декапептид, обладающий противоопухолевой активностью
Классы МПК: | C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот |
Автор(ы): | Власов Г.П., Буров С.В., Семко Т.В. |
Патентообладатель(и): | Институт высокомолекулярных соединений РАН |
Приоритеты: |
подача заявки:
1993-05-27 публикация патента:
20.07.1997 |
Использование: в биохимии и медицине. Сущность изобретения: декапептид формулы: H-Pro-DPhe-Pro-Ser-Tyr - DLys-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 синтезирован твердофазным методом с использованием пептидного синтезатора NPS-400 на 4-метилбензгириламинополимере, производных аминокислот L-ряда; N-трет-бутилоксикарбонил глицин, N-трет - бутилоксикарбонил-NG- /мезитилен-2-сульфо/аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил -0-/3-бромбензил/тирозин и производных аминокислот Д-ряда; N - трет-бутилокси -карбонил- N -/2-хлорбензилоксикарбонил/-D-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-D-фенилаланин, для очищения пептида от смолы использована трифторметансульфокислота. 3 табл.
Рисунок 1
Формула изобретения
Декапептид формулы H Pro D Phe Pro Ser Tyr D Lys Leu - Arg Pro Gly Nh2, обладающий противоопухолевой активностьюиОписание изобретения к патенту
Изобретение относится к химии пептидов, точнее к декапептиду, аналогу рилизинг-фактора лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов - люлиберина, обладающего противоопухолевой активностью на экспериментальных моделях гормон-зависимых опухолей. Декапептид имеет следующую общую структуру:H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Изобретение может стать основой для создания лекарственной противоопухолевой формы. Известно, что при терапии ряда онкологических заболеваний (опухоли яичников, простаты, молочной железа, ряда хондросарком и остеосарком) в качестве лекарственных средств используют аналоги пептидных гормонов, в частности, люлиберина (1). Люлиберин амид линейного декапептида:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Основной его функцией в организме является регуляция выделения лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, которые, в свою очередь, влияют на уровень половых стероидных гормонов. Синтезировано множество агонистов и антагонистов люлиберина (см. табл. 1). Как те, так и другие могут применяться в онкологии, поскольку они способны снижать уровень гормонов и влиять таким образом на рост гормонзависимых опухолей. Агонисты вещества, которые связываются с люлибериноновыми рецепторами и вызывают люлиберино-подобный эффект. При длительном введении больших доз высокоактивных агонистов развивается эффект парадоксальной ингибиции, связанный с уменьшением количества соответствующих рецепторов. Антагонисты также связываются с люлибериновыми рецепторами, но люлиберино-подобного эффекта не вызывают и являются конкурентными ингибиторами люлиберина. Такие агонисты как: "Декапептил"-pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg- Pro-Gly-NH 2 (2,6); "Бусерилин"-pGlu His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt (3, 6); "Лейпролид" -pGlu-His-Trp-Ser- Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (3); "Золадекс" pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly (4) производятся в промышленности и используются в клинике. В качестве возможных противоопухолевых препаратов описаны и антагонисты люлиберина (9): Ac-p-F-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D- Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2, Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser- Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2. (При написании структур использованы сокращения аминокислот, рекомендованные IUPAC-IUB (6), а также: NHEt этиламид, Aza-Gly-аза-глицин, D-Ser(But)-O-(трет-бутил)-D серин, Ac ацетил, p-F-D-Phe - пара-фтор-D-фенилаланин, p-Cl-D-Phe-пара-хлор-D-фенилаланин). Большинство высокоактивных антагонистов люлиберина получают путем множественных замен в последовательности гормона на неприродные аминокислоты и аминокислоты D-конфигурации, что значительно повышает стоимость синтеза. Кроме того, наличие протяженных участков, состоящих из гидрофобных аминокислотных остатков, характерных для такого рода препаратов, приводит к развитию аллергических реакций (N7). Определенным недостатком известных аналогов люлиберина является также наличие остатков триптофана и гистидина, подверженных побочным реакциям. В зависимости от структуры стоимость агонистов или антагонистов люлиберина составляет от 100 до 500 DM за 5 мг (см. каталог "Bachem", 1991 г). Задачей предлагаемого изобретения является полипептид, обладающий высокой биологической активностью и лишенный вышеперечисленных недостатков, то есть не содержащий триптофан, гистидин и не имеющий протяженных участков, состоящих из гидрофобных неприродных аминокислот. Эта задача решалась декапептидом общей формулы:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Prg-Pro-Gly-NH2
