рекомбинантная плазмидная днк pesg, способ получения рекомбинантной плазмидной днк pesg и штамм бактерий escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pesg, используемый для получения гибридного белка, состоящего из 485 а.к., обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеина вируса т-клеточного лейкоза человека первого типа

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pESG размером 5,6 т.п.н. определяющая синтез гибридного белка, состоящего из 485 аминокислотных остатков (а.к.), обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеина вируса Т-клеточного лейкоза человека первого типа (HTLV-I), содержащая уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз Bam HI, PstI, HindIII, StuI, ClaI, Tth111-II; генетический маркер, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; Sal GI-фрагмент плазмиды pUR 291 размером 5,2 т.п.н. кодирующий в том числе полноразмерную бета-галактозидазу Escherichia coli и участки полилинкерных областей; SalGI-BamHI-фрагмент плазмиды pBEI размером 0,4 т.п.н. кодирующий последовательность env белка HTLV-I размером 124 а.к.

2. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pESG размером 5,6 т.п. н. определяющей синтез гибридного белка, состоящего из 485 а.к. остатков, обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеина вируса Т-клеточного лейкоза человека первого типа (HTLV-I), заключающийся в том, что Pvu II BamHI фрагмент плазмиды pMCI встраивают в вектор pUR 291 по сайту BamHI с получением плазмиды pBEI, указанную плазмиду гидролизуют рестриктазой SalGI для выделения фрагмента ДНК размером 0,4 т.п.н. который лигируют с линеаризованным при использовании рестриктазы SalGI вектором pUR 291 с сохранением рамки считывания клонируемого гена env HTLV-I и бета-галактозидазы Escherichia coli и получают целевую рекомбинантную плазмидную ДНК pESG.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ГКВ/pESG, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pESG, используемый для получения гибридного белка, состоящего из 485 а.к. обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеина вируса Т-клеточного лейкоза человека первого типа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм Escherichia coli, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ДНК-копию фрагмента области env генома HTLV-1, определяющую синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поврехностного гликопротеида оболочки HTLV-1, и способ создания такой плазмиды.

Вирус T- клеточного лейкоза человека 1 типа (human T-cell leukemia virus type 1, HTLV-1) относится к семейству Retroviridae, подсемейство Oncovirinae, группа (HTLV-BLV). Он оказался первым обнаруженным ретровирусом человека C-типа и является этиологическим агентом некоторых злокачественных T-клеточных лейкозов/лимфом взрослых. Кроме того, HTLV-1-инфекция, как правило, ассоциирована с целым семейством родственных неврологических расстройств, включающих тропический спастический парапарез, HTLV-1-ассоциированную миелопатию и хроническую лимфоцитическую лейкемию. Этот вирус является типичным C-лимфотропным ретровирусом 1 типа со специфической аффинностью к CD4+ лимфоцитам, вызывающим их неопластическую трансформацию. У лиц с антителами к HTLV-1 наблюдаются значительные изменения основных субпопуляций лимфоцитов.

Область env HTLV-1 локализуется в районе 5202-6668 пар нуклеотидов (п.н. ) генома и кодирует основной гликопротеид оболочки вируса HTLV-1. Продукт гена env предшественник белков оболочки вируса с мол. мас. 61 кДа обнаруживается только в инфицированных клетках. Этот предшественник процессируется клеточными ферментами на два функциональных домена: наружная гликопротеиновая часть (gp46) и трансмембранная часть (p21).

Рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный нами фрагмент области env, кодирует неполный предшественник гена env и обеспечивает синтез в бактериях Escherichia coli (E. coli) гибридного белка, N-концевая часть которого представлена бета-галактозидазой, а C-концеваая вирусоспецифической последовательностью. Данная конструкция в литературе не описана.

Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеида оболочки HTLV-1, способной наследоваться в штаммах бактерий E.coli, и создание таким образом штамма - продуцента этого белка.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pESG состоит в том, что с помощью фермента рестрикции SalG1 из промежуточной плазмиды pBE1 вырезан фрагмент величиной 426 п.н. Этот фрагмент лигируют с линеанизированной гидролизом SalG1 формой ДНК плазмидного вектора pUR291. После соответствующей инкубации трансформируют полученным препаратом компетентные (обработанные CaCl/2) клетки E. coli с последующим отбором трансформантов по их способности расти на среде, содержащей ампициллин.

Анализ полученной рекомбинантной ДНК проведен с помощью эндонуклеаз рестрикции.

Описание плазмиды.

Название pESG,

Размер 5,6 т.п.н.

