гибридный ген blg-hifn-g для экспрессии гамма-интерферона человека в молочной железе трансгенного животного (варианты)

Формула изобретения

1. Гибридный ген BLG-hIFN-g2 для экспрессии гамма-интерферона человека (h1FN-g) в молочной железе трансгенного животного, имеющий размер 10,2 т.п. о. состоящий из Sal-SnaB1 фрагмента размером 4,7 т.п.о. представляющего собой 5"-фланкирующею последовательность гена бета-лактоглобулина (BLG) овцы; SnaB1-Asu11 фрагмента размером 1,7 т.п.о. представляющего собой часть геномного гена h1FN-g, включающую первый экзон без 113 первых п.о. его нетранслируемой области, первый интрон, второй экзон, второй интрон и часть третьего экзона от его начала до сайта расщеления рестриктазой Asu11; Asu11-BamH1 фрагмента размером 3,8 т.п.о. представляющего собой часть геномного гена h1FN-g, включающую часть третьего экзона от сайта расщепления рестриктазой Asu11 до его 3"-конца, третий интрон, четвертый экзон и часть 3"-фланкирующей последовательности от сигнала полиаденилирования до сайта расщепления рестриктазой Bam H1; Bam H1-Sal1 фрагмента, представляющего собой часть полилинкера плазмиды pUC 18, и содержащий уникальный сайт узнавания рестиктазой SnaB1, введенный в сайт Pvu11 нетранслируемой области первого экзона гена BLG.

2. Гибридный ген BLG-h1FN-g3 для экспрессии гамма-интерферона человека (h1FN-g) в молочной железе трансгенного животного, имеющий размер 9,9 т.п.о. состоящий из Sal1-SnaB1 фрагмента размером 4,7 т.п.о. представляющего собой 5"-фланкирующую последовательность гена BLG; SnaB1-Asu11 фрагмента размером 1,7 т.п.о. представляющего собой часть геномного гена h1FN-g, включающую первый экзон без 113 первых п.о. его нетранслируемой области, первый интрон, второй экзон, второй интрон и часть третьего экзона от его начала до сайта расщепления рестриктазой Asu11; Asu11-BamH1 фрагмента размером 3,5 т.п.о. представляющего собой последовательно расположенные часть третьего экзона от сайта расщепления рестриктазой Asu11 до его 3"-конца, часть четвертого экзона от его начала до стоп-кодона и следующую за указанным кодоном нетранслируемую область гена h1FN-g, часть шестого экзона, шестой интрон, седьмой экзон с сигналом полиаденилирования, следующую за этим сигналом часть 3"-фланкирующей последовательности гена BLG и фрагмент гена BLG от сайта расщепления рестриктазой Pvu11 в первом экзоне до сайта расщепления рестиктазой BamH1 в третьем интроне; и содержащий уникальный сайт узнавания рестриктазой SnaB1, введенный в сайт Pvu11 нетранслируемой области первого экзона гена BLG.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантные ДНК, обеспечивающие экспрессию чужеродных генов (в частности, гена гамма-интерферона человека (hIFN-g)) в молочной железе трансгенных животных.

В настоящее время медицина, сельское хозяйство, пищевая промышленность испытывают потребность в широкомасштабном получении разнообразных белков. Большинство из них не могут быть выделены из природных источников в требуемых количествах из-за низкой концентрации. Кроме того, в связи с опасностью заражения вирусом иммунодефицита и гепатитом стало сложно получать многие препараты, которые ранее выделяли из донорской крови. Проблема получения больших количеств физиологически активных белковых препаратов в настоящее время решается, в основном, за счет экспрессии этих белков в бактериях. Однако полученные таким образом белки не являются гликозилированными, что может отражаться на таких их свойствах, как физиологическая активность, иммуногенность, время полужизни.

Проблему получения гликозилированных белков можно решить, экспрессируя их, например, в культуре клеток млекопитающих, введя в них экзогенную ДНК, кодирующую интересующий белок, встроенную в соответствующий вектор. Однако такие культуры дороги, требуют специального оборудования и сред. Кроме того, концентрация конечного интересующего продукта в культуральной жидкости невелика (несколько мг/л [1]).