Заявленный декапептид синтезировали твердофазным методом с использованием стандартных приемов. Анализ известного уровня науки и техники показал, что заявленный декапептид является новым и отличается по структуре от наиболее близких аналогов:
H-Pro-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (заявленный декапептид);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(люлиберин);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,
aGlu-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (два последних пептида из каталога фирмы "Bachem", 1991)
Таким образом, можно утверждать, что вещество соответствует требованию "новизна". Заявленный декапептид в отличие от большинства известных аналогов люлиберина, имеющих на N-конце пироглутаминовую кислоту или защищенный аминокислотный остаток, содержит в первом положении свободный пролин. Получение высокоактивного вещества при подобной модификации невозможно было предсказать заранее, поскольку существует мнение, что свободный N-конец в такого рода препаратах приводит к снижению биологической активности (8), что доказывает неочевидность предлагаемого решения. Нами было показано, что рассматриваемый декапептид обладает высокой противоопухолевой активностью при терапии рака простаты у крыс до 84% торможения роста опухоли в дозе 100 мкг/кг в день, что соответствует 25 мкг на животное. В том же тесте и той же дозе коммерческий препарат "бусерилин" показал торможение роста опухоли 63% Было найдено также, что заявленный декапептид оказывает тормозящее воздействие (до 54%) на рак молочной железы у мышей. По литературным данным подобные препараты исследованные на различных моделях рака предстательной и молочной желез эффективны в следующих дозах:
"Декапептил" 25 мкг в день или 25 мкг дважды в день (2, 13)
"Золадекс" 35 мкг в день (препарат вводился по 1 мг 1 раз в 28 дней в биодеградируемых капсулах) (4), "Лейпролид" 10 мкг дважды в день (3), Ac-p-F-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 или Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala- NH2 - по 50 мкг к день (5)
Высокая биологическая активность заявленного декапептида также подтверждает соответствие изобретения требованию "изобретательский уровень". Для подтверждения соответствия заявленного изобретения требованию "промышленная применимость" приводим пример его получения. Синтез H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Синтез проводили твердофазным методом с использованием пептидного синтеза NPS-4000 ("Neosystem", Франция) на 4 метиобензгидриламинополимере той же фирмы. Использовали производные аминокислот L ряда фирмы "Reanal" (Венгрия): N-трет-бутилоксикарбони-O-бензилсерин, N трет-бутилоксикарбониопролин и гидрат N-трет-бутилоксикарбониллейцина; а также производные, полученные нами из аминокислот той же фирмы: N-трет бутилоксикарбонилглицин, N-трет-бутилоксикарбонил-NG-(мезитилен -2- сульфо)-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-O-(3 -бромбензил)тирозин, и производные аминокислот D-ряда: N -трет-бутилоксикарбонил- N -(2 хлорбензилоксикарбонил)-D-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-D-фенилаланин. Для отщепления пептида от смолы использовали трифторметансульфокислоту производства фирмы "Fluka" (Швейцария). Полноту прохождения реакций пептидообразования контролировали с помощью нингидринового теста (9). В том случае, если производилось ацилирование остатка пролина, использовали изатиновый тест (10). Трифторуксусную кислоту и растворители готовили в соответствии с требованиями для твердофазного пептидного синтеза (11), триэтиламин перегоняли над щелочью, а затем над нингидрином. Присоединение первого аминокислотного остатка к полимерному носителю проводили по следующему протоколу:
