способ определения микробиологической загрязненности воды

Формула изобретения

Способ определения микробиологической загрязненности воды путем обработки пробы воды неионным детергентом, инкубации ее с 4",6-диамино-2-фенилиндолом и последующего определения флуоресценции при ультрафиолетовом возбуждении, отличающийся тем, что детерогенную обработку проводят в присутствии комплексона и при ионной силе, соответствующей концентрации NaCl выше 0,1 М, а определение интенсивности флуоресценции осуществляют при _возб= 460 5 нм, и в случае превышения более чем на 20 определяемой интенсивности флуоресценции над контролем, получаемым путем аналогичной обработки пробы дистилированной воды, микробиологическую загрязненность воды оценивают как эпидемиологически опасную.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для детергентной обработки используют раствор 0,05-ного тритона Х-100, содержащего 0,1 моль Na₂ЕДТА и 2 моль NaCl при рН 7,8 8,2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологической медицине и экологии и может найти применение при оценке санитарного состояния водоемов, их пригодности для использования в качестве источника водозабора, а также для мониторинга процесса очистки питьевой воды.

Для характеристики санитарно-гигиенического состояния водоемов первостепенное значение имеет степень их микробиологической загрязнения, а также выявление в них патогенных микроорганизмов и возбудителей паразитарных заболеваний. Это обусловлено тем, что инфекционная диаррея является ведущей причиной заболеваемости населения и детской смертности. В связи с этим выявление загрязнения водных объектов микроорганизмами играет важную роль в определении степени экологического неблагополучия региона. Причем такая оценка необходима, в первую очередь, для источников водозабора, а также для контроля процесса питьевой воды.

Вместе с тем, нередко возникает необходимость в экспрессной оценке санитарно-гигиенического состояния водоема, главным образом, в случае чрезвычайных ситуаций и экологических бедствий. Это требует определения микробиологической загрязненности непосредственно на месте происшествия. Однако, нам не известен метод, который позволял бы в полевых условиях в течение нескольких минут дать оценку санитарного состояния водоема.

В настоящее время, для определения основного показателя микробиологической загрязненности воды считается достаточным показать, что исследуемый образец воды содержит бактерии, известные как специфические обитатели кишечного тракта, даже если они не являются прямыми возбудителями заболеваний, а в очаге эпидемии важен контроль общей микробиологической загрязненности воды. Бактериями, чаще всего служащими индикаторами таких загрязнений, являются Escherichia coli. Большая часть известных и обычно используемых для этого методов включает посев, инкубацию при 37^o или 44^oC и последующий подсчет числа колоний через 24 49 ч. [1] Основным недостатком этих методов является их длительность (1 2 суток) и непригодность для экспрессной оценки санитарно-гигиенического состояния водоема в чрезвычайных ситуациях.

Известны методы, включающие использование флуоресцентной индикации для определения -D-галактозидазы фермента E.coli, который гидролизует 4-метилумбеллиферил b -D-галактозид. Это позволяет сократить время обнаружения E. coli до 1,5 1,5 ч. [2] Однако эти методы непригодны для оценки загрязненности водоемов патогенными бактериями, которые не имеют этого фермента (например, Vibro cholerae), и вирусами, то есть не годятся для объективной оценки загрязненности воды.

Известны достаточно быстрые и чувствительные способы обнаружения бактерий в воде, но выполнение их связано с использованием достаточно сложного оборудования, в частности проточного цитометра [3] Способ состоит в том, что анализируемый образец, содержащий микроорганизмы, смешивается с параформальдегидом (0,5% конечная концентрация) выдерживается в течение 15 - 20 мин и находится в жидком азоте до проведения цитометрического анализа. Клетки окрашиваются ДНК-специфичным флуоресцентным красителем - 4",6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ) и затем с помощью проточного цитометра производится подсчет бактерий. Распределение клеток в соответствии с количеством содержащейся в них ДНК регистрируется в памяти компьютера этого цитометра. С помощью специальной программы компьютера подсчет количества клеток выражается как процент к стандарту (шарики диаметром 1 мкм), который добавлялся в анализируемый образец. В пределах 30 мин может быть определено число бактерий в воде в концентрации порядка 25 кл/мл. Авторы полагают, что предел определения может быть 10 бактерий/мл. Такой метод является достаточно быстрым (около 30 мин) и чувствительным, но безусловно стационарным. Так, использование в проточном цитометре в качестве источника возбуждения флуорохрома ртутной дуговой лампы (или лазера в других конструкциях приборов) требует достаточно мощного источника измерения. Проточные цитометры являются стационарным и достаточно сложным лабораторным оборудованием; из доступной литературы нам не известно их применение в полевых условиях.

