способ получения эукариотического полипептида

Формула изобретения

Способ получения эукариотического полипептида, включающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей структурный ген, кодирующий чужеродный полипептид, под контролем промотора, трансформацию полученной рекомбинантной ДНК штамма миеломы, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую структурный ген, под контролем вирусного или металлотионеинового промотора.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии рекомбинантной ДНК. В частности, оно касается способа экспрессии гена, кодирующего эукариотический полипептид в клетках миеломы.

За последние годы успехи, достигнутые в области биотехнологии, привели к возможности продуцирования эукариотических полипептидов в промышленных масштабах путем экспрессии соответствующих генов в клетках линии клеток хозяина. Промышленный успех таких способов зависит от эффективности, с которой может быть экспрессирован определенный ген в клетках данной линии клеток хозяина. Существует постоянная необходимость в системах экспрессии с высокой эффективностью.

Первые эксперименты по выражению гена осуществлялись с использованием бактериальных линий клеток. Однако несоответствие между такими клеточными средами и обычной средой эукариотических полипептидов приводит к некоторым нежелательным эффектам и, как правило, к низкому выходу продукта. Эти эффекты были в некоторой степени улучшены за счет использования эукариотических линий клеток, в частности линий клеток млекопитающих животных в качестве хозяев. Известны различные системы выражения линии клеток млекопитающих (смотри, например, описание патента США N4419446, Howley и др. в котором описывается трансформация фибробластных клеток мыши с помощью вектора, включающего ген, кодирующий человеческий инсулин).

Исследования, относящиеся к экспрессии иммуноглобулиновых генов, заключают в себе использование способов рекомбинантной ДНК для клонирования соответствующих генов и трансформации клеток млекопитающих клонированными генами (Morrison S. Z и QiV.J.Ann.Rev.Jmmund. 1984, т.2, стр.239 256). Линии клеток миеломы использовались в качестве хозяев, различные векторы были продуцированы для трансформации линий клеток миеломы. Эти векторы обычно несут иммуноглобулиновый промотор и ген. Векторы включают также селективные маркеры, что обеспечивает возможность отбора клеток миеломы, которые были успешно трансформированы. Маркеры включают вирусные промоторы, ускоряющие экспрессию прокариотических генов, кодирующих несекретируемые продукты, которые придают устойчивость к антибиотикам трансформированным клеткам хозяина. Продукты, которые оказывают каталитическое инактивирующее действие на антибиотики, получают в незначительных количествах.

Эти исследования показали, что линии клеток миеломы имеют очень специфическую функцию при выражении иммуноглобулиновых генов. Было показано, что в клетках миеломы могут быть продуцированы химерные иммуноглобулины мыши/человека (Morrison S.Z. и др. PNAS США, 1984, т.81, стр.6851 6588; Neuberger M.S. Nature, 1985, т.314, стр.268 270; Boulianne L.Z. Nature, 1984, т. 312, стр. 643 -646), а также могут быть продуцированы химерные полипептиды иммуноглобулин/фермент и иммуноглобулин/антиген. Во всех случаях иммуноглобулиновый промотор используется для направления экспрессии желаемого продукта, который по крайней мере частично является иммуноглобулином.

Впервые было установлено, что возможна высокая степень экспрессии эукариотических генов в линиях клеток миеломы с неиммуноглобулиновыми промоторами. Этот результат является открытием с точки зрения специфической природы клеток миеломы и известной зависимости выражения эукариотических генов от типа клеток.

Согласно изобретению предусматривается способ получения эукариотического полипептида, включающий культивирование клеток миеломы, трансформированных вектором, включающим ген, кодирующий эукариотический полипептид, и неиммуноглобулиновый промотор, так что, когда этим вектором трансформируют клетки миеломы, происходит экспрессия гена, кодирующего эукариотический пептид, направляемая неиммуноглобулиновым промотором.

Вектор, который может быть плазмидой или эписомным вектором, но который предпочтительно является интегрируемым вектором, включает селективный маркер, например маркер устойчивости. Этот маркер устойчивости может находиться около точки встраивания гетерологической кодирующей последовательности и предпочтительно находится под контролем отдельного промотора, например, промотора SV40. Ген устойчивости может быть заменен или дополнен энхансером, например геном, кодирующим дигидрофолятредуктазу (dhfr).

Промотор является предпочтительно вирусным промотором, наиболее предпочтительно промотором ретровируса, например, длинным концевым повтором (LTR), выделенным из такого ретровируса. Примерами подходящих промоторов являются промоторы вируса Симиан 40 (SV40), предпочтительно поздний промотор SV40, и длинные концевые повторы вируса саркомы Рауса (RSV LTR). Промотор RSV LTR представляет собой последовательность ДНК, которая ранее была описана как сильный промотор при вводе в различные эукариотические клетки, такие как фибробластовые линии клеток (Jorman и др. 1982, PNAS, 79, 6777 6781). Однако, в силу специфической природы клеток миеломы, то, что RSV LTR оказался эффективно действующим промотором в клеточной среде миеломы, было неожиданным результатом.

