способ получения инактивированной вакцины для профилактики венесуэльского энцефаломиэлита

Формула изобретения

Способ получения инактивированной вакцины для профилактики венесуэльского энцефаломиелита, предусматривающий заражение клеток куриных фибробластов штаммом вируса венесуэльского энцефаломиелита, культивирование вируса, концентрирование и очистку вибрионов, инактивацию вируса формалином, сорбцию на гидроокиси алюминия в присутствии человеческого альбумина, отличающийся тем, что из штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита используют штамм вируса Venezuelan eguine encephalomyelitis СМ-27 ГКВ N 684, а заражение клеток куриных фибробластов осуществляют при множественности заражения 0,001 0,005 БОЭ/клетка, культивируют вирус до начала разрушения клеток фибробластов, инактивацию вируса осуществляют перед его концентрированием и очисткой, а концентрирование и очистку вируса проводят путем дифференциального и зонального ультрацентрифугирования.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к специфической профилактике вирусных инфекций. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) распространен в Центральной и Южной Америке. Передается комарами. Вызывает эпизоотии у лошадей. Поражает человека и служит причиной спорадических случаев и эпидемических вспышек. Чрезвычайно контагиозен в условиях аэрогенного заражения. В силу этого опасен для лабораторного персонала.

Качество убитых вакцин определяется свойствами производственного штамма. Как правило, вакцины из патогенных штаммов характеризуются значительной протективной активностью, а вакцины из аттенуированных штаммов обладают относительно низкой иммуногенностью. Несмотря на то, что использование аттенуированных штаммов может отрицательно сказаться на активности препаратов, убитые вакцины против венесуэльского энцефаломиелита готовят не из патогенных, а из аттенуированных штаммов.

Отказ от использования патогенных штаммов обусловлен двумя причинами. Во-первых, их применение требует организации сложных мер безопасности и удорожает производство. Во-первых, вакцины из патогенных штаммов не надежны по критерию специфической безопасности. Вирус ВЭЛ плохо инактивируется формалином в условиях, при которых не происходит разрушения вирусного антигена. Это оставляет возможность для сохранения остаточной инфекционности, не выявляемой при биоконтроле. В истории вакцинопрофилактики ВЭЛ известны случаи заболеваний людей, привитых убитой вакциной из патогенных штаммов. В производстве убитых вакцин надежней использовать аттенуированные штаммы, утратившие вирулентность для человека. Это повышает гарантию безопасности прививок и предотвращает трагедию, вызванную иммунизацией недостаточно проконтролированной вакциной. Для ВЭЛ последний фактор приобретает особо важное значение ввиду высокой вирулентности и контагиозности возбудителя для человека.

В зарубежной практике используется аттенуированный штамм ТС-83 (Berge T. O. Banks I.S. Tigertt W.D Attenuation of Venezuelan equine encephalomyelitis virus by an in vitro cultivation in guinea-pig heart cells. // Americ.J. of Hygiene. 1961. N 73. P.209-218). Bak ha первого поколения представляет собой вируссодержащего культуральную жидкость, инактивированную формалином (Cole F. E. May S. W. Eddy G.A.Inactivated Venezuelan equine encephalomyelitis vaccine prepared from attenuated (T.C83 strain) virus. // Appl.Microbiol-1974. N 27.-P.150-153). При приготовлении вакцины второго поколения вирус, содержащийся в культурной жидкости, концентрируют и очищают в условиях проточного ультрацентрифугирования (Foster N.M. Barber T.L. Walton T.E.Venezuelan equine encephalomyelitis virus: concentration, partial purification, inactivation and immunogenity. // Comp. Immunol. Microbiol.-1983. N 1. P. 31-37).

Известны три аттенуированных штамма вируса ВЭЛ, депонированные в Государственную коллекцию вирусов, штамм 2621 и штамм ТС-83. Эти штаммы характеризуются рядом недостатков, которые ограничивают возможность их применения в вакцинном производстве. К наиболее существенным недостаткам аттенуированных штаммов относятся невысокая иммуногенность, низкая репродуктивная активность и остаточная нейровирулентность. Невысокая иммуногенность вируса отрицательно сказывается на протективной активности вакцины. Низкая репродуктивная активность усложняет накопление вирусной биомассы и удорожает производство, а остаточная нейровирулентность оставляет возможность для заражения персонала и делает вакцину ненадежной по критерию специфической безопасности.

Целью изобретения является способ получение инактивированной вакцины для профилактики венесуэльского энцефаломиелита из аттенуированного штамма вируса ВЭЛ, который несмотря на существенное ослабление нейровирулентности сохраняет высокую иммуногенность и репродуктивную активность.