Состоит из SalG1 BamH1 фрагмента (426 п.н.) последовательность области env HTLV-I; SalG1 фрагмента плазмиды pUR291 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-галактозидазы, областью ori и геном устойчивости к ампициллину (фиг.1);

уникальные сайты рестрикции BamHI, RstI, HindIII, StuI, ClaI, Tth111-II;

Плазмида определяет устойчивость клеток E.coli HB101 к ампициллину и синтез в них гибридного белка величиной 485 а.к. остатков, содержащего антигенные детерминанты области env HTL

Пплазмида неконьюгативна.

Описание штамма E.coli HB101/pESG.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы 1,2 х 1,6 x 2,0 мкm, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, споронеобразующие.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, L-агаре -колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, мутные, край ровный. При росте на жидких средах: мясо-пептонном бульоне, L-бульоне- образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 45 град. С при оптимуме pH от 6,8 до 7.5. В качестве источника углерода используют глюкозу и фруктозу. Ацетат не усваивают, нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают, индол не образуют. Уреазная активность не обнаружена.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки устойчивы к ампициллину за счет наличия плазмиды pESG.

Пример 1. Конструирование плазмиды pESG.

В качестве источника вирус-специфических последовательностей использована ранее полученная нами плазмида pMC1, (Вопросы вирусологии, 1991 г. стр. 325-326), состоящая из PvuII-EcoRI фрагмента (5273-8760 п.н.), выделенного из полной кДНК копии HTLV-1 в составе плазмидного вектора pUC19.

Для удобства субклонирования была сконструирована промежуточная плазмида pBE1, содержащая вставку фрагмента генома HTLV-1 с координатами 5273-6120 п. н. по сайтам PvuII BamH1 ч в векторе pUR291.

Заключительная плазмида pESG была получена путем рестрикции плазмида pBE1 ферментом SaiG1. Полученный фрагмент гена env HTLV-1 был сублокирован в составе вектора pUR291 с помощью той же рестриктазы.

Для этого 10 мкг плазмидной ДНК pMC1 инкубировали с 30 ед. BamHi в присутствии буфера "В" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ), содержащего 10 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 5.0 мМ MgCi/2,100 мМ NaCi и 1,0 мМ меркаптоэтанол, в течение 1 ч при 37^oC. Реакционную смесь наносили на 1% агарозный гель, содержащий бромистый этидий в концентрации (0,5 мкг/мл) и проводили электрофорез в трис-ацетатном (TAE) буфере в течение 0,5 ч при 100 В. Далее выделяли нужный фрагмент ДНК с помощью набора "Gene Ciean" фирмы "BiO-101" (США) путем вырезания нужного фрагмента под мягким ультрафиолетом (366 нм) и растворения его в 2-3-хкратном объеме Naj (раствор из набора) при нагревании до 45-50^oC. В расплав геля добавляли 5 мкл суспензии стеклянных шариков, способных иммобилизовть ДНК. Через 5 мин шарики осаждали на центрифуге "Eppendorf" (ФРГ) в течение 2 мин при 10000 об./мин, после чего супернатант удаляли. Осажденные стеклянные шарики ресуспендировали раствором "New" (прилагается в наборе) на 96% этиловом спирте с помощью вортекса. Процедура повторяется трижды, после чего плазмидная ДНК смывается со стеклянных шариков дистиллированной водой в нужном объеме путем ресуспендирования на вортексе и осаждения шариков на центрифуге "Eppendorf" (ФРГ). Супернатант содержит искомую ДНК.

Три мкг вектора pUR291 инкубировали с 30 ед. BamH1 в тех же условиях.

Гидролизированная ДНК плазмиды pUR291 (0,5 мкг) и Pvuii-BamHi фрагмент генома HTLV-I из плазмиды pMC1, обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4 (3 000 ед. /мг) фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ) из расчета 1 мкл фермента на 0,5 мкг ДНК. Состав десятикратного лигазного буфера: Tris-HCi 660 mM, MgCi/2,50 мМ, DTE 10 мМ, ATP 10 мМ, pH 7.5. Инкубацию проводили в течение 10 ч при 12^oC

Полученный препарат использовали для трансформации клеток E.coIi HB101 хлоркальциевым методом. Трансформированные клетки подращивали 1,5 ч и высевали на агаризованную среду, содержащую L-бульон с ампициллином. Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 18ч при 37^oC, анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозе с добавлением 0,5 мкг/мл бромида этидия. Были отобраны клоны, молекулярная масса которых больше, чем у исходного вектора pUR291. Полученная плазмида, в которой ориентация гена env HTLV-I совпадала с рамкой считывания гена бета-галактозидазы, (что определяли гидролизом ДНК ферментом BamHI), была обозначена pBE1.

