителей при следующем соотношении компонентов по объему: пропанол: водный раствор аммиака (24 25%) вода 3,3 4,1 0,9 1,5 7,5 9,0, а в другой для разделения аминокислот с коэффициентом подвижности > 0,3 используют систему растворителей при следующем соотношении компонентов по объему: хлороформ: этанол: уксусная кислота: вода 52,5 54,0 26,0 27,5 8,9 9,6 3,5 4,2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к тонкослойной хроматографии аминокислот, присутствующих в биологических жидкостях.

Изобретение может найти применение при анализе чистоты аминокислот, производимых в промышленности, и в медицине, в частности для дифференциальной диагностики наследованных дефектов обмена веществ (фенилкетонурии и других аминоацидурий).

Для разделения аминокислот биологических жидкостей используются различные хроматографические (газовая, тонкослойная (ТСХ), высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ), бумажная хроматография) и электрофоретические методы [1] При этом наиболее широко применяются ТСХ и ВЭЖХ. Последний метод превосходит ТСХ по разрешающей способности, однако его аппаратурное оформление сложно, крайне дорого, кроме того, процесс разделения требует растворителей высшей степени очистки. Достоинствами метода ТСХ являются простота, отсутствие дорогостоящего оборудования, а значит, доступность для массового потребителя, и высокая скорость анализа. Тем более, что разработанные в последнее десятилетие новые неподвижные фазы, оборудование для нанесения проб, новые методы элюирования пластинок и количественного определения с использованием сканирующих денситометров способны обеспечить более низкое разрешение, лучшее детектирование и воспроизводимость результатов качественного и количественного хроматографического анализа (ТСХ) аминокислот [2]

Принципиальным моментом для проведения ТСХ любых объектов, в том числе и аминокислот, является выбор сорбирующего слоя, наносимого на подложку, и хроматографической системы растворителей. Для всего спектра аминокислот крови и мочи до сих пор не подобраны универсальные условия разделения (сорбент-система растворителей). Это связано с тем, что сам объект - аминокислоты биологической жидкости условно распадается на две группы с низкими (до 0,3) и высокими (0,3 1) значениями коэффициента подвижности R_f (коэффициэнт подвижности отношение скорости миграции данной аминокислоты к скорости миграции фронта растворителя) [3] Тем не менее известны попытки решения комплексного одновременного разделения не всего спектра, а пока лишь 20 основных аминокислот биологических жидкостей. Так, известен способ разделения аминокислот в биологических жидкостях с помощью ТСХ крови или мочи на пластинах "Фиксион" со слоем ионообменной смолы дауекс (Венгрия) при использовании двух буферных систем с pH 3,30 и pH 4,25 (состав буфера: C₆H₈O₇ x H₂O, NaOH, NaCl, 37% HCl, H₂O) [3] Перед разделением пластинки уравновешивают цитратным буфером pH 3, 28. Разделение аминокислот протекает за 2 часа при 45^oC. Окрашивание хроматограмм (детектирование) производят распылением нингидринового реактива из пульверизатора. Известный способ позволяет разделить аминокислоты с R_f 0,163, R_f 0,4 и выявить гомоцистин и метионин с промежуточными значениями R_f. Способ трудоемок и недостаточно эффективен. Кроме того, каждую новую партию пластинок "Фиксион" необходимо проверять на стандартной смеси аминокислот, так как не все партии этих пластинок дают удовлетворительное разделение.

Известен способ разделения основных аминокислот в биологических жидкостях с помощью ТСХ на пластинах "Силуфол" (ЧССР) и фирмы Merck (Германия) со слоем более эффективного, чем ионообменная смолы, сорбента силикагеля. Для разделения используют систему растворителей: н-бутанол ледяная уксусная кислота вода в соотношении 3:1:1 (по объему). Разделение аминокислот протекает за 2 часа при комнатной температуре. Детектирование производят погружением пластины в нингидриновый реактив. Окраска развивается в темноте в течение 2 часов. Способ позволяет разделить аминокислоты с R_f 0,13 и R_f 0,4. Аминокислоты с промежуточными значениями Rf не поддаются интерпретации известным способом из-за перегруженности этой области аминокислотами и неэффективности данной системы растворителей для их разделения. Известен способ менее трудоемок, чем описанный выше аналог, и рекомендован в качестве экспресс-метода анализа аминокислот биологических жидкостей, однако только для предварительной диагностики заболеваний. При выявлении аномалий в крови или моче известным способом приходится подтверждать результаты анализа с помощью дополнительных методик определения конкретных аминокислот.