Наряду с этим, данный промотор может быть невирусным, а таким, как мышиный металлотиониновый промотор.

Понятие "миелома" в данном описании охватывает миеломные клетки млекопитающих и клетки, полученные из них путем слияния, например клеточные линии гибридомного типа.

Эукариотический полипептид может быть полипептидом млекопитающего, таким, как фермент (например, химозин), ферментный ингибитор, гормон (например, гормон роста), лимфокин (например, интерферон, или иммуноглобулин или его фрагмент (например фрагмент fab).

Эукариотический полипептид может быть слитым полипептидом, включающим по меньшей мере как составляющую эукариотический полипептид. Эукариотический полипептид может находиться в его естественной форме или в форме функционально эквивалентного производного. Этот эукариотический полипептид может включать сигнальную последовательность, допускающую удаление полипептида из миеломной клетки-хозяина.

В описанном ниже примере осуществления данного изобретения эукариотический полипептид представляет собой тканевый активатор плазминогена (tPA) как наиболее предпочтительный продукт. Конкретно векторы экспрессии, соответствующие настоящему изобретению, обозначены как p6, p3.16, pRSV3, pZ AP7, pAC1, pAC2, pAC5, p6GD, p6gpt, pR5D3, pAc6 и pPRI, построение которых из доступных продуктов подробно описывается ниже.

Клеточная линия миеломы может быть клеточной линией миеломы или гибридомы крысы или мыши, такой, как клеточная линия гибридомы крысы YB2/3.0 Ag20, клеточная линия гибридомы мыши NSO, или клеточная линия гибридомы мыши SP2-OAg.

Установлено, что некоторые комбинации клеточных линий миеломы с векторами, несущими специфические промоторы, дают улучшенные свойства. В случае, когда клеточная линия представляет собой клеточную линию крысы, например, клеточную линию гибридомы крысы YB/3.0 Ag20, то используемый промотор представляет собой предпочтительно RSV LTR. Когда клеточная линия представляет собой клеточную линию мыши, такую как клеточная линия гибридомы мыши SP2-OAg, клеточная линия гибридомы мыши NSO, или полученная от NSO клеточная линия гибридомы, то используемый стимулятор представляет собой предпочтительно поздний промотор SV40.

В случае, когда эукариотический полипептид включает соответствующие сигнальные последовательности (по крайней мере в первоначально транслированном продукте), то происходит "выход" полипептида в супернатант, что позволяет улучшить данный способ, т.к. не требуется разрушения клеток для сбора продукта.

Данный способ продуцирования эукариотического полипептида может включать извлечение этого полипептида из жидкой среды культивирования клеток миеломы, трансформированных вектором по изобретению, который обеспечивает экспрессию гена и секрецию полипептидного продукта.

Клеточная линия гибридомы крысы YB2/3.0 Ag20 описана в британском патенте N 2079313 и находится на хранении культур американского типа (как YB2/0 или YB2/3HL. P2.G11.16 Ag.20) под номером CRL 1662 (дата сдачи раньше, чем 1 июня 1985 года).

Клеточная линия гибридомы мыши SP2-OAg14 находится на хранении в коллекции культур американского типа под номером CRL 1581 (дата сдачи раньше, чем 1 июня 1985 года).

Клеточная линия гибридомы мыши P3/NSI/ 1 Ag4.0 (клеточная линия NSI) находится на хранении в коллекции культур американского типа под номером T1B18.

Далее настоящее изобретение описывается со ссылкой на фигуры, в которых:

фиг. 1 показывает рестрикционные карты плазмид p 2, B-глобин, pSV3 Bne, pSV3 MMne, p6, p3.16, pRSV3, pZAP7, pAC1, pAC2, pAC5, pAC6 и pPR1 (направление транскрипции генов tPA и BPV обозначено стрелками). Положение сайтов рестрикции EcoRI, BamHI и SalI обозначено как E, B и S соответственно. Происхождение различных последовательностей обозначается следующим образом: BPV; ДНК от pBR322; металлотионеиновый промотор мыши; LTR промотор либо от вируса лейкемии мыши Moloney (pAC1, pAC3), либо от вируса саркомы Rous (pAC4, pAC5, pAC6 и pPR1); tPA к ДНК; поли A сайт SV40; поздний промотор SV40; отбираемый ген; ранний промотор SV40; последовательности SV40).

На фиг. 2 представлены фотографии чашки с фибриновой агарозной средой, содержащей клетки (Sp2/O-Ag14), трансфецированные идентичными плазмидными конструкциями, за исключением 5" промоторных фрагментов гена tPA, через 24 часа и через 48 часов после начала трасфекции; на фиг.3 представлены графические кривые, показывающие профили роста и синтез tPA клетками pR1 1/10 в воздушном подъемном ферменторе (жизнеспособные клетки ; tPA, определяемый методом ELISA ; tPA, определяемый с помощью фибриновой агаровой пробы O).

1. Построение вектора

1.1. Построение вектора экспрессии кДНК тканевого активатора плазминогена (tPA).