Другой подход к решению данной проблемы состоит в получении трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков. Таких животных можно получать, вводя в их геном гибридные гены, состоящие из регуляторных последовательностей одних генов и кодирующих последовательностей других генов. Используя регуляторные элементы генов, обладающих тканеспецифической экспрессией, можно вызвать синтез нужного белка в соответствующем типе ткани.

С экономической точки зрения было бы целесообразно иметь животных-продуцентов, от которых можно получать интересующий белок максимально просто, в больших количествах и в течение длительного времени. Таким условиям удовлетворяют трансгенные животные, секретирующие интересующие белки в кровь или в молоко. Однако наличие в высоких концентрациях чужеродных биологически активных веществ в крови трансгенного животного может негативно влиять на его состояние или даже сделать его жизнь невозможной. Более удобной является экспрессия чужеродных белков в молочной железе трансгенных животных. Обеспечить тканеспецифическую экспрессию интересующих белков в этом органе можно, создавая гибридные гены, в которых последовательность ДНК, кодирующая белок, поставлена под контроль регуляторных последовательностей генов, кодирующих различные белки молока. С этой целью разными авторами были созданы гибридные гены, обеспечивающие секрецию в молоко трансгенных животных урокиназы человека (в концентрации 1 2 мг/мл у трансгенных мышей [2]), тканевого плазминогенного активатора человека (в концентрации 3 мг/л у трансгенных коз [3] ), ₁-антитрипсина (₁ АТ) человека (в концентрации 35 г/л у трансгенных овец [4]) и другие.

Известны гибридные гены, созданные на основе гена бета-лактоглобулина овцы (BLG), предназначенные для синтеза в молочной железе трансгенных животных фактора IX свертываемости крови (FIХ) человека (гибридный ген BLG-FIX [5] ) и ₁ АТ человека (гибридные гены BLG-₁ АТ [4] и ААТВ [6]). В качестве регуляторной области в этих гибридных генах используется 5"-фланкирующая последовательность гена BLG длиной 4,0 т.п.о. Встраивание кодирующей части в этих гибридных генах происходит в нетранслируемую область первого экзона гена BLG по сайту узнавания эндонуклеазой рестрикции Pvu II (сайт Pvu II), который часто встречается в последовательности этого гена, что неудобно при создании других гибридных генов. В гибридных генах BLG-FIX и BLG-₁ АТ, содержащих кДНК ₁AT и FIX, используется сигнал полиаденилирования гена BLG, находящийся в седьмом экзоне, и, следовательно, значительно удаленный от последовательности, кодирующей экспрессируемый белок. В гибридном гене ААТВ используется сигнал полиаденилирования гена ₁-антитрипсина человека и полностью отсутствует кодирующая последовательность гена BLG и его 3"-фланкирующая область [5] Такой подход делает сложным непосредственное использование этого вектора для экспрессии кДНК, что может быть важным в случае, если геномные гены интересующих белков имеют большие размеры.

Описываемые гибридные гены BLG-hIFN-g характеризуются следующими признаками:

обеспечивают экспрессию hIFN-g в молочной железе трансгенных животных;

имеют длину около 10 т.п.о.

состоят из:

Sal I-SnaB I-фрагмента длиной 4,7 т.п.о. представляющего собой 5"-фланкирующую последовательность гена BLG;

SnaB I-Asu II-фрагмента длиной 1,7 т.п.о. представляющего собой часть геномного гена гамма-интерферона человека hIFN-g, включающую первый экзон без 113 первых п. о. его нетранслируемой области, первый интрон, второй экзон, второй интрон и часть третьего экзона;

Asu II-BamH I-фрагмента, представляющего собой в случае гена BLG-hIFN-g2 последовательность, включающую часть третьего экзона, третий интрон, четвертый экзон и часть 3"-фланкирующей последовательности гена hIFN-g,

а в случае гена BLG-hIFN-g3 последовательность, включающую часть третьего экзона, четвертый экзон гена hIFN-g и часть шестого экзона, шестой интрон, седьмой экзон, содержащий сигнал полиаденилирования, часть 3"-фланкирующей последовательности, часть первого экзона, первый интрон, второй экзон, второй интрон, третий экзон и часть третьего интрона гена BLG;

BamH I-Sal I-фрагмента, представляющего собой часть полилинкера плазмиды pUC18;

-содержат:

-уникальный сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции SnaB 1, искусственно введенный в сайт Pvu II нетранслируемой части первого экзона гена BLG.