Таким образом, проблема комплексного одновременного анализа аминокислот биологических жидкостей до сих пор не решена.

Задачей заявленного изобретения является разработка комплексного экспресс-метода разделения основных аминокислот в биологических жидкостях.

Поставленная задача решается способом разделения аминокислот в биологических жидкостях с помощью тонкослойной хроматографии биологической жидкости на пластинах со слоем силикагеля с использованием двух систем растворителей: пропиловый спирт 24 25 водный раствор аммиака вода в соотношении (3,3 4,1): (0,9 1,5):(7,5 9,0) по объему для разделения аминокислот с коэффициентом 0,3 и хлороформ этанол уксусная кислота вода в соотношении (52,5 54,0):(26,0 27,5):(8,9 9,6):(3,5 - 4,2) для разделения аминокислот с коэффициентом подвижности > 0,3. Окрашивание разделенных аминокислот проводится нингидриновым реактивом.

Пример.

Для анализа аминокислот могут быть использованы пластины со слоем силикагеля фирмы Merck, "Силуфол" и "Сорбфил" (Россия) [3] размером 10 x 10 или 10 x 15 см.

Для идентификации аминокислот приготавливают растворы стандартных аминокислот в 25% этаноле в концентрации 1 мг/мл.

Образцы стандартных аминокислот и биологических жидкостей наносят на стартовую линию, проведенную карандашом на расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки, полосками шириной 1 мм, отстоящими друг от друга на 10 мм. Нанесение образцов осуществляется капиллярами V = 1л с использованием микрокапа или микрошприца.

Хроматографию осуществляют восходящим способом одновременно в двух хроматографических камерах 130 x 130 x 50 мм. Камеры для тонкослойной хроматографии предварительно заряжают системой растворителей и насыщают в течение 12 16 ч под плотно притертой крышкой. Для разделения аминокислот используют 2 системы растворителей: в 1-ой камере пропиловый спирт 25% водный раствор аммиака вода в соотношении 3,5:1,2:8,5, во 2-ой камере хлороформ этанол уксусная кислота вода в соотношении 53,0:26,8:9,3:3,8. Время ТСХ 1 ч 20 мин. После хроматографии пластины высушивают на воздухе и окрашивают нингидриновым реактивом при помощи пульверизатора или методом окунания. Состав нингидринового реактива: 100 мг нингидрина, 100 мл ацетона, 1 мл ледяной уксусной кислоты. Проявление окраски происходит в термостате при 45^oC (5 мин).

Интерпретацию результатов разделения аминокислот биологической жидкости пациентов по хроматограммам проводят по методике, описанной в [3] сравнением с хроматограммой, полученной на стандартной смеси аминокислот или при анализе биологической жидкости здорового человека. Полуколичественный или количественный анализ биологической жидкости на аминокислоты проводят с помощью сканирующего денситометра.

Реализация заявленного интервала соотношений ингредиентов систем растворителей (включая граничные) приводит к эффективному разделение аминокислот биологических жидкостей. На хроматограммах сохраняется порядок расположения аминокислот.

Даже незначительный выход за рамки заявленного соотношения ингредиентов двух систем растворителей и концентрации раствора аммиака приводит к резкому снижению эффективности разделения. Вид получающихся хроматограмм наглядно иллюстрирует преимущество заявляемого способа способность разделить аминокислоты с Rf 0,3 и R_f > 0,3 (в способе-прототипе аминокислоты с промежуточными значениями R_f (0,13 0,4) не удается разделить). Эффективность разделения аминокислот в случае заявляемого изобретения выше. Следует подчеркнуть, что разделение аминокислот с помощью заявляемого способа протекает значительно быстро (за 1 ч 20 мин), чем в способе-прототипе (2 ч). Кроме того, предлагаемые системы растворителей могут быть использованы при ТСХ на пластинках со слоем силикагеля разных фирм (Merch, "Силуфол", "Сорбфил"), т. к. универсальны для разделения аминокислот на силикагеле.