Способы, используемые в данных построениях, подробно описаны Maniatis и др. (1982г.). Специфические ДНК последовательности tPA, используемые в данном исследовании, были выделены из двух клонов кДНК, извлеченных из меланомной библиотеки Bowes (Harris и др. 1986г.). Плазмида ptPA A3 была построена путем ввода линкеров для Hind 111 в фрагмент tPA кДНК размером 1200 пар оснований (bp) (нуклеотиды 9 1197, Rennica и др. 1983г.). Затем кДНК была клонирована в pAT153 в уникальный сайт Hind 111. Плазмида ptPA21 была построена путем клонирования фрагмента Bgl 11 кДНК (нуклеотиды 187-2166) в плазмиде с уникальным сайтом Bgl 11. Полная кДНК гена tPA была получена путем клонирования фрагмента Bgl 11 из ptPA21 в точку Bgl 11 ptPA A3. Полученная плазмида ptPA 3/21 содержит 76 пар оснований (bp) некодирующей 5" последовательности, полную tPA-кодирующую зону, 393 п.о. 3" некодирующей последовательности, и повторяющийся сегмент tPA кодирующей зоны (нуклеотиды 187-1197), все на одном фрагменте Hind 111. Построена также вторая плазмида p81/11, в которой фрагмент Hind 111 находится в обратном положении относительно последовательностей pAT153.

Плазмида p81/11 переваривалась BalI, и фрагмент BalI, содержащий 116 нуклеотидов 3" некодирующей последовательности, повторный сегмент кодирующей зоны tPA и некоторые последовательности pAT 153, удалялся с получением pBSI. Одиночные сайты BamHI и SalI рестриктаз были снова введены в pBSI путем лигирования фрагмента BamHI/SalI размером 275 bp из pAT 153, липкие концы которого были дополнены полимеразой ДНК в точке BalI. В зависимости от ориентации, в которой вставлялся данный фрагмент, либо точка SalI (pBS17), либо точка BamHI (pBS18) снова создавалась на 3" конце гена tPA. Плазмида pBS 18 была предшественником для всех построений вектора экспрессии tPA кДНК.

1.2. Металлотионеиновый промотор (ММТ-1) мыши.

Клон 28 (Доктор D. Hamer. Национальный медицинский институт, Бетезда, Мэрилэнд, США) имел целостный геном SV 40, клонированный в точку BamHI и фрагмент EcoRI размером 3,8 kb, содержащий ген металлотионеина 1 (ММТ-1) мыши (Hamer и Walling, 1982г.), клонированный в точку EcoRI. Эта плазмида давала промотор ММТ-1 для построения вектора экспрессии tPA. Уникальный сайт BglI, находящийся на 4 bp выше начальной точки трансляции (Jlanville и др. 1981г.), был превращен в сайт Hind 111 с использованием олигонуклеотида CCAAGCTTGG. Фрагмент из 2,0 bp, выделенный из клона 28, содержащего промотор ММТ, был клонирован в уникальный сайт Hind 111 плазмиды pBS18, что приводило в результате к образованию транскрибируемого слияния между ММТ промотором и кодирующими последовательностями tPA. Данная плазмида была названа pBS18M3. Фрагмент BamHI/BclI размером 243 bp, выделенный из клона 28 и содержащий точку полиаденилирования SV40, был вставлен в сайт BamHI плазмиды pBS18M3. Сайт полиаденилирования был ориентирован так, что воссоздавал сайт BamHI на периферии гена tPA. Эта плазмида названа p3.16.

1.3. Длинные концевые повторы вируса саркомы Rous и вируса Moloney лейкемии мыши.

Длинные концевые повторы (LTP) вируса саркомы Rous (RSV) и вируса Moloney лейкемии мыши (MoMLV) были выделены как фрагменты ClaI/Hind 111 из pRSVcat (Gorman и др. 1982г.) и p836 (Hoffman и др. 1982г) соответственно. В первом случае точка MboII превращалась в точку ClaI с использованием олигонуклетида GGATCGATCC, а в последнем случае точка SmaI превращалась в точку Nind 111 с использованием олигонуклеотида CCAACGTTGG. Данные фрагменты по отдельности клонировались в p3.16, предварительно разрезанную ClaI и Hind 111 так, что ММТ промотор мог быть заменен ретровирусным промотором LTP. Полученные в результате плазмиды названы pRSV3 (содержащие RSV LTP) и pZAP7 (содержащие MoMLV) (смотри фиг.1).

1.4. Поздний промотор SV40.

Плазмида, содержащая поздний промотор SL40, стимулирующий tPA, была построена с использованием плазмиды p3.16 в качестве основного вектора. Поздний промотор SV40 был выделен из pSV2neo путем переваривания PVU 11 с последующим добавлением линкеров для Hind 111 и с последующим прерыванием Hind 111. Продуцированный таким образом фрагмент позднего промотора SV40 был очищен посредством гель-электрофореза и использован для замены Hind III фрагмента промотора ММТ из плазмиды p3.16. Полученная плазмида была обозначена p6 (смотри фиг. 1).