Поставленная цель достигается путем создания вакцины на основе оригинального аттенуирования штамма вируса ВЭЛ СМ-27. Аттенуированный штамм Virus Vepezuelen equine encephalomyelitis СМ-27 получен из высокопатогенного штамма Тринидад методами популяционной генетики. Ослабление патогенности достигнуто путем последовательных температурных скачков при культивировании вируса и последующего клонирования из бляшки в бляшку. Репродуктивная активность полученного таким образом мелкобляшечного аттенуирования клона увеличена в условиях заражения агрегированным вирусом и отбора среднебляшечного вируса.

При серологической идентификации штамма вируса ВЭЛ СМ -27 в реакции торможения гемагглютинации и реакции нейтрализации с набором иммунных сывороток и асцитических жидкостей к различным штаммах вируса ВЭЛ показана его тесная антигенная связь со штаммом "Тринидад" и его аттенуироанным дериватами ТС-83, 230 и 2621, а также принадлежность к подтипу 1А антигенного комплекса вируса ВЭЛ.

Штамм вируса ВЭЛ СМ-27 хранится в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, в Государственной коллекции вирусов под регистрационным номером ГКВ-684. Штамм характеризуется стабильным проявлением биологических генетических признаков.

Репродуктивная активность.

Размножение штамма вируса ВЭЛ СМ-27 происходит во многих первичных и перевиваемых культурах клеток различной видовой принадлежности (почки обезьяны, эмбриона человека, куриных эмбрионов, ВНК-21, VERO,Hela и т.д.). В большинстве культур, за исключением клеток членистоногих, взаимодействие вируса с клетками протекает в форме острой инфекции и заканчивается деструкцией клеток. Накопление вируса достигает 9,5-11,0 lg ТЦД₅₀/мл. Под агаровым покрытием вирус формирует бляшки и характеризуется среднебляшечным фенотипом. В производственных условиях (роллерное культивирование в культурах клеток куриных фибробластов, невысокая заражающая доза, порядка 0,001-0,005 БОЕ на клетку и ранний сбор вируссодержащего материала до развития цитодеструктивных изменений) накопление вируса составляет 10,0-10,5 lg БОЕ/кл. Это обеспечивает выход вирусной биомассы 4,1-7,2 мг на 1 л вируссодержащей культуральной жидкости.

Остаточная нейровирулентность.

Штамм СМ-27 характеризуется высокой степенью аттенуации для лабораторных животных. Восприимчивость к вирусу различных видов животных зависит от их возраста и способа ведения. У мышей-сосунков штамм СМ-27 при любом способе ведения вызывает летальный энцефалит. У мышей массой 7-8 г летальный исход наблюдается лишь при интрацеребральном введении массивных доз вируса. Для мышей более старшего возраста штамм СМ-27 апатогенен при любом способе введения.

При периферическом заражении сибирских хомячков штамм СМ-27 вирулентен для животных массой не более чем 25-35 г, а при интрацеребральном введении - 40-45 г. При любом способе введения вирус не вызывает клинических проявлений инфекции у молодых, но половозрелых морских свинок, белых крыс и кроликов. При периферийном заражении белых мышей массой 8-9 г и сибирских хомячков массой 40-45 г штамм СМ-27 размножается во внутренних органах (печень, селезенка), но не проникает в ЦНС. Об этом свидетельствуют отрицательные результаты выделения вируса из мозга и отсутствие гистопатологических изменений в ЦНС.

Подкожное заражение зеленых мартышек штаммом СМ-27 не влечет за собой развития клинических проявлений заболевания, но приводит к выработке антител. В мозгу животных вирус не выявляется. При внутримозговом заражении зеленых мартышек в теменной бугор на месте введения отмечается умеренно выраженная воспалительная реакция. Инфильтраты представляют собой поле глиальной инфильтрации, в зоне которых отсутствуют нейроны. Паталогический процесс не распространяется на другие отделы головного мозга и в спинной мозг.

Иммуногенные свойства.

Двухкратная внутрибрюшинная иммунизация с интервалом 24 ч белых мышей массой 9-10 г инактивированным формалином, а затем концентрированным и очищенным штаммом СМ-27 создает резистентность к последующему периферическому заражению вирулентным вирусом. Степень резистентности оценивают качественно по способности вирусных концентратов создавать защиту от значительных доз вируса и количественно в условиях иммунизации животных убывающими двухкратными разведениями препарата и последующего разрешения небольшой постоянной дозой вируса, порядка 100-300 ЛД₅₀. В последнем случае вычисляют минимальную иммунизирующую дозу (МИД₅₀), т.е. наименьшее количество вируса в мл препарата или в мкг вирусного белка, защищающее 50% животных от инфекции вирулентным вирусом. Введение 2,5-3,0 мкг препарата (на особь) создает абсолютную резистентность и предохраняет животных от заражения максимально возможной дозой вирулентного штамма, порядка 8,5-9,0 lg. Количественные показатели резистентности, выраженные МИД₅₀, составляют 0,006-0,007 мл и 0,15-0,30 мкг.