2 г 4-Метилбензгидриламинополимера с содержанием аминогрупп 0,55 ммоль на 1 г смолы помещали в реактор. После набухания смолы в 20 мл диметилформамида последовательно проводили следующие стадии обработки: 1). Промывка 20 мл диметилформамида 1 минута. 2). Двукратная обработка 20 мл 10% раствора триэтиламина в диметилформамиде в течение 1 и 2 мин. 3). Трехкратная промывка 20 мл диметилформамида по 1 мин. 4). Промывка 20 мл хлористого метилена 1 мин. 5). Заливали в реактор раствор 0,52 г (3,3 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонилглицина в 15 мл хлористого метилена, перемешивали в течение 10 минут и прибавляли 0,517 мл (3,3 ммоль) N,N"-диизопропилкарбодиимида. Перемешивали 2 ч. 6). Трижды промывали 20 мл хлористого метилена по 1 мин. Проводили блокирование непрореагировавших аминогрупп. Для этого: 1). Полимер дважды обрабатывали 20 мл 10% раствора триэтиламина в хлористом метилене в течение 1 и 2 мин. 2). заливали 15,8 мл 10% раствора триэтилена в хлористом метилене и добавляли 1,04 мл (11 ммоль) уксусного ангидрида. Перемешивали 10 мин. 3). промывали 20 мл хлористого метилена 3 раза по 1 мин. Далее все аминокислотные остатки присоединяли в соответствии с протоколом стандартного цикла, состоящего из стадий деблокирования, нейтрализации и конденсации. Протокол деблокирования включает в себя следующие операции: 1). Промывка 20 мл хлористого метилена в течение 1 мин. 2). Двукратная обработка 20 мл 50% раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 1 и 30 мин. 3). Двукратная промывка 20 мл хлористого метилена без перемешивания. 4). Двукратная промывка 20 мл хлористого метилена по 1 мин. Сразу по окончании деблокирования выполняли нейтрализацию: 1). Промывка 20 мл диметилформамида 1 мин. 2) Двукратная обработка 20 мл 10% раствора триэтиламина в диметилформамиде в течение 1 и 2 мин. 3). Трехкратная промывка 20 мл диметилформамида. Затем проводили конденсацию с трехкратным избытком соответствующего симметричного ангидрида аминокислоты в течение 1 2 ч. Чтобы получить симметричный ангидрид, 6 эквивалентов (6,6 ммоль) защищенного производного аминокислоты растворяли в 10 мл хлористого метилена (для растворения N -трет-бутилоксикарбонил-NG-(мезитилен-2-сульфо)аргинина и гидрата N-трет-бутилоксикарбониллейцина необходима добавка диметилформамида), при перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре добавляли 0,517 мл (3,3 ммоль) N,N"-диизопропилкарбодиимида. Через 10 мин хлористый метилен упаривали в вакууме, а остаток растворяли в 10 мл диметилформамида, раствор вносили в реактор. После окончания конденсации пептидил-полимер дважды промывали 20 мл диметилформамида по 1 мин, промывали 20 мл хлористого метилена 1 мин, выполняли тест на полноту прохождения реакции пептидообразования. В случае, если тест показывал наличие непрореагировавших аминогрупп, проводили повторную конденсацию карбодиимидным методом с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Для этого проводили нейтрализацию по представленному выше протоколу и конденсацию в течение 1 2 ч. Чтобы получить активированный карбоксильный компонент, в 10 мл диметилформамида растворяли 3 эквивалента (3,3 ммоль) защищенного производного аминокислоты и 0,446 г 1-гидроксибензотриазола (3,3 ммоль), при охлаждении до 0oC и перемешивании добавляли 0,517 мл N,N"-диизопропилкарбодиимида (3,3 ммоль), через 30 мин вносили в реактор. По окончании конденсации дважды промывали пептидил-полимер 20 мл диметилформамида по 1 мин, промывали 20 мл хлористого метилена 1 мин, выполняли тест на полноту прохождения реакции пептидообразования. В случае необходимости остаточные аминогруппы блокировали уксусным ангидридом, как было описано выше. После присоединения последнего аминокислотного остатка удаляли N-концевую трет-бутилоксикарбонильную группировку в соответствии с протоколом деблокирования, после чего пептидил-полимер высушивали и отщепляли пептид от смолы по следующей методике: к 1 г пептидил-полимера добавляли 1,5 мл тиоанизола, перемешивали на магнитной мешалке 10 мин, затем при охлаждении 0oC приливали 10 мл трифторуксусной кислоты, перемешивали 10 мин. По каплям добавляли 1 мл трифторметансульфокислоты, снимали охлаждение и перемешивали 2 ч при комнатной температуре. Разбавляли реакционную смесь 250 мл охлажденного серного эфира и отфильтровывали осажденный на полимере пептид на фильтре Шотта. Затем смывали пептид с полимера 3 мл трифторуксусной кислоты и высаживали 250 мл серного эфира. Выпавший продукт отфильтровывали, промывали эфиром и сушили в вакууме. Затем пептид обессоливали