1.5 Сравнительный пример иммуноглобулиновый промотор/энхансер

Плазмида, содержащая комбинацию иммуноглобулинового промотора/ энхансера была построена с использованием pAT153 в качестве основного вектора (Twigg и Sherratt, 1980 г.). Область EcoRI-BamHI в pAT153 была замена энхансером тяжелой цепи Ig (Ig en) на фрагменте XbaI-EcoRI (Jillies и др. 1983 г.), превращенном в фрагмент EcoRI путем ввода линкеров для EcoRI. Ig en был клонирован в определенной ориентации относительно промотора тяжелой цепи Ig (Ig Pro), выделенного как фрагмент EcoRI NCoI размером 1,3b. Этот фрагмент промотора получен из фагового клона VNpB-186 (Bochwell и др.) с его точкой NcoI, дополненной полимеразой и превращенной в точку BgeII за счет ввода линкера, в результате чего был сконструирован вектор pM1205. Ген tPA был введен в этот вектор как фрагмент BamHI. Он был выделен из pBS 18 как фрагмент BamHI-Hind III с последующим вводом линкеров для BamHI. BamHI фрагмент tPA был введен в сайт BglII вектора pM1205, образуя pM1205 tPA.

Пять плазмид p3.16, pRSV 3, pZAP7, p9 и pM1205 (фиг. 1) были непосредственными предшественниками векторов экспрессии tPA и, кроме того, эти плазмиды использовались в промежуточных пробах для анализа продуцирования tPA.

1.6. Селективные маркеры и другие функциональные фрагменты.

Гены, ответственные за преобладающий отбор, были получены из pV2neo (Southern и Berg, 1982 г.), pSV2 dhfr (Submarani и др. 1981 г.) и pSV2 gpt (Mulligan и Berg, 1981г.).

Устойчивость к антибиотику G418, сообщаемая транскрипционной единицей в pSV2 neo ("neo"), использовалась в большинстве описанных построений. Для того, чтобы можно было использовать транскрипционное звено "neo", оно снова клонировалось как в BamHI, так и в Hind III фрагмент.

Отправной точкой векторных построений была плазмида pSV2 глобин (фиг. 1), (Southern Berg, 1982). Сайт Hind III данного вектора превращался в сайт BglII с последующим удалением полученного в результате фрагмента Bgl II, содержащего ген b глобина. Полученная плазмида pSV2 BglI образует основу для следующего этапа превращения точки PVUII в точку Hind III, приводящего к образованию плазмиды pSV3M.

Ввод гена "neo" в pSV3M осуществляется путем замены BglII BamHI фрагмента гена удаления поли A-последовательности фрагментом BglII-BamHI, выделенным из pSV2neo. Полученная плазмида pSV3Mne, теперь уже включающая ранний промотор SV40, ускоряющий экспрессию гена "neo" без поли A-последовательности, содержалась во фрагменте HindIII-BamHI. Точки HindII и BamHI плазмиды pSV3Mne были по отдельности превращены соответственно в сайты BamHI и HindIII, что приводило в результате к образованию плазмид pSV3Bne и pSV3MMne (фиг.1) соответственно.

Для того, чтобы соответствующий генный фрагмент для использования ксантин-гуанинфосфорибосилтрансферазного (gpt) гена из pSV2 gpt (Mulligan и Berg, 1981 г. ), обеспечивающего преобладающий отбор в присутствии микрофенольной кислоты и ксантина (Morrison и Oi (-), 1984 г.), BglII-BamHI фрагмент плазмиды pSV3M, содержащей ген "neo", был заменен BglII-BamHI плазмиды pSV2 gpt, содержащим ген grt. Полученная плазмида pSV3 gpt содержит ранний промотор SV40, ускоряющий экспрессию gpt с поли A-последовательностью от SV40 на 3"-конце фрагмента Hind III-BamHI. Сайт Hind III данного вектора затем был превращен в сайт BamHI с образованием плазмиды pSV3 B gpt, обеспечивающей фрагмент BamHI, необходимый для использования в описанных выше векторах.

Для исследования возможности амплификации в клетках миеломы использовали кДНК гена дигидрофолятредуктазы (dhfr) мыши, содержащуюся в pSV2 dRfr (Submarani и др. 1981 г.).

Для того, чтобы получить генный фрагмент раннего промотора SV40 и dhfr, предназначенный для данных векторов, осуществляли превращение сайта PVUI плазмиды pSV2 dhfr в сайт BamHI за счет ввода линкера, в результате чего получали плазмиду pDB. Плазмида pDB включает фрагмент BamIH, содержащий ранний промотор SV40, ускоряющий экспрессию гена dhfr с поли A-последовательностью SV40, присоединенной на 3"-конце.

Плазмида pBMTHI (доктор J.N.Pavlakis; Государственный институт ракового заболевания; Фредерик, Мэрилэнд) содержит полный геном BPV-1 и полный ген MMT-1 на фрагменте BamHI/SalI. Вторая плазмида pBMT13 построена из pBMTH1, в которой сайт BamHI превращен в сайт SalI, а сайт SalI превращен в сайт BamHI. Начальные векторы были основаны на векторах BP для того, чтобы изучить их потенциальное значение. Исследование на pBMT13 продемонстрировало, что селекция клеток миеломы по отношению к тяжелому металлу нецелесообразна. Это вызвало необходимость в другой системе отбора в пределах BPV. Для того, чтобы построить векторы BPV, обеспечивающие преобладающий отбор в клетках миеломы, был введен ген "neo" от плазмиды pSV3MM, выделенный как фрагмент HindIII, дающий возможность непосредственной замены гена MMT-1 в плазмиде pBMT13. Эта замена гена ММТ-1 дала в результате два новых основанных на плазмиде BPV вектора, p2012 SneR и p2012 Snel, содержащих ранний промотор SV40, ускоряющий ген "neo" как вставку по HindIII, в обеих ориентациях относительно BPV. Эти векторы ВРV дали основу векторов, испытываемых в клетках миеломы с использованием описанных выше плазмид с tPA: p6, p316, pPSV3 и pZAP7. Полученные плазмиды pAC1, pAC2, pAC5 и pAC6 образованы путем замены последовательности BamHI-SalI pAT153 фрагментами BamHI-SalI от p6, p316, pRSV3 и pZAP7. Дальнейшие построения осуществляли без BPV. В этих последних построениях использовались фрагменты BamHI из плазмид pSV3ne, pSV3Bgpt и pDB, обеспечивающих маркеры для отбора.

Для того, чтобы использовать pRSV3 для получения устойчивых линий клеток при отсутствии вектора BPV, обеспечивающего отбор, в сайт BamHI был введен маркерный ген отбора. Используемый ген отбора представлял собой фрагмент BamHI из pSV3Bne, в составе плазмид pPR1 и pPR11, содержащих фрагмент BamHI в обеих ориентациях. В дополнение к гену "neo", BamHi кассета отбора из pSV3 в gpt и pDB также были введены в сайт BamHI, в результате чего получали pRSG, содержащую ген gpt, и pRSD3, содержащую три или более генные кассеты dhfr.

Для использования позднего промотора SV40, ускоряющего выражение tPA, при отсутствии BPV, были осуществлены построения, аналогичные указанным выше. Была введена генная кассета BamHI gpt от pSV3 Bgpt с образованием p6 gpt. Полезность вектора p6 gpt была дополнительно увеличена за счет ввода генной кассеты выражения BamHI и p6 gpt, частично вываренную BamHI, в результате чего получали p6GD.

2.Трансфекции.

Линии клеток, используемые для трансфекции, представляли собой SP2-OA 14 (Shulman и др. 1978 г.); NSO, подлинию P3/NSI/I Ag 4.1 (Kohler и др. 1976 г. ), которая не экспрессирует внутриклеточные легкие цепи (M.Clark, B.W.Wright и C. Milstein); 001 BALB/ с XNSO гибридому (Sherwood M. работа не опубликована) и YB1/3.0 ag 20 (патент Великобритании N2079313). Эти линии клеток сохранялись в модифицированной Dulbecco среде Eagle"s (DMEM, Jibco Ltd, Великобритания) с пенициллином (50 ед/мл), стрептомицином (50 мкг/мл), 1 мМол пируватом, 2 ммл глутамином и сывороткой плода теленка, подвергнутой тепловой инактивации (10%).

Для того, чтобы ввести ДНК в клетки миеломы, были использованы стандартные методы с применением DEAE-декстрана, CaPO₄ и электропорации (Banerji и др. 1983 г. Jraham and Vander Eb, 1973 г. Potter и др. 1984 г.). Большинство данных трансфекций были осуществлены с использованием модификации метода декстрана DEAE с использованием диметилсульфоксида (DMSO) (Lopata и др. 1984 г.) и хлорхинина (Lathman и Magnusson, 1983 г.) для улучшения трансфекций.

Клетки после трансфекций обычно оставляли на 24 часа.

Трансфекции с плазмидными конструкциями, содержащими генную кассету "нео" либо от pSV3Bne либо от pSV3MMne, отбирали с использованием антибиотика G418 (Geneticin Jibco Ltd, Великобритания, патенты США фирмы Schering Corp. N 3959254, 3997403) с концентрацией 1,4 мг/мл.

Плазмиды, содержащие генную кассету gpt из pSV3 Bgpt, были отобраны путем дополнения среды культивирования ксантином до концентрации 200 мкг/мл, микофенольной кислотой до концентрации 5 мкг/мл (Jibco, Великобритания) и гипоксантином до концентрации 13,6 мкг/мл.

Отбор плазмид, содержащих генную кассету dhfr из pDB, осуществляли при концентрации метотрексана 150 мМоль (Page, 1985 г.)

В случае трансфекции p6GD первоначально отбирали линии клеток с использованием генной кассеты gpt с последующим использованием генной кассеты dhfr для амплификации.