Наиболее близким к способу является метод оценки микробиологической загрязненности воды с помощью определения числа бактерий, удерживающихся на поликарбонатных фильтрах после обработки их неионным детергентом и окраски ДАФИ, путем подсчета количества люминесцирующих частиц, возбужденных УФ-освещением, с помощью эпифлуоресцентной микроскопии [4] Этот способ взят нами в качестве прототипа. Он позволяет выявить микроорганизмы в воде в течение 2 часов в концентрациях порядка 2000 кл/мл. Вместе с тем, этот способ как и вышеописанный требует стационарных условий и не может быть использован в полевых условиях, а также как экспрессный в случае чрезвычайных ситуаций.

Технический результат настоящего изобретения состоит в сокращении времени оценки микробиологического загрязнения воды при сохранении высокой чувствительности определения микроорганизмов.

Этот результат достигается тем, что в известном способе оценки микробиологической загрязненности воды путем обработки пробы воды неионным детергентом, инкубации ее с ДАФИ и последующего ультрафиолетового освещения, согласно изобретению, детергентную обработку проводят в присутствии комплексона и ионной силе, соответствующей концентрации NaCl более 0,1 М, ультрафиолетовое возбуждение выполняют при l_возб= 3605 нм , а интенсивность флуоресценции определяют при _фл = 4605 нм, и, при превышении ее над контролем, получаемым путем аналогичной обработки пробы дистиллированной воды, более, чем на 20% микробиологическую загрязненность оценивают как эпидемиологически опасную.

Целесообразно в качестве раствора для детергентной обработки использовать раствор 0,05% тритона X-100, содержащего 0,1 М Na₂EDTA и 2 М NaCl при pH 7,8 8,2.

Проведение обработки неионным детергентом в присутствии комплексона при высокой ионной силе позволяет в течение 3 5 мин солюбилизировать мембраны бактерий и тем самым обеспечить беспрепятственный доступ флуорохрома (ДАФИ) к содержащейся в микроорганизмах ДНК. Это дает возможность быстро связываться флуоресцирующему лиганду с субстратом, а так как содержание ДНК в пробах пропорционально связано с содержанием в ней микроорганизмов, то благодаря этому стало возможным быстрое количественное флуориметрическое определение числа бактерий в пробе. Определение флуоресценции осуществляется при _возб= 3605 нм и _фл = 4605 нм, поскольку эти длины волн соответствуют максимумам возбуждения и флуоресценции ДАФИ. Использование последнего в качестве красителя дает возможность определить искомую величину концентрацию ДНК, а следовательно количество бактерий в пробе, как нами показано, с наименьшей погрешностью.

Проведение аналогичного измерения с дистиллированной водой позволяет учесть различные температурные режимы и качество реактивов, используемых при измерении пробы.

Вся эта процедура требует нескольких минут, что сокращает весь способ измерения и делает весь метод пригодным для экспрессной оценки. Кроме того, предлагаемая нами обработка неионным детергентом в присутствии комплексона при высокой ионной силе позволила достоверно определить, как нами показано, концентрацию микроорганизмов в диапазоне, начиная уже от 20 кл/мл. Это обеспечивает достаточно высокую чувствительность метода, так как значение коли-индекса 50 кл/мл является критерием экологического бедствия для поверхностных вод, служащих источниками централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, независимо от наличия или отсутствия полного комплекса очистных сооружений, а значение коли-индекса 25 кл/мл - критерием чрезвычайной экологической ситуации для тех же объектов при наличии полного комплекса очистных сооружений.

Использование в качестве лизирующей смеси раствора, содержащего 0,5% тритона X-100, 0,1 М Na₂EDTA в 2 М NaCl при pH 7,8 8,2, известно для клеток млекопитающих, но для количественного определения ДНК бактерий она ранее не применялась. Вместе с тем, использование лизирующей смеси, включающей ионные детергенты, не обеспечивает количественного определения ДНК микроорганизмов, а также приводит к увеличению коэффициента вариации измеряемого параметра.

Сущность метода заключается в следующем. К 1,0 мл образца воды из исследуемого водоема добавляют детергент (лизирующую смесь), а затем через 3 - 5 минут буферный раствор, содержащий краситель ДАФИ при pH 7,4. После этого производят измерение интенсивности флуоресценции (1) приготовленной пробы при _возб= 360 нм и _фл=460 нм. Кроме того, определяют интенсивность флуоресценции (I₀) раствора, приготавливаемого аналогичным способом, но где вместо образца с суспензией клеток используют 1,0 мл дистиллированной воды. По полученному значению I = I-I₀, исходя из построенной калибровочной кривой с использованием E. coli в качестве объекта измерения, определяют содержание микроорганизмов в исследуемом образце и делают вывод о степени санитарно-эпидемиологической опасности источника, из которого был взят данный образец.

Сущность способа иллюстрируется следующим примером.

Для определения числа микроорганизмов в анализируемом образце предварительно строится калибровочная кривая с использованием известных концентраций бактерий в пробах. В качестве таких эталонных проб используют суспензии бактерий, содержащие от 0 до 10⁶ E.coli на литр, приготовленные разбавлением исходного раствора с коли-индексом 710¹¹ кл/л, который был установлен путем высева бактерий на агар и подсчета титра KOE. С помощью предлагаемой методики в этих же образцах были определены значения I = I-I₀. Полученные результаты представлены в табл.(примеры 1 7) и на графике. На чертеже представлена калибровочная кривая для определения микробиологической загрязненности воды, где по оси абсцисс-концентрация микроорганизмов в воде (кл/мл), а по оси ординат - концентрация микроорганизмов в воде (кл/мл), а по оси ординат значение превышения интенсивности флуоресценции анализируемой пробы над контролем (I/I₀= I/I₀-1) в процентах. Как следует из данных табл. для проб с коли-индексом 25 и 50 бактерий/мл, соответствующим чрезвычайной экологической ситуации и ситуации экологического бедствия, превышение интенсивности флуоресценции над фоном (I/I₀) составило 22,5% и 27,9% соответственно.

Пример 1.

К 1,0 мл воды из р. Волхов добавляли 0,05 мл лизирующей смеси (содержащей 0,5% тритон X-100, 0,1 М Na₂EDTA, 0,01 М трис, 2,0 М NaCl при pH 7,8 8,2) и через 3 мин 0,1 мл буферного раствора (содержащего 0,01 М NaCl, 0,01 М Na₂EDTA, 0,01 М трис и краситель ДАФИ в концентрации 10 мгк/мл, pH 7,4). Затем производили измерение интенсивности флуоресценции образца на спектрофлуориметре Model-850 фирмы Хитачи (Япония) при _возб= 360 нм и _фл=460 нм. В данном случае (пример 8 табл.) I 282 отн.ед. Параллельно определяли интенсивность флуоресценции раствора, приготавливаемого аналогичным способом, но где вместо образца с суспензией бактерий использовали 1,0 мл дистиллированной воды и нашли I₀ 240 отн.ед. По полученным значениям вычисляли I = I-I₀= 282-240=42 отн.ед. Исходя из этого, значение I/I₀= 42/240 100 = 17,5%, и по калибровочной кривой находим для р.Волхов концентрацию микроорганизмов 13 кл/мл. Так как критерием чрезвычайной ситуации является концентрация микроорганизмов в воде более 25 кл/мл, состояние воды в этой реке можно рассматривать как тревожное в случае использования ее в качестве источника водозабора.

По сравнению с известными способ имеет ряд существенных преимуществ.

1. Значительно сокращается время выполнения процедуры (до 10 минут), в то время как метод определения микроорганизмов на фильтрах (прототип) требует для своего выполнения не менее 2 часов. Это может быть решающим в случае чрезвычайных ситуаций. Чувствительность способа является достаточной для установления чрезвычайной экологической ситуации и ситуации экологического бедствия.

2. Метод значительно проще всех известных и при наличии портативного флуориметра может быть использован в полевых условиях.

Метод разработан в лаборатории биотестирования токсических факторов окружающей среды ЦНИРРИ МЗМП РФ, испытан на ряде штаммов микроорганизмов, и прошел апробацию при анализе воды из р.Волхов.