В патентной и научной литературе не описаны гибридные гены, обеспечивающие экспрессию hIFN-g в молочной железе трансгенных животных. Кроме того, от гибридных генов, построенных на основе регуляторных последовательностей гена BLG овцы, заявляемые гены BLG-hIFN-g2 и BLG-hIFN-g3 отличает более длинная 5"-фланкирующая область гена BLG (длиной 4,7 т.п.о.), а также то, что при создании гибридных генов BLG-hIFN-g2 и BLG-hIFN-g3 в нетранслируемую область первого экзона гена BLG был введен уникальный сайт для рестриктазы SnaB I, позволяющий использовать регуляторные последовательности этого гена для создания гибридных генов, кодирующих любые другие белки. Еще одной особенностью гибридного гена BLG-hIFN-g3 является наличие части гена BLG, несущей сигнал полиаденилирования этого гена, за которым идет кодирующая часть того же гена, представляющая собой фрагмент между сайтами рестрикции Pvu II, находящейся в первом экзоне, и BamH I, находящейся в третьем интроне.

Схемы строения гибридных генов BLG-hIFN-g2 и BLG-hIFN-g3 приведены на фиг. 1.

На фиг. 2 приведена схема создания вектора на основе гена BLG овцы для экспрессии гетерологичных белков в молочной железе трансгенных животных.

На фиг. 3 приведена схема создания гибридного гена BLG-hIFN-g.

На фиг. 4 приведена схема проведения направленного мутагенеза в 5"-нетранслируемой области первого экзона геномного гена hIFN-g с целью создания сайта для рестриктазы SnaB I.

На фиг. 5 приведена схема создания промежуточной конструкции pBBg-mut 1.

На фиг. 6 приведена схема переклонирования геномного гена hIFN-g из плазмиды pBR322 в плазмиду pBRUC318 по сайту BamH I.

На фиг. 7 приведена схема окончательной сборки гибридного гена BLG-hIFN-g2.

На фиг. 8 приведены схемы строения гибридных генов BLG-hIFN-g, BLG-hIFN-g2 и BLG-hIFN-g3.

Способ конструирования гибридных генов BLG-hIFN-g2 и BLG-hIFN-g3 заключается в том, что:

1) из геномной библиотеки овцы в фаге EMBL-3 выделяют клон, содержащий геномный ген BLG овцы. Из ДНК этого клона выделяют Sal I-Xba I-фрагмет, содержащий ген BLG с прилегающими к нему S"- и 3"-последовательностями, и клонируют его в плазмиду pDI (производная плазмиды pBR322, у которой удален ген устойчивости к тетрациклину и вместо него встроен полилинкер из плазмиды pUC18, а сайт для рестриктазы Hind III этого полилинкера уничтожен), получают таким образом плазмиду pBLGI;

Sph I-Hind III-фрагмент плазмиды pBLG1 клонируют по соответствующим сайтам в полилинкер плазмиды pBRUC318 (отличается от плазмиды pD1 сохраненным сайтом Hind III) и получают плазмиду pI1;

в Pvu II сайт Sph I-Hind III-фрагмента, находящийся в нетранслируемой области первого экзона гена BLG, встраивают амплифицированный при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) фрагмент этого гена длиной 616 п.о. содержащий введенный на его 5"-конец сайт для рестриктазы SnaB I и сигнал полиаденилирования гена BLG на своем 3"-конце. Таким образом получают плазмиду pI2;

удаляют сайт для рестриктазы Hind III, введенный на 3"-конец амплифицированного фрагмента, и получают плазмиду pI3;

встраивают в плазмиду p13 по сайтам Sal I и Sph I Sal I-Sph I-фрагмент плазмиды pBLG1 и получают плазмиду pI4;

встраивают в плазмиду pBLG1 по сайтам Hind III и Sal I Hind III-Sal I-фрагмент плазмиды pI4. Получают таким образом плазмиду pBLGvectl;

в SnaB I сайт плазмиды pBLGvectl, созданный в нетранслируемой области первого экзона, встраивают кДНК hIFN-g. Тем самым получают гибридный ген BLG-hIFN-g.

2)- при помощи направленного мутагенеза в нетранслируемой области геномного гена hIFN-g создают сайт для рестриктазы SnaB I;

соединяют по этому сайту 5"-фланкирующую область гена BLG длиной 4,7 т.п.о. с фрагментом длиной 5,5 т.п.о. содержащим геномный ген hIFN-g. Тем самым получают гибридный ген BLG-hIFN-g2.

3) соединяют по сайту Asu II фрагмент Sal I-Asu II гибридного гена BLG-hIFN-g2 и Asu II-BamH I-фрагмент гибридного гена BLG-hIFN-g. Тем самым получают гибридный ген BLG-hIFN-g3.

Создание гибридных генов BLG-hIFN-g2 и BLG-hIFN-g3 иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Создание гибридного гена BLG-hIFN-g.

a. Клонирование гена BLG овцы.

Геномную библиотеку овцы в фаге lEMBL-3 создают как описано в [7] (геномную ДНК выделяют из печени овцы). Для скрининга библиотеки и поиска гена BLG в качестве зондов используют частично перекрывающиеся олигонуклеотиды:

ON1 (5"-GTGGCGTCCAGGCCATCATCGTC-3"),

ON2 (5"-ТТТCATGGTCTGGGTGACGATGATGG-3").

Олигонуклеотиды ON1 и ON2 комплементарны ранее опубликованной последовательности кДНК гена BLG [8]

Для получения радиоактивно меченых зондов берут реакционную смесь, содержащую 67 мМ фосфата калия (pH 7,5), 6,7 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT и по 1 пМ каждого олигонуклеотида, нагревают ее до 70^oC и охлаждают до комнатной температуры в течение 20 минут. После охлаждения добавляют до конечной концентрации 33 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, один из которых мечен в альфа-положении P³² и обладает активностью 10 мкКи/мкл; 1 ед фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.

Гибридизацию радиоактивно меченых зондов с репликами проводят согласно методике, описанной в [9]

Из ДНК фагового клона, с которой гибридизуются зонды, выделяют Sal I-Xba I-фрагмент ДНК, содержащий ген BLG овцы с прилегающими к нему 5- и 3"-последовательностями, длинной 4,7 т.п.о. и 1,6 т.п.о. соответственно. Для этого берут 10 мкг ДНК фага, выделенной как описано в [9] растворенной в 34 мкл H₂O, добавляют 4 мкл 10X буфера H (500 мМ Трис-HCl, 100 мМ MgCl₂, 1M NaCl, 10 мМ DTT, 1 мг/мл бычий сывороточный альбумин, pH 7,5), 2 мкл Xba I (10 ед/мкл), 1 мкл Sal I (20 ед/мкл) и инкубируют 1 час при 37^oC. Образовавшиеся фрагменты ДНК разделяют при помощи гель-электрофореза в 0,6% легкоплавкой агарозе. Кусочек агарозы, содержащий фрагмент ДНК длиной 11,4 т.п.о. вырезают и помещают в 1,5 мл пластиковую пробирку. Фрагмент ДНК выделяют при помощи метода замораживания-оттаивания. Для этого кусочек агарозы выдерживают при -70^oC в течение 10 минут, затем замораживают его при комнатной температуре. Повторяют операцию 3 раза, затем центрифугируют пробирку 3 мин при 10000g на настольной центрифуге Eppendorf и отбирают супернатант, содержащий фрагмент ДНК. Размеры фланкирующих областей определяют при помощи сравнения рестриктной карты выделенного Sal I-Xba I фрагмента с рестриктной картой гена BLG, которая была опубликована ранее [8] Для этого аликвоты, содержащие по 1 мкг ДНК фага, обрабатывают рестриктазами BamH I, Hind III, Sph I, Sal I, Xba I (раздельно), как описано выше, проводят электрофорез в 0,8% агарозном геле и гибридизацию по Саузерну, как описано в [9] используя радиоактивно меченые зонды, получение которых описано выше.

Полученный фрагмент клонируют по сайтам рестриктаз Sal I и Xba I в плазмиду pD1 (плазмида pBR322, в которую встроен по сайтам Hind III и Pvu II полилинкер из плазмиды pUC18, а затем сайт Hind III удален) (фиг. 2). Для этого берут 1 мкг плазмиды pD1, обрабатывают ее рестриктазами Xba I и Sal I и выделяют фрагмент ДНК длиной 2,4 т.п.о. представляющий собой вектор. Берут 50 нг векторной ДНК, 400 нг Sal I-XBa I-фрагмента ДНК длиной 11,4 т.п.о. содержащего ген BLG, 2 мкл 10X буфера для ДНК-лигазы фага T4 (500 мМ Трис-HCl pH 7,8, 100 мМ MgCl₂, 200 мМ DTT, 10 мМ ATP), доводят объем до 19 мкл при помощи H₂O, добавляют 1 мкл лигазы фага T4 (1 ед/мкл) и инкубируют 4 часа при 16^oC.

Полученную плазмиду обозначают pBLG1.

b. Создание векторной ДНК BLGvectl.

По описанной выше методике в плазмиду pBRUC318 клонируют Sph I-Hind III-фрагмент гена BLG длиной 2263 п.о. включающий фрагмент 5"-фланкирующего участка, первые три экзона, первый, второй и часть третьего интрона (фиг. 2).

Полученную плазмиду обозначают pI1.

При помощи PCR с использованием олигонуклеотидов:

ON3 (5"-TACGTAGGTGAGCCCCTGCCGGTGG-3"),

ON4 (5"-AAGCTTCCAGCAAAGACTCAGAAGG-3")

амплифицируют фрагмент гена BLG длиной 616 п.о. включающий часть шестого экзона, шестой интрон и седьмой (нетранслируемый) экзон с сигналом полиаденилирования (фиг. 1). Использование частично комплементарных праймеров ON3 и ON4 обеспечивает введение на 5"-конец амплифицируемого фрагмента сайта для рестриктазы SnaB I, а на 3"-конец сайта для рестриктазы Hind III.

PCR проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 25 мМ Трис-HCl (pH 9,3), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 200 мкМ dATR, dTTP, dGTP, dCTP, 100 мкг/мл желатина, 0,1 нг ДНК pBLG1, по 50 пМ олигонуклеотидов ON3 и ON4, 1 ед Tag I полимеразы, при следующих параметрах температурных циклов:

5 циклов: 94^oC 30 сек.

54^oC 30 сек.

72^oC 1 мин.

25 циклов: 94^oC 30 сек.

65^oC 30 сек.

72^oC 1 мин.

1 мкг плазмиды pI1 подвергают частичному гидролизу рестриктазой Pvu II, как описано в [9] Линеаризованную плазмиду pI1 лигируют с амплифицированным фрагментом. Отбирают клоны, содержащие плазмиду, в которую встраивание фрагмента произошло в Pvu II сайт в нетранслируемой области первого экзона гена BLG в прямой ориентации. Полученную плазмиду обозначают pI2.

Из плазмиды pBLG1 по сайтам Sal I и Sph I вырезают фрагмент ДНК, содержащий 5"-фланкирующую область гена BLG. Выделенный, как описано выше, фрагмент встраивают в плазмиду pI2 по сайтам Sal и Sph I (фиг. 2).

Полученную плазмиду обозначают pI3.

Сайт для рестриктазы Hind III, введенный на 3"-конец амплифицированного (с использованием олигонуклеотидов ON3 и ON4) фрагмента, удаляют. Для этого проводят частичную рестрикцию рестриктазой Hind III, липкие концы достраивают до тупых при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и образовавшиеся тупые концы лигируют при 4^oC в течение ночи, как описано выше.

Полученную плазмиду обозначают pI4 (фиг. 2).

Из плазмиды pBLGI, как описано выше, вырезают Hind III-Sal I-фрагмент ДНК, включающий Hind III-Xba I-фрагмент гена BLG вместе с 3"-фланкирующей областью ДНК длиной 1,6 т.п.о. а также векторную часть плазмиды pBLGl.

Из плазмиды pI4 вырезают Sal I-Hind III-фрагмент (фиг.2).

Эти два фрагмента ДНК лигируют как описано выше. В результате осуществляют сборку вектора, состоящего из: 1) 5"-фланкирующей области гена BLG; 2) кодирующей области этого гена с встроенным в Pvu II сайт нетранслируемой области первого экзона фрагментом длиной 616 п.о. включающим сигнал полиаденилирования; 3) 3"-фланкирующей области гена BLG.

Полученную плазмиду обозначают pBLGvectl (фиг.2).

с. Создание гибридного гена BLG-hIFN-g.

В плазмиду pBLGvectl по сайту SnaB I производят встраивание кДНК hIFN-g, тем самым получают гибридный ген BLG-hIFN-g (фиг.3), собранный в плазмиде pBLG-hIFN-g [10]

Пример 2. Создание гибридного гена BLG-hIFN-g2.

Из плазмиды pBRifn-g3 [11] (производная плазмиды pBR322, в которую по сайту BamH I встроен геномный ген hIFN-g) по сайтам Hind III вырезают фрагмент длиной 0,8 т.п.о. содержащий первый экзон. Фрагмент клонируют в полилинкер плазмиды pSelect-l (Promega Biotech, USA) по сайту Hind III (шаг необходим для введения сайта для рестриктазы SnaB I в нетранслируемую область первого экзона гена hIFN-g при помощи направленного мутагенеза).

Направленный мутагенез проводят согласно методике фирмы Promega [12] с использованием синтетических олигонуклеотидов:

ON5(5"-GTT GCC ATT GCT GCA GGC ATC GTG GTG-3")

ON6(5"-CTT TGG CTT ACG TAT CTC GGA AAC G-3")

Первый из них обеспечивает компенсирующую мутацию, в результате которой восстанавливается ген устойчивости к ампицилину, второй вводит сайт для рестриктазы SnaB I (фиг.4).

Полученную в результате плазмиду называют pSHg-mutl.

SnaB I-Hind III-фрагмент длиной 557 п.о. вырезают из плазмиды pSHg-mutl и встраивают в плазмиду pI3 вместо SnaB I-Hind III-фрагмента гена BLG, встроенного в эту плазмиду (фиг.5). Полученную в результате плазмиду обозначают pBBg-mutl.

Геномный ген hIFN-g переклонируют из плазмиды pBRifn-g3 в плазмиду pBRUC318 по сайту BamH I (фиг.6).

Полученную плазмиду обозначают pBRUGifn-g3.

Hind III-Hind III-фрагмент этой плазмиды, содержащий весь ген hIFN-g за исключением первого экзона и части первого интрона, клонируют в прямой ориентации в плазмиду pBBg-mutl по сайту Hind III (фиг.7).

В результате происходит сборка гибридного гена, в котором за 5"-фланкирующей областью гена BLG длиной 4,7 т.п.о. и нетранслируемой частью первого экзона этого гена следует фрагмент ДНК длиной 5,5 т.п.о. содержащий геномный ген hIFN-g. Таким образом осуществляют сборку гибридного гена BLG-hIFN-g2 (фиг.8Б).

Из полученной плазмиды pBLG-hIFN-g2 вырезают Sal I-Sal I-фрагмент ДНК длиной 10,2 т.п.о. представляющий собой гибридный ген BLG-hIFN-g2. Для этого берут 10 мкг ДНК плазмиды pBLG-hIFN-g2, растворенной в 32 мкл H₂O, добавляют 4 мкл 10Х буфера H (500 mM Трис-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl₂, 1M NaCl, 10 mM DTT, 1 мг/мл BSA) и 4 мкл Sal I (20 ед/мкл) и инкубируют 1 час при 37^oC. Затем проводят препаративный электрофорез в 0,8% агарозном геле. Фрагмент ДНК длиной 10,2 т.п.о. извлекают из агарозы при помощи электроэлюции. Электроэлюцию проводят с использованием аппарата BIOTRAP (Schleicher Schuell, Germany) по методике фирмы-производителя аппарата. Данный фрагмент используют для получения трансгенных мышей, методом микроинъекций в пронуклеусы зигот, как описано в [13] Для микроинъекций используют раствор, содержащий 2,5 нг/мкл в буфере TE (8 mM Трис-HCl, 0,1mM ЭДТА),pH 7,3.

Трансгенных самок, содержащих в составе своего генома гибридный ген BLG-hIFN-g2, спаривают с самцами дикого типа. Пробы молока отбирают на 10 15 день лактации.

Интерфероновую активность образцов молока определяют по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита штамма Индиана на культуре фибробластов человека. Титр hIFN-g определяют в соответствии с международным стандартом Gg23-901-530.

Молоко полученных трансгенных самок обладало антивирусной интерфероновой активностью 10⁶ 10⁷ МЕ/мл.

Пример 3. Создание гибридного гена BLG-hIFN-g3.

Из плазмиды pBLG-hIFN-g вырезают Asu II-BamH I-фрагмент длиной 3,5 т.п. о. включающий 3"-фрагмент кДНК hIFG-g длиной 179 п.о. часть шестого экзона, шестой интрон, седьмой (нетранслируемый) экзон с сигналом полиаденилирования, первые три экзона, первые два и часть третьего интрона гена BLG (фиг. 8А). Этот фрагмент встраивают вместо Asu II-BamH I-фрагмента гибридного гена BLG-hIFN-g2 (фиг.8Б). В результате получают плазмиду pBLG-hIFN-g3 (фиг.8В), в которой осуществлена сборка гибридного гена BLG-hIFN-g3, содержащего: 1) 5"-фланкирующую область гена BLG, длиной 4,7 т.п.о. 2) первые три экзона, первые два интрона, последний четвертый экзон, слитый с третьим экзоном гена hIFN-g; 3) фрагмент гена BLG с сигналом полиаденилирования (фиг.8В).

Из полученной плазмиды pBLG-hIFN-g3 вырезают и очищают, как описано в примере 2, Sal I-Sal I-фрагмент ДНК длиной 10 т.п.о. представляющий собой гибридный ген BLG-hIFN-g3. Данный фрагмент используют для получения трансгенных мышей методом микроинъекций в пронуклеусы зигот.

Молоко полученных трансгенных самок обладало антивирусной интерфероновой активностью 6000 40000 МЕ/мл.

Заявляемые гибридные гены могут служить основой для получения других гибридных генов, обеспечивающих экспрессию интересующих белков в молочной железе трансгенных животных. Для этого последовательность ДНК, кодирующая hIFN-g, должна быть заменена последовательностью, кодирующей интересующий белок.

Источники информации

1. Russo, G. Mertens, K. DeMagistris, L. Lange, H. Cortese, R. and Pietropalo. (1991) Biologicaly active recombinant protrombin and antitrombin III expresed in human hepatoma/vaccinia virus system. Biotechnology and Appl. Biochem. 14, 222 223.

2. Meade H. Gates L. and Lonberg N. (1990) Bovine a_s1-casein gene direct high level expression of active human urocinase in mouse milk. Bio/Technology 8, 443 446.

3. Ebert K.M. Selgrath J.P. Denman J. Smith T.E. Memon M.A. Schindler J. E. Monastersky G.M. Vitale J.A. and Gordon K. (1991) Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. Bio/Technology 9, 835 838.

4. Wright G. Carver A. Cottom D. Reeves D. Schott A. Colman A. (1991) High level expression of active human a₁ antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology 9, 830 834.

5. Simons, J.P. Wilmut, I. Clark, A.J. Archibald A.L. Bishop J.O. Lathe, R. (1988) Gene transfer into sheep. Bio/Technology 6, 179 183.

6. Archibald, A.L. McClenaghan, M. Hornsey, V. Simons, J.P. and Clark, A.J. (1990) High-level expression of biologically active human ₁-antitrypsin in the milk of transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5178 5182.

7. Frischauf, A. Lehrach, H. Poustka, A. Murray, N. (1983) Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences. J. Mol. Biol. 170, 827 - 842.

8. Ali, S. Clark, A.J. (1988) Characterization of gene encoding ovine betalactoglobulin. J. Mol. Biol. 199, 415 426.

9. Davis, L.G. Dibner, M.D. Battey, J.F. Basic methods in molecular biology. New York, Elsevier Science Publishing Co. Inc. 1986, p. 388.

10. Dobrovolsky, V.N. Lagutin, O.V. Vinogradova, T.V. Frolova, I.S. Kuznetsov, V.P. and Larionov, O.A. (1993) Human gamma-interferon expression in the mammary gland of transgenic mice. FEBS Letters 319, 181 184.

11. Виноградова Т.В. (1991) Клонирование гена иммунного интерферона человека и его экспрессия в гетерологичной системе. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

12. Promega Protocols and Applicctions Guide, Second Edition, pp 98 - 105.

13. Hogan, B. Costantini, F. Lacy, E. Manipulating the Mouse Embrio. A Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory. 1986, p.332.