Клетки после селекции снова инкубировали еще в течение 24 48 часов, после чего их помещали в микротитровальные чашки для отбора клона. Эти микротитровальные чашки обычно инкубировались в течение 2 3 недель, после чего появлялись первые клоны. Клоны выращивались вплоть до насыщения (превращения красной фенольной среды выращивания в желтую), после чего анализировали супернатант, или же они распределялись в 24 чашках с тканевой культурой. Данные линии клеток от указанных трансфекций, которые продемонстрировали высокую степень продуцирования tPA (более чем 100 мк/мл), выдерживались в замороженном состоянии в жидком азоте после введения в среду 10% диметилсульфоксида. Эти линии клеток также были повторно клонированы, и отобранные продуценты также выдерживались как указано выше.

Количественная оценка белка tPA.

tPA из клеточных линий подвергался анализу либо путем фибринолизиса, либо методом связанного с ферментом иммуносорбента (ELISA).

Активный белок tPA в данной среде анализировали методом с использованием чашек с фибрин-агарозой, модифицированным Cederholm-William. Агароза LGT с концентрацией 20 мг/мл в 0,1 мол.Трис (pH=7,4), 0,15 мол. NaCl и 2 ммол. CaCl₂ расплавлялась и охлаждалась до 55^oC. Вводили равный объем фибриногена концентрацией 2 мг/мл в 0,9 (мас./об)% NaCl и человеческий плазминоген до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полимеризация фибрина инициировалась путем добавления бычьего тромбина до 0,12 ед./мл. Смесь выливали на полиэфирные пластины и отверждали. В ямки, образованные в геле, вводили разбавленные растворы проб и стандартный разбавленный раствор урокиназы известной концентрации (объем 5 мкл), и чашки инкубировали при температуре 37^oC в течение от 17 до 20 часов в увлажненной камере. Измеряли диаметры зон лизиса. Была построена стандартная кривая на основе данных для урокиназы по зависимости логарифма квадрата диаметра от логарифма концентрации. Степень активности проб определяли по стандартной кривой. Установлено, что в диапазоне от 10 до 100 ед/мл урокиназа была подходящим стандартом для определения активности tPA.

Общий количественный анализ белка tPA в культуральной среде трансфецированной линии клеток осуществляли с использованием метода ELISA. Метод ELISA осуществляли с использованием чашек с пробами Nunc Immuno (Nunc, Дания), покрытых в течение одного часа при температуре 37^oC 24 мкг/мл козлиной поликлональной анти tPA (Biopool, Швеция) в 0,05 мол. карбонате натрия (pH=9,6). Эти чашки были блокированы в течение одного часа при температуре 37^oC казеином Hammerstem (0,5% ) в 0,05 мол. растворе карбоната натрия (pH=9,6). Эти покрытые и блокированные микротитровальные чашки и чашки на других стадиях промывки промывались буферным солевым раствором фосфата, 0,02% твином 20. Пробы для анализа разбавляли, получая разбавленные буферные растворы (0,1 мол. Трис-HCl, pH=7,0; 150 ммол NaCl, 0,5% казеин и 0,02% твин. 20). Стандарт, используемый в данном анализе, представлял собой двухцепочечный tPA (Biopool, Швеция). Пробы вводились в количестве 100 мкл на ямку и инкубировались в течение одного часа при комнатной температуре со взбалтыванием. Затем чашки промывались, и в каждую ямку (100 мкл) вводили 1 мкг/мл МАСО10 мышиного моноклонального антитела к tPA, в буферном растворе пробы. Осуществляли инкубацию в течение одного часа при комнатной температуре с одновременным взбалтыванием. Чашки после инкубации моноклонным антителом промывали, и в каждую ямку вводили конъюгата козьего антимышиного IgGFc и специфической пероксидазы и осуществляли инкубацию в течение одного часа при комнатной температуре с одновременным взбалтыванием. Чашки после инкубации с конъюгатом промывали и затем обрабатывали, как описывалось ранее (Bes и др. 1981 г. ).

Промежуточный анализ продуцирования tPA в клетках миеломы.

Для того, чтобы оценить способность данных плазмидных конструкций направлять экспрессию эукариотических генных продуктов, был использован анализ фибринового слоя для активаторов плазминогена, адаптированный к системе высоко- чувствительного и, следовательно, эффективного промежуточного анализа (Jones и др. 1975 г. Kenten и др. 1986 г.).

Плазмиды, используемые для этих промежуточных анализов продуцирования tPA, были такие же, что описаны ранее, а именно:

p316, содержащая мышиный металлотионеиновый промотор;

pRSV3, содержащая RSV LTR;

pZAP7, содержащая MOMLV LTR;

p6, содержащая поздний промотор SV40, и

pM1205 tPA, содержащая комбинацию иммуноглобулиновых промотора и энхансера.

Трансфекции осуществлялись с использованием метода DEAE-декстрана, как описывалось выше, и клетки вводились непосредственно в пробу tPA, как описано ниже.

Для осуществления анализа tPA трансфецированные клетки соскребались с чашки (примерно 5 10⁶) и 10% извлеченных клеток двукратно промывали не содержащей сыворотку D MEM (Jibco), 1 ммол пируватом, 501 ед/мл пенициллином, 50 мкг/мл стрептомицином (P/S). 2 ммол. L-глутамином (Gln). Затем эти клетки суспензировали в 7 мл DMEM (70%), как указано выше, с добавлением 10 (об/об)% обработанной кислотой сыворотки зародыша теленка (FCS), сбалансированных солей Hanks (Jibco) с добавлением 2,5% агарозы с низкой температурой гелеобразования (фирма Sigma Ltd.) при 42^oC. Затем в эту суспензию вводили 0,5 ед. тромбина (из бычьей кровяной плазмы, 500 ед/мл, фирма Sigma Ltd). И, наконец, вводили 1,5 мл DMEM, 1 ммол. пируват, P/S, Gln, 10 (об/об)% обработанную кислотой FCS, 30 мг/мл фибриногена (из бычьей крови типа 1-S, фирма Sigma Ltd) и смесь медленно вливали непосредственно в чашку диаметром 90 мм. Чашки инкубировали в течение времени вплоть до 48 часов с целью определения количества tPA, образующегося из данных трансфекций. Результаты получали в форме фибронолитической активности. Типичные результаты представлены на фиг. 2.

Результаты данных трансфекций показали, что для УВ2/3.0 Ag 20 промоторы располагаются в следующем порядке снижения активности: RSV LTR, поздний промотор SV, MoMLV LTR и MMT. Мышиная гибридомная линия клеток SP2/O-Ag14 и BALB/c XNSO продемонстрировала следующий порядок расположения промотора по мере снижения их активности: поздний промотор SV40, RSV LTR, MoMLV LTR и MMT.

Кроме того, было проведено испытание иммуноглобулинового промотора в комбинации с частично охарактеризованным фрагментом энхансера, как описано в приведенном выше разделе. Это испытание показало степень экспрессии tPA, очень близкую к степени экспрессии с промотором ММТ в линиях клеток миеломы.

Результаты данных анализов могут служить основой для первоначального исследования линий клеток с интегрированными генами для экспрессии. Данный промежуточный анализ обеспечивает лишь возможность определения силы действия промотора, выделенного из нормального генного окружения (в хромосоме). Таким образом, можно выявить различия между результатами для неустойчивых и устойчивых в отношении промотора линий клеток.

Продуцирующие tPA линии клеток.

Продуцирующие tPA линии клеток были получены от мышиной гибридомы SP2/O-Ag14, NSO и крысиной гибридомы YB2/3.0-Ag20. Эти линии клеток иллюстрируют способность промоторов ускорять экспрессию зукариотических генов в линиях клеток гибридомы и миеломы.

Была выбрана линия клеток мышиной гибродомы SP2/A-AG 14, поскольку она является подходящим кандидатом для продуцирования линии клеток по мере ее роста в не содержащей сыворотку среде в виде суспензии. Трансфекция данной линии клеток плазмидами pACL, pAC2, pAC6, pPR1 продемонстрировала способность к получению линий клеток, экспрессирующих tPA, из SP2/O-Ag14. Результаты, полученные с плазмидами pAC1,pAC2, pAC6 и pPR1, продемонстрировали способность стимуляторов MMT, RSV LTR и MOMLV LTR ускорять экспрессию эукариотических белков в данной линии клеток.

Результаты для SP2/0-AG 14 (максимальные значения) представлены ниже в табл. 1.

Другая линия клеток мышиной гибридомы, NSO, также проявляла желательный характер роста SP2/O-Ag14. Один плазмидный вектор (p6GD) был трансфектирован в NSO, образуя линии клеток. Эти линии клеток, как было продемонстрировано, способны синтезировать tPA вплоть до 27 ед/мл под воздействием позднего промотора SV40.

Исследуемая крысиная гибридома представляла собой линию клеток УB2/3. O-Ag20, которая обеспечивала высокое продуцирование линий клеток гибридомы. Эта линия клеток продуктивно трансфецировалась плазмидами pAC1, pAC6, pPR1, p6GD, pRSD3 и p6gpt, демонстрируя способность промоторов МО MLV LTR RSV LTR и поздних промоторов SV40 ускорять экспрессию в этой линии клеток.

Результаты для данных линий клеток, полученные путем трансфекции, представлены в табл. 2.

Амплификация.

Увеличение числа копий гена является известным приемом улучшения продуцирования белка в системе экспрессии. Это в значительной степени обусловлено признанием амплификации как механизма, осуществляемого естественным образом в различных специфических тканях или видах (Schimke, 1984г). Данный механизм был использован в системах эукариотической экспрессии, но особенно значительное действие он проявляет в линиях клеток китайского хомячка (Kaufman и др. 1983 г. ). Наилучшим образом охарактеризованной системой амплификации является такая система, которая основана на dhfr и метотрексате (Schimke, 1984г). При таком положении дел было бы интересно узнать, может ли осуществляться амплификация одновременно с экспрессией, обеспечивая полезную функцию в линиях клеток мышиной и крысиной гибридомы/ миеломы.

Данное исследование осуществлялось с использованием плазмидной конструкции pRSD 3 и линии клеток УB2/3.O-Ag 20. Этот плазмидный вектор был введен в УB2/3. O-Ag20, а клоны отобраны с использованием метотрексата (150 нМ). Отбор этих линий клеток и отбор полученных клонов проводили на все более высоких количествах метотрексата с использованием известных методов (Kaufman и др. 1983 г). Линии клеток отбирали в начале амплификации и через определенные интервалы в ходе амплификации. Предел экспрессии tPA был типичным, причем наблюдался широкий спектр активности в исходных выделенных линиях клеток.

Полученные результаты продемонстрировали, что по мере увеличения стойкости к метотрексату увеличивается степень продуцирования tPA; это говорит о целесообразности одновременной амплификации в линиях клеток гибридомы/миеломы.

Целесообразность одновременной амплификации наилучшим образом иллюстрируется на примере линии клеток YO/pRSD 3/2. Это начинается при росте tPA (45 ед/мл) в 150 нМ метотрексате. Степень продуцирования tPA повышалась до 5800 ед/мл при росте в 3 МкМ метотрексате по прошествии пяти месяцев.

Для того, чтобы оценить значение этих трансфецированных клеток в культуре, разводимой в больших масштабах, отбиралась одна клеточная линия для анализа в небольшом кислородном ферментере. Выбранная клеточная линия представляла собой BY2/3.O-Ag 20, трансфецированную pPR1, клоном, который проявил высокую степень продуцирования в стационарной культуре pR1 1/10.

Культура линии клеток pPR1 1/10, вводимая партиями в подъемный воздушный ферментер.

Цель данного эксперимента заключалась в том, чтобы определить рост и синтез tPA линией клеток pPR1 1/10 в продуцирующем типичную клеточную культуру реакторе (клеточном реакторе).

Используемый клеточный реактор представлял собой воздушный подъемный фермент (ALF) рабочим объемом 5 литров, с автоматическим контролем давления растворенного кислорода (DOT), величины pH и температуры. Контроль DOT осуществляли путем регулируемого ввода воздуха или кислорода в распыляемый балластный газообразный азот или воздух. Контроль величины pH осуществляли путем регулируемого ввода двуокиси углерода в данную газовую смесь или же путем использования насоса, подающего щелочь в культуральную среду. Контроль температуры осуществляли по расходу воды с регулируемой температурой, подаваемой в рубашку реактора.

Клетки данной линии pPR1 1/10 были выращены общепринятым путем в круглой склянке в среде культивирования, состоящей из модифицированной Dulbecco среды Eagle (DMEM), с введенной в эту среду фетальной сывороткой теленка (FCS), 10 (об/об)% подвергнутой тепловой инактивации.

Среда для выращивания культуры в ALF представляла собой не содержащую сыворотку композицию, включающую DMEM, с введенным в нее альбумином, инсулином, трансферрином, этаноламином, холином, витаминами, металлами в следовых количествах и защищающим от сдвигового воздействия полимером.

Клеточный инокулум для разведения в ALF был выращен в содержащей сыворотку среде. Данные клетки осаждались путем центрифугирования и снова суспензировались в не содержащей сыворотку среде роста до введения в ALF. В ферментер (ALF) вводились питательные вещества. Эти вещества включали:

А) непродолжительный ввод глутамина для увеличения конечной концентрации в культуре на 2 мМ;

в) непродолжительный ввод "нерастворимых" аминокислот триптофана, тирозина и цистеина;

с) нагнетаемую насосом композицию, включающую холиноглюкозу и "растворимые" аминокислоты.

Пробу брали из выращиваемой культуры в течение дня с интервалами. Расчет клеток осуществляли, используя модифицированную счетную камеру Funch Rosenthal, и жизнеспособность клеток определяли по исключению окрашивания трипаном синим. Аликвоты поверхностных слоев культуры быстро замораживали в жидком азоте и затем выдерживали при -70^oC для последующего количественного определения tPA методом tPA-ELISA и путем анализа с использованием чашки с фибриновым агаром.

На фиг. 3 показаны профили роста клеток pPR1 1/10 синтеза tPA в воздушном ферменте. Клетки достигали максимума плотности жизнеспособной популяции 2,2х10⁶/мл и максимума плотности общей популяции 4х10⁶/мл. PA синтезировался по всей культуральной жидкости, достигая максимальной концентрации 42 мкг/мл, измеренной на чашке с фибриновым агаром, и 38 мкг/мл, измеренной методом tPA ELISA. Соответствие результатов, полученных методом ELISA (который позволяет определить как активный, так и неактивный tPA) и методом с использованием чашки с фибриновым агаром, показывает, что синтезированный tPA полностью активен.

Линии клеток, указанные на стр. 6 7 перевода данной патентной заявки, были сданы на хранение и находятся в Американской коллекции типовых культур (АТСС) по адресу: 12301 Packlawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США.

Подробности о хранении данных культур следующие:

Порядковый номер Дата сдачи

АТСС CRU 1981 22 октября 1980 г.

АТСС CRU 1662 19 марта 1982 г.

ТУВ 18 10 ноября 1981 г.