Генетическая стабильность.

В процессе серийных пассажей в культурах клеток куриных эмбрионов в условиях заражения клеток небольшими дозами (0,001-0,005 БОЕ на клетку) штамм СМ-27 сохраняет основные биологические и генетические свойства, включая репродуктивный потенциал, степень остаточной нейровирулентности, бляшечный фенотип, антигенную и иммуногенную активность.

Как следует из табл. 1, по признакам, существенным для вакцинного производства, штамм СМ-27 превосходит аттенуированные штаммы 230, 2621 и ТС-83. Иммуногенность штаммов 230 и 2621 существенно отстает от протективной активности штамма СМ-27. Штамм ТС-83 приближается по этому показателю к штамму СМ-27, что делает возможным его использование для приготовления убитой вакцины. Однако применение штамма ТС-83 в производстве экономически невыгодно ввиду относительно низкой продуктивности вируса, снижающей выход вирусной биомассы. Тоже самое можно сказать про штаммы 230 и 2621. Препятствием для применения штамма ТС -83 в производстве служит также значительный уровень остаточной нейровирулентности для обезьян, что указывает на определенный риск заражения для персонала и снижает безопасность прививок в случае неполной инактивации вируса. Наиболее подходящим по этому показателю является штамм СМ -27, практически полностью утративший нейровирулентность для обезьян при прямом заражении в головной мозг.

Приготовление вакцины.

Препарат готовят при помощи вирусологических, биохимических и молекулярно-биологических методов, которые в своей совокупности обеспечивают положительный эффект в виде получения вакцины с высокими медико-биологическими показателями. Вирус выращивают в роллерных культурах куриных фибробластов. Прибегают к заражению клеток небольшими дозами вируса (0,001-0,005 БОЕ на клетку) и раннему сбору вируссодержащей культурной жидкости (через 18 ч после заражения). В этих условиях вируссодержащий материал мало загрязняется клеточным детритом, что облегчает концентрацию и очистку вируса. В производстве урожай вируса составляет 10,0-10,5 lg БОЕ/мл. Это обеспечивает выход вирусной биомассы 4,1-7,2 мг на 1 л вируссодержащей культуральной жидкости. Затем вирус инактивирует формалином (0,005% 72 ч) и прогреванием (32^oC). Это увеличивает его устойчивость в процессе последующей концентрации и очистки. Концентрацию и очистку проводят при помощи дифференциального, а также зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Вакцина представляет собой концентрационную и очищенную взвесь виринов (40-55 мкг/мл), суспензированную в солевом растворе (0,14-0,15 NaCl), забуференном трис-буфером (0,01 -0,013 M) pH 7,8-7,9 и содержащим 0,04-0,05% альбумина человека. Препарат сорбирован на гидрате окиси алюминия (1 -2 мг/мл). Вакцина безвредна, ареактогенна и атоксична. Минимальная иммунизирующая доза препарата для белых мышей не превышает 0,01 мл.

Пример 1. Определяли иммуногенность экспериментально производственных серий культуральной вакцины венесуэльского энцефаломиелита концентрированной, очищенной убитой сорбированной, приготовленной из штамма СМ-27. Как следует из табл. 2, использование этого штамма в экспериментальном производстве позволяет стабильно получать препараты, обладающие значительной протективной активностью и характеризующиеся небольшим разбросом величины МИД₅₀ от серии к серии.

Пример 2. На контингенте в 149 человек проводили Государственные испытания препарата. Вакцину вводили двукратно с интервалом 30 дней подкожно в 1 человеко-дозе на инъекцию. Сыворотки для определения антител брали на 30 сут. (перед ревакцинацией) и на 60 и 180 сут. Как следует из табл. 3, однократное введение препарата вызывает выраженную сероконверсию. Ревакцинация приводит к повышению процента привитых с антителами и увеличению напряженности иммунитета. Достигнутый уровень иммунитета и процент серопозитивных лиц сохраняются на 180 сут. после начала прививок. У вакционированных не отмечено ни местных, ни общих реакций на прививки, т.е. препарат характеризуется ареактогенностью.