Клетки бактерий E.coIi HB101, содержащие плазмидную ДНК pBE1, выращивали в 200 мл бульона до титра 1000 млн. клеток/мл. Клетки осаждали центрифугированием (5000g, 5 мин, 4^oC) и ресуспендировали в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона X100, 50 mM ЭДТА pH 8,0 и 10 mM Tris-HCI H 8,0. Далее добавляли 2,5 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/мл, быстро перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин. Полученный лизат центрифугировали (20 000g, 30 мин, 4^oC) и ДНК из супернатанта осаждали равным объемом изопропанола. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием (12 000g, 20 мин,2 ^oC) и ресуспендировали в 5 мл 10 mM Tris-HCI буфера, pH 8,0.

Синтез заключительной плазмиды pESG в прямой ориентации проводили следующим образом: 10 мкл плазмиды pBE1 гидролизировали форментом SaIG1 в присутствии буфера "Н" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ), состоящего из 50 мМ Tris-HCI с pH 7.5, 10mM MgCI, 100 mM NaCI и 1,0 mM DTE в течение 1ч при 37 ^oC. Для лигирования использовали выделенный SaiG1 фрагмент гидролизированной плазмиды pBE1 и лианезированную тем же ферментом ДНК плазмидного вектора pUR291 с сохранением рамки считывания клонированного гене и бета-галактозидазы.

Сам процесс лигирования проводили по методике, приведенной выше. Лигированный материал трансформировали в компетентную культуру E.coIi HB101. Выросшие на агарозной среде колонии в присутствии ампициллина засеивали L-бульон с той же концентрацией антибиотика. Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 18 ч при 37^oC, анализировали с помощью электрофореза. Были отобраны клоны, молекулярная масса которых больше, чем у исходного вектора pUR291.

Для выбора искомой плазмиды был проведен анализ способности отобранных плазмид синтезировать гибридные белки молекулярной массой 133,5 кДа, содержащие вирус-специфические последовательности области env.

Пример 2. Анализ уровня синтеза гибридного белка, обладающего антигенными свойствами E.coIi HB101/pESG.

Анализ белков в лизатах клеток E.coIi HB101, содержащих гибридную плазмиду pESG, проводили следующим образом. Два мл суспензии клеток E.coIi HB101, содержащих плазмиду pESG, выросших в течение 18 ч из отдельной колонии до концентрации 2000 млн. клеток/мл в L-бульоне, содержащем ампициллин, осаждали центрифугированием (12000g, 1 мин) и ресуспендировали в 200 мкл буфера, содержащего 50 mM трис HCI pH 7,8, 2,5% додецилсульфата натрия, 10% глицерина, 0,7% -меркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кипятили 5 мин на водяной бане с последующим анализом методом электрофореза. В лизатах бактерий, содержащих плазмиду pESG, обнаружен дополнительный белок с мол. мас. 133,5 кДа. (фиг.2А). Антигенную активность белка с мол. мас.133,5 кДа анализировали с помощью метода иммуноблота (фиг. 2Б). Полученный гибридный белок обладал антигенной активностью HTLV-I. Уровень синтеза гибридного белка составлял не менее 20% от тотального клеточного белка.

Изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 200 350 мг белка, обладающего антигеными свойствами HTLV-I.

Аминокислотный профиль полученного гибридного белка (485 аминокислот (а. к. )) представлен в следующем ассортименте: 339 а.к. бета-галактозидазы (полная последовательность бета-галактозидазы без одного аминокислотного остатка), 2 а.к. кодируемые начальным фрагментом полилинкерной последовательности векторной плазмиды pUR291, 142 а.к. представляют собой фрагмент, кодируемый геном env HTLV-I, а именно иммуногенный фрагмент белка gp 46 и 2 а. к. кодируемые заключительным фрагментом полилинкера pUR291 (терминатор), (фиг.3).

Пример 3. Демонстрация возможности использования целевого продукта для создания диагностикума на HTLV-I.

Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 2, разделяли методом электрофореза в ПААГе и анализировали методом иммуноблота с помощью сыворотки пациента, инфицированного HTLV-I. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду pESG, обнаружена дополнительная полоса, специфически реагирующая с антителами к HTLV-I. В препарате, использовавшемся в качестве контроля, приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор pUR291, такая полоса не идентифицирована.

Таким образом плазмида pESG детерминирует в клетках E.coIi синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков HTLV-I. Следовательно, созданную плазмиду и штамм-продуцент гибридного белка возможно использовать для создания лабораторных тест-систем на выявление антител к HTLV-I.