на колонке с сефадексом G-15 (1,9 x 110 см в 50% уксусной кислоте). Предварительную очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с сефадексом SE C-25 в градиенте пиридин-ацетатного буфера. Получили 0,148 г пептида с чистотой 75% по данным высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии. Окончательную очистку производили с помощью высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии на хроматографе фирмы "Millipore - Waters" (США) в следующих условиях: колонка Delta-Pak C-18 (19 x 300 мм, 15 мкм); элюент 0,01 М трифторуксусная кислота / 22% ацетонитрил, скорость потока 15 мл/мин, детекция при 230 нм. После очистки пептид лиофилизовали. Продукт гомогенен по данным тонкослойной хроматографии и электрофореза. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках фирмы "Merck" (Германия) в системах трет-бутиловый спирт вода уксусная кислота 4:1:1 (Rf 0,13); н-бутиловый спирт уксусная кислота пиридин вода 15:3:10:12 (Rf 0,55); этилацетат пиридин уксусная кислота вода 25:20:6:11 (Rf 0,10)
Электрофорез проводили на бумаге "Filtrak" FN-12 в 2% уксусной кислоте при напряжении 150 В в течение 30 мин. Электрофоретическая подвижность продукта относительно глицина EGly 1,7. Индивидуальность продукта подтверждена высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографией, его чистота составляет более 95% при выходе 0,115 г с 1 г пептидил-полимера, что соответствует 36% от теоретически рассчитанного. Структура пептида подтверждена аминокислотным анализом на аминокислотном анализаторе T 339 M ("Microtechna", Чехословакия). Данные анализа: Gly 1,02 (1); Leu 1,00 (1); Ser 0,95 (1); Pro 3,07 (3); Tyr 1,05 (1); Phe - 1,02 (1); Lys 0,93 (1); Arg 0,93 (1). По данным масс-спектрометрии пептид имеет массу 1160,6 (расчетное значение 1160,3). (Спектр снимали на времяпролетном масс-спектрометре с источником "Электроспрей" в Институте энергетических проблем химической физики). Исследование противоопухолевой активности
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Исследование противоопухолевой активности проводилось в Институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей при Онкологическом научном центре ПАМН на крысах Aci и мышах C3H с опухолями предстательной и молочной желез соответственно. В опытных группах было 6 7 животных, в контрольных в два раза больше. Опухоли третьей генерации (предстательной железы от индуцированного метилхолантреном и тестостероном, молочной от спонтанного рака) перевивались животным под кожу правого бока. Препарат вводился подкожно в дистиллированной воде, крысам в течение 28, мышам 21 дня, в дозах 0,1; 1; 10 и 100 мкг/кг веса животного. Введение начинали через 48 ч после перевивки. Через неделю, 2, 3 и 4 недели после начала лечения опухоли измеряли по трем взаимно перпендикулярным диаметрам, вычисляли объем, находили среднюю величину, процент торможения роста опухоли вычисляли по формуле:
, где Vk и Vo средний объем опухолей в контрольной и опытной группах соответственно. На модели рака предстательной железы был испытан коммерческий препарат "бусерилин" в дозе 100 мкг/кг. Результаты представлены в таблице 3. Протокол изучения цитотоксической активности H-Pro - D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 на культуре клеток карциномы яичников линии CaOv
Препарат H-Pro-D-Phe-Pro-Ser Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 проходил испытания в группе первичного отбора противоопухолевых препаратов НИИ экспериментальной диагностики в терапии опухолей ОНЦ РАМН. Вещество представляло собой лиофилизат, растворимый в воде. В качестве объекта исследования была использована культура опухолевых клеток карциномы яичников человека (линия CaOv). Культуру клеток выращивали на среде 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота, при 37oC. Цитотоксический эффект исследуемых соединений определяли радиометрическим методом по включению 3H-тимидина в клетки линии CaOv по стандартной методике. Вещество считалось цитотоксическим, если величина его CE50 (дозы, препятствующей включению в клетки 50% меченого тимидина по отношению к контролю) не превышала 110-4 М. Результат, представленный в таблице 2, свидетельствует, что цитотоксическая активность исследуемого препарата ниже существующего пограничного критерия.
Класс C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот
Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот