способ получения амида

Формула изобретения

Способ получения амида, содержащего 2 4 атома углерода, включающий обработку водного раствора соответствующего нитрила при pH 6 9 микробиологической субстанцией, содержащей нитрилгидратазу Pseudomonas chlororaphis В 23, отличающийся тем, что для обработки субстрата используют культуру или суспензию клеток культуры микроорганизма, трансформированного рекомбинантным вектором, содержащим ген нитрилгидротазы Pseudomonas chlororaphis В 23.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения амидов с использованием трансформанта, содержащего ген, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, гидратирующей нитрилы в амиды, или нитрилгидратазы, полученной из культуры трансформанта.

Нитрилгидратазы или нитрилазы известны как фермент, который гидратирует нитрилы в амиды; микроорганизмы, которые продуцируют нитрилгидратазу, включают микроорганизмы, которые принадлежат роду Bacillus; роду Bacteridium, роду Micrococcus и роду Brevibacterium (см. JP-В-62-21517/1989, патент США N 4001081), роду Coryne-bacterium и роду Nocardia (см. JP-В-56-17918/1989, патент США N 4248968), роду Paeudomonas (см. EP-A-0093782, JP-B-59-37951/1984, патент США N 4637982), роду Arthrobacter, роду Rhodococcus и роду Microbacterium (см. JP-A-61-162193/1986, EP-A-0188316) и Rhodococcus rhodochrous (см. JP-A-2-470/1990, EP-A-030 7926).

Нитрилгидратаза использовалась для гидратации нитрилов в амиды. В соответствии с настоящим изобретением с использованием приемов рекомбинантной ДНК конструируются микроорганизмы, содержащие несколько копий рекомбинантной ДНУК, кодирующей нитрилгидратазу. Рекомбинант продуцирует значительные уровни нитрилгидратазы по сравнению с известным уровнем техники.

В соответствии с настоящим изобретением для продуцирования нитрилгидратазы используют ген, полученный из Pseudomonas chlororaphis B23, описанный в патенте США N 4637982. Заявитель выделил ген, кодирующий нитрилгидратазу, вставил ген в соответствующий плазмидный вектор и трансформировал соответствующего хозяина этой рекомбинантной плазмидой, получая таким образом траснформант, продуцирующий нитрилгидратазу.

Настоящее изобретение относится к способу получения амидов, который включает гидратирование нитрилов с использованием нитрилгидратазы, а также культивирование траснформанта и гидратирование нитрилов с использованием полученной в результате культуры, суспензии клеток или выделенного из них материала.

Настоящее изобретение описывается подробно следующим образом.

1. Изоляция и очистка нитрилгидратазы и частичный анализ последовательности аминокислот нитрилгидратазы.

Нитрилгидратазу изолируют из Pseudomonas chlororaphis 23 и подвергают очистке и разделяют на и -субблоки, используя ЖХВД (жидкостную хроматографию под высоким давлением). Определяют часть аминокислотной последовательности субблоков (фиг. 1).

2. Получение ДНК-зонда для гена нитрил- гидратазы ДНК-зонд получают из штамма JM105/py UK121 (FERM BP-1937), как это описано в JP-A-2-119778/1990, благодаря высокой степени гомологичности в аминокислотной последовательности между b-субблоком нитрилгидратазы Rhodococcus вида N-744, описанным в вышеупомянутой заявке, и соответствующим b-субблоком Pseudomonas chlororaphis B23. Плазмиду py UK121, содержащую ген нитрилгидратазы, полученный из Rhodococcus вида N-744, приготавливают из культуры JM105/py UK121. ДНК py UK121 переваривают при помощи ферментов Sph1 и Sal1. Фрагмент Sph1 Sal1 содержит ген нитрилгидратазы (фиг. 2) Rhodococcus вида N-744. ДНК-фрагмент метят радиоизотопом, чтобы получить зонд.

3. Обнаружение ДНК-сегмента, содержащего ген нитрилгидратазы из хромосомы Pseudomonas chlororaphis B23.

Хромосомную ДНК получают из культуры Pseudomonas chlororaphis B23. Хромосомную ДНК переваривают ферментами рестрикции и подвергают гибридизации с зондом, описанным в (2), используя процедуру гибридизации по Саузерну (Саузерн Э.М. J. Mol. Biol. т. 98, с. 503/1975). Отбирают два ДНК-фрагмента различной длины.

4. Конструкция рекомбинантной плазмиды.

Рекомбинантную плазмиду конструируют при помощи вставки фрагмента хромосомной ДНК, полученной в (3) в плазмидный вектор.

5. Трансформация и отбор трансформанта, содержащего рекомбинантную плазмиду.

Трансформанты получают с использованием рекомбинантной плазмиды, описанной в (4). Трансформант, содержащий рекомбинантную плазмиду, подвергают селекции с использованием зонда, описанного в (2), в соответствии с процедурой гибридизации колоний (Р. Брюс Уоллес и др. Nucl. Acid Res. 9 с. 879/1981). Кроме того, присутствие гена нитрилгидратазы в рекомбинантной плазмиде подтверждают при помощи процедуры гибридизации по Соузерну. Отобранные таким образом плазмиды обозначают ppCN1 и ppCN3.

6. Изоляция и очистка ДНК плазмиды и составление карты рестрикции.

ДНК плазмиды ppCN1 и ppCN3, описанных в (5), изолируют и подвергают очистке. Составляют карту рестрикции ДНК (фиг. 3), чтобы определить область, содержащую ген нитрилгидратазы.

7. Анализ ДНК-последовательности.

Дополнительный сегмент вставленного ДНК-фрагмента в ppCN1 и ppCN3 расщепляют с использованием соответствующего фермента рестрикции. Вставленный ДНК-фрагмент затем используют для анализа последовательности. Нуклеотидная последовательность ДНК-фрагмента (фиг. 4) показывает, что она содержит последовательность, выведенную из аминокислотной последовательности, описанной в (1).

8. Вставка ДНК-фрагмента в вектор экспрессии и трансформация.

ДНК-фрагмент вырезают из ppCN1 и ppCN3, используя соответствующие ферменты рестрикции. Эти два фрагмента подвергают легированию и вставляют в вектор экспрессии pUC19. Эту конструкцию используют для трансформации E. Coli JM105 (Амершем) и этот трансформант обозначают через JM105/ppCN4.

9. Продуцирование нитрилгидратазы с использованием трансформанта и превращение нитрилов в амиды.

Культивируют трансформант, описанный в (8). Бактериальные клетки смешивают с нитрилом субстратом нитрилгидратазы и получают соответствующим амид.

Pseudomonas chlororaphis B23 сдан на хранение в Исследовательский институт ферментации (Агентство по промышленной науке и технологии) и ему присвоен шифр хранения FERM BP-187. Трансформатор JM105/ppCN4 и сдан на хранение в тот же институт и ему присвоен шифр хранения FERM BP-2779.

Любой вектор, включающий плазмидный вектор (например pAT 153, pMP 9, pHC 624, pKC 7 и т. д. ), фаговый вектор (например Spt 11 (Тойобо), Чарон 4А (Амершэм) и т.д.), можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Ферменты, которые можно при этом использовать, включают Sal1, Sac1, BamH1, Sph1, EcoR1, Pst1 и т.п. (производятся промышленностью фирмы Такара Шузо). Самых разнообразных хозяев можно использовать для трансформации, например E. Coli JV105 и TG1 (но ими не исчерпывается список). Культурной средой для трансформанта может быть любая среда, которую в общем случае используют для этих целей в этой области техники.

Превращение нитрилов в амиды осуществляют с использованием культуры трансформанта, изолированных бактериальных клеток или их материала.

Соответствующие нитрилы настоящего изобретения включают те, которые содержат 2 4 атома углерода, такие, например, как ацетонитрил, пропионитрил, акрилонитрил, метакрилонитрил, н-бутилонитрил и изобутилонитрил, причем акрилонитрил является предпочтительным.

На фиг. 1 показана N-терминальная аминокислотная последовательность a- и -субблоков нитрилгидратазы, полученной с использованием Pseudococcus chlororaphis B23; на фиг. 2 ДНК-последовательность гена нитрилгидратазы Rhodococcus вида N-744, использованная в качестве ДНК-зонда; на фиг. 3 - частичные карты рестрикции рекомбинантных плазмид, ppCN1, ppCN4 и ppCN3; на фиг. 4 нуклеотидная последовательность ДНК-вставки в ppCN3, полученная из Pseudococcus chlororaphis B23, и выведенная аминокислотная последовательность.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность a и -субблоков нитрилгидратазы, полученные из Pseudomonas chlororaphis B23. Ген, кодирующий нитрилгидратазу, вставляют в вектор экспрессии, а рекомбинантный вектор используют для трансформации. Трансформант содержит несколько копий гена и продуцирует более высокие констрации нитрилгидратазы по сравнению с известными, используемыми для этих целей микроорганизмами.

Настоящее изобретение описано подробно в проводимом ниже примере, который никоим образом не следует рассматривать в качестве его ограничения.

В этом примере используют следующие сокращения.

ТЕ: Трис/HCl (10 мМ; pH 7,8), ЭДТА (1 мМ, pH 8,0).

TNE: Трис/HCl (50 мМ; pH 8,0), ЭДТА (1 мМ, pH 8,0), NaCl (50 мМ).

STE: Трис/HCl (50 мМ; pH 8,0), ЭДТА (5 мМ, pH 8,0), сахароза (35 мМ),

Среда 2 х УТ: 1,6% триптон; 1,0% экстракт дрожжей, 0,5% NaCl.

Пример.

1. Изоляция и очистка нитрилгидратазы и анализ аминокислотной последовательности части нитрилгидратазы.

Pseudomonas chlororaphis B23 культивировали в среде (10 г/л сахарозы, 4 г/л метакриламида, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л MgSO₄ 7H₂O, 0,01 г/л FeSO₄ 7H₂O, pH 7,0) при температуре 25^oC с течение 28 ч. Бактериальные клетки собирали, 100 г бактериальных клеток разрушали и фракционировали при помощи сульфата аммония. Пробу подвергали диализу и диализат подвергали центрифугированию. Верхний слой удаляли и загружали на хроматографические колонки ДЕАЕ-Сефацел, октил-Сефароза КЛ-4Б, Фенил-Сефароза КЛ-4Б и Сефадекс-1-150. Активные фракции собирали и подвергали диализу. Диализат, содержащий фермент, загружали на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (Сеншу Пак ВП-304-1251, Сеншу Кагаку) и получали два субблока ( a и ). N-терминальную аминокислотную последовательность a_ и -субблоков определяли с использованием анализатора аминокислотных последовательностей (фирмы Апплайед Биосистема, модели 4704). N-терминальные аминокислотные последовательности a и -субблоков приведены на фиг. 1.

2. Получение ДНК-зонда для гена нитрилгидратазы.

E. Coli JM105, содержащую pYUK121 (FERM BP-1937), культировали в 100 мл среды 2 х УТ, содержащей 50 мг/мл ампициллина, при температуре 30^oC в течение ночи (12 ч). Бактериальные клетки собирали и в клетки добавляли TNE. Суспензию клеток затем подвергали центрифугированию. К осадку добавляли 8 мл STE и 10 мг лизоцима. Смесь инкубировали при 0^oC в течение 5 мин, затем добавляли 4 мл 0,25 М ЭДТА. Далее, добавляли в смесь при комнатной температуре 2 мл 10% ДСН (додецил сульфата натрия пер.) и 5 мл 5М NaCl. Полученную в результате смесь выдерживали при температуре 0 4^oC в течение 3 ч, а затем подвергали ультрацентрифугированию. К супернатанту добавляли 1/2 объема 30% ПЕГ 6000. Смесь выдерживали при 0 4^oC в течение ночи (12 ч) и подвергали центрифугированию. К осадку добавляли TNE, чтобы получить объем 7,5 мл, а затем в суспензию добавляли CsCl. Смесь подвергали центрифугированию, чтобы удалить протеины. Далее, к супернатанту добавляли 300 500 мг/мл бромида этидия. Смесь переносили в пробирку для центрифугирования. Пробирку запаивали, а затем подвергали ультрацентрифугированию. ДНК экстрагировали, используя перистальтический насос. В экстракт, чтобы удалить бромид этидия, добавляли несколько большее, чем равное, количество изопропилового спирта, насыщенного водой. Пробу подвергали диализу против ТЕ. Получали примерно 3 мл очищенной pyUK121.

pyUK121 ДНК переваривали ферментами Sph1 и Sal1, получая в результате ДНК-фермент в 2,07 тысяч пар основании (т.п.о.), содержащий ген нитрилгидратазы, полученный из Rhodococcus вида N-744. Фрагмент метили радиоизотопом 32P, чтобы получить зонд. Нуклеотидная последовательность зонда приведена на фиг. 2.

3. Получение ДНК-фрагмента, содержащего хромосомный ген нитрилгидратазы.

Pseudomonas chlororaphis B23 культивировали в 100 мл среды, описанной в (1). Бактериальные клетки собирали и осадок промывали при помощи TNE. Затем осадок суспендировали в 10 мл TE. В суспензию добавляли 4 мл 0,25 М ЭДТА, 10

20 мг лизозима, 10 20 мг ахромопротеазы и 10 мл 10% ДСН. Суспензию инкубировали при температуре 37^oC в течение 3 ч. В суспензию добавляли 15 мл фенола (60^oC). Смесь инкубировали при температуре 60^oC в течение 15 мин, а затем центрифугировали. В 15 мл супернатанта добавляли 0,7 мл 2,5 М ацетата натрия и диэтиловый простой эфир и смесь центрифугировали. Верхний слой сливали, а к нижнему добавляли два объема этанола и ДНК удаляли стеклянным стержнем. ДНК промывали в течение 5 мин при помощи смеси TE: этанол 2:8 и 0,10 (o/o). ДНК затем снова суспендировали в 2 4 мл TE (37^oC), 10л смеси PнКазы А и Т₁ добавляли в суспензию и смесь инкубировали при температуре 37^oC. В смесь добавляли равное количество фенола, а затем подвергали центрифугированию. К 2 4 мл супернатанта добавляли больше, чем равное, количество простого эфира, подвергали центрифугированию. После центрифугирования верхний слой отбрасывали. Нижний слой подвергали диализу относительно 2лTE, содержащего небольшое количество хлороформа, в течение ночи, а затем диализу относительно свежего TE в течение 3 4 ч. Получали 4 мл неочищенной хромосомной ДНК. Переваривание ферментом хромосомной ДНК осуществляли следующим образом:

(a)2 л SacI+3 л реакционного буфера (10x)+15 л хромосомной ДНК + 10л TE;

(b) 2 лBamHI+2 лSalI+3 л реакционного буфера (10x)+15 л хромосомной ДНК + 10 л TE.

Способ инкубировали при температуре 37^oC в течение 1 ч, а затем подвергали электрофорезу на геле агарозы при разности потенциалов 60 В в течение 3 ч. Гибридизацию по Саузерну хромосомной ДНК осуществляли с использованием зонда, описанного в (2). Обнаруживали сильно гибридизующиеся фрагменты примерно 4,6 т.п.о. и 4,7 т.п.о.

15 л хромосомной ДНК переваривали при помощи Sac1 BamH1 и Sal1 и подвергали электрофорезу на геле агарозы, как это было описано выше. ДНК-фрагменты в 4,6 т.п.о. и 4,7 т.п.о. вырезали из геля и переносили в три объема 8М NaClO₄. Раствор наносили каплями на фильтровальную бумагу CF/C (ватман) (диаметр 6 мм). На фильтровальную бумагу добавляли десять капель (~100 л) TE, содержащего 6М NaClO₄, и десять капель (~100 л) 95% этанола. Затем бумагу сушили воздухом и помещали в 0,5 мл пробирку Эппендорфа. В пробирку добавляли 40 л TE и все это инкубировали при температуре 37^oC в течение 30 мин. Затем пробирку центрифугировали, получали примерно 40 л супернанта, который содержал ДНК-фрагмент размером 4,6 кв и 4,7 т.п.о. содержащие хромосомный ген нитрилгидратазы.

4. Вставка хромосомного ДНК-фрагмента в вектор.

а) ДНК-фрагмент в 4,6 т.п.о.

2 л Sal1, 3л реакционного буфера (10 х) и 10 мл TE добавляли в 10 л ДНК pUC18. Смесь инкубировали при температуре 37^oC в течение часа. 2 л 0,25 М ЭДТК добавляли в смесь, чтобы прекратить реакцию. Затем в смесь добавляли 7 л 1 М Трис-HCl (pH 9) и 3 л БЩФ (бактериальной щелочной фосфатазы).

Смесь инкубировали при 65^oC в течение 1 ч. Затем в смесь добавляли TE, чтобы довести общий объем до 100 л. Смесь экстрагировали трижды равным количеством фенола. В экстракт добавляли равное количество простого эфира. К нижнему слою добавляли 10 л 3Н ацетата натрия и 250 л этанола. Смесь инкубировали при температуре -80^oC в течение 30 мин, подвергали центрифугированию, сушили и снова суспендировали в TE.

Полученные таким образом 5 л ДНК pUC18 и ДНК 40 л ДНК-фрагмента в 4,6 т. п.о. описанного в (3), смешивали. В смесь добавляли 6 л буфера лигирования, 6 л АТФ (6мг/мл) и 3 л ДНК Т4-лигазы. Смесь инокулировали при температуре 4^oC в течение ночи (12 ч), чтобы получить рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК-фрагмент в 4,6 п.п.о. в Сайте Sac1 в pUC18.

в) ДНК-фрагмент в 4,7 т.п.о.

pUC18 переваривали при помощи BamH1 и Sal1. ДНК-фрагмент в 4,7 т.п.о. вставляли в Сайт BamH1 Sal1 в pUC18 точно также, как это описано в (4) (а). Получали рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК-фрагмент в 4,7 кб в Сайте BamH1 Sal1.

5. Трансформация и отбор трансформантов.

E. Coli JM105 (Амершэм) прививали на 10 мл среды 2 х УТ и инкубировали при температуре 37^oC в течение 12 ч. После инкубирования полученную в результате культуру добавляли в свежую среду 2 х УТ до концентрации 1% и смесь инкубировали при 37^oC в течение 2 ч. Культуру подвергали центрифугированию и осадок суспендировали в 5 мл холодного 50 мМ CaCl₂. Суспензию помещали в температуру 0^oC на 40 мин, а затем подвергали центрифугированию. К осадку в отдельной пробирке добавляли 0,25 мл холодного 50 мМ CaCl₂ и 60 л каждой из рекомбинантных плазмид, полученных в (4)(а) и (в). Смесь инкубировали при 0^oC в течение 40 мин, подвергали термическому шоку до 42^oC в течение 2 мин, помещали в температуру 0^oC на 5 мин и добавляли в 10 мл среды 2 х УТ. Смесь инкубировали при 37^oC в течение 90 мин при встряхивании, затем центрифугировали. Осадок суспендировали в 1 мл среды 2 х УТ и 10 л суспензии наносили на агаровую пластинку 2 х УТ, содержащую 50 л/мл ампициллина. Пластинку инкубировали при 37^oC. Колонию выращивали на пластинке, затем подвергали селекции методом гибридизации колонии. Колонию переносили на нитроцеллюлозный фильтр и переваривали. ДНК фиксировали на фильтре и гибридизировали с зондом, описанным в (2). Фильтр подвергали авторадиографии и отбирали рекомбинантную колонию. Кроме того, присутствие гена нитрилгидратазы в трансформанте подтверждали в соответствии с процедурой гибридизации по Саузерну.

6. Изоляция и очистки рекомбинантной плазмиды и составление карты рестрикции вставленных ДНК-фрагментов.

Трансформант, выбранный, как это описано в (5), выращивали в 100 мл среды 2 х УТ, содержащей 50 г/мл ампициллина при температуре 37^oC в течение ночи (12 ч). Бактериальные клетки собирали и в клетки добавляли TNE. Клетки собирали снова центрифугированием и в клетки добавляли 8 мл STE и 10 мг лизоцима. Смесь инкубировали при 0^oC в течение 5 мин. В смесь добавляли 4 мл 0,25 М ЭДТА, 2 мл 10% ДСН (при комнатной температуре) и 5 мл 5 М NaCl. Смесь инкубировали при 0 4^oC в течение 3 ч и подвергали ультрацентрифугированию. К супернатанту добавляли 1/2 объема 30% ПЕГ 6000. Смесь инкубировали при температуре 0 4^oC в течение ночи (12 ч) и снова центрифугировали. TNE добавляли к осадку до объема 7,5 мл. В суспензию добавляли CsCl. Суспензию центрифугировали, чтобы удалить протеины. Далее, в супернатант добавляли 300 500 мг/мл бромида этидия и смесь переносили в пробирку для центрифугирования. Пробирку запаивали нагреванием и подвергали ультрацентрифугированию. кккДНК удаляли, используя перестальтический насос. В кккДНК, чтобы удалить бромид этидия, добавляли несколько больше, чем равное количество изопропилового спирта, насыщенного водой. Пробу ДНК подвергали диализу относительно TE, что приводило к образованию примерно 3 мл рекомбинантной ДНК. Полученную таким образом рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК-фрагмент в 4,6 т.п.о. переваривали как ppCN1 (рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК-фрагмент, в 4,5 т.п.о. переваривали как ppCN3).

Эти ДНК, выделенные из плазмид, переваривали при помощи EcoR1, BamH1, Pst1 и Sac1 и Sal1 и составляли карты рестрикции, которые приведены на фиг. 3.

7. Анализ ДНК-последовательности.

Расположение гена нитрилгидратазы в ДНК-фрагментах ppCN1 и ppCN3 определяли при помощи рестрикционной карты и с использованием процедуры гибридизации по Саузерну, основываясь на этих результатах, анализировали ДНК-фрагмент BamH1 Hinc1 при помощи процедуры Сангера (Сангер Ф. Science, т.214, с. 1205 1210, 1981), используя вектор фаза М13. На фиг. 4 приведен ДНК-фрагмент в 2 546 т.п.о. из Pseudomonas chlororaphis B23.

Полная нуклеотидная последовательность, выведенная из аминокислотной последовательности, определенной в (1), была обнаружена в последовательности в соответствии с описанием, приведенным выше. Анализ последовательности также обнаруживал, что этот ДНК-фрагмент содержал последовательность, кодирующую и -субблоки.

8. Вставка ДНК-фрагмента BamH1 HicI1 в вектор экспрессии и трансформация.

Фрагмент Sph1 BamH1 в 2,2 т.п.о. в ppCN1 и фрагмент BamH1 Sal1 в 4,7 т. п. о. в ppCN3 расщепляли и оба фрагмента подвергали лигированию (фиг. 3). Фрагмент после лигирования вставляли в сайт Sph1 Sal1 вектора экспрессии pUC19 в полученную конструкцию обозначали как ppCN4.

E. Coli JM105 трансформировали при помощи ppCN4 точно так же, как это делали в (5), и трансформант обозначали через JM105/ppCN4/FERM BP-2779.

9. Продуцирование нитрилгидратазы с использованием трансформанта и превращение нитрилов в амиды с использованием нитригидратазы.

JM105/ppCN4 высевали в 20 мл среды 2 х УТ, содержащей 50 г/мл ампициллина, и инкубировали при температуре 26,5^oC в течение ночи (12 ч). 100 л, полученной в результате культуры добавляли в 10 мл среды 2 х УТ/50 г/мл ампициллина, 50 мг/л FeSO₄7H₂O, 10 мг/л MgSO₄ 7H₂O, 1 мг/л пирролохинолинхинона. Эту смесь инкубировали при 26,5^oC в течение 5 ч. В смесь добавляли IPTG до финальной концентрации 1 мМ. Смесь инкубировали при 26,5^oC в течение 10 мин. После сбора клеток клетки суспендировали в 5 мл 1/20 М фосфатного буфера (pH 7,7). В 0,1 мл суспензии добавляли 10 л раствора субстрата (1М акрилонитрила). Смесь инкубировали при температуре 20^oC в течение 20 мин. В качестве контрольного испытания использовали смесь, полученную при помощи аналогичной процедуры, что была описана выше, но из E. Coli JM105. Реакционную смесь испытывали на присутствие акриламида (продукта ферментной реакции) и акрилонитрила, используя ЖХВД. Акриламид, но не акрилонитрил обнаруживали в реакционной смеси JM105/ppCN4 в то время, как акрилонитрил, а не акриламид обнаруживали в реакционной смеси JM105.1