способ получения рекомбинантных туляремийных микроорганизмов - продуцентов факторов вирулентности, рекомбинантный штамм francisella tularensis subspecies, holarctica r5s - продуцент фактора вирулентности francisella tularensis nearctica shu, рекомбинантный штамм francisella tularensis holarctica rn4 - продуцент фактора вирулентности pseudomonas pseudomallei c 141, рекомбинантный штамм francisella tularensis subspecies holarctica r1a - продуцент фактора вирулентности francisella tularensis nearctica b 399 a cole

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантных туляремийных микроорганизмов - продуцентов факторов вирулентности, заключающийся в том, что клетки штамма Francisella tularensis subspecies holarctica R, УКРМ В-6854 инкубируют в жидкой среде в присутствии чужеродной хромосомной или плазмидной ДНК, далее проводят пересев выросшей культуры на плотную питательную среду, затем селективно отбирают рекомбинантные микроорганизмы.

2. Рекомбинантный штамм Francisella tularensis subspecies holarctica R5S, VКРМ В-6853 продуцент фактора вирулентности Francisella tularensis nearctica Shu.

3. Рекомбинантный штамм Francisella tularensis holarctica RN4, УКРМ В-6855 продуцент фактора вирулентности Pseudomonas pseudomallei С141.

4. Рекомбинантный штамм Francisella tularensis subspecies holarctica RIА, УКРМ В-6852 продуцент фактора вирулентности Francisella tularensis nearctica B399 A Cole.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к способу получения рекомбинантных микроорганизмов продуцентов факторов вирулентности и к новым штаммам Francisella tularen- sis subsp. holarctica R5S, RN4 и RIA, полученным этим способом.

Способ может найти применение для получения биологически активных веществ белковой природы, например известных белков-иммуномодуляторов, таких как интерферон, интерлейкин, колониестимулирующих факторов, факторов некроза опухолей и других.

Новые штаммы могут найти применение для производства высокоспецифичных диагностикумов и сывороток, химических вакцин, иммуномодуляторов, используемых в медицине и ветеринарии.

Известные способы трансформации хромосомной или плазмидной ДНК для каждого конкретного микроорганизма имеют свои индивидуальные особенности, которые в конечном итоге позволяют отбирать генетически измененные варианты различных микроорганизмов, получившие за счет чужеродных генов хромосомной ДНК или плазмид явные селективные признаки. Поэтому из множества описанных методов трансформации хромосомной и плазмидной ДНК только один или два наиболее оптимальны для каждого конкретного микроорганизма, а остальные либо требуют существенной доработки, либо неэффективны. Этот ограничивающий фактор передачи чужеродных генов в микроорганизм прежде всего связан со штаммом-реципиентом.

Проблема поиска нового штамма-реципиента для расширения возможностей получения как известных, так и новых генно-инженерных продуктов является актуальной.

Известен штамм Francisella tularensis subsp. holarctica R (известный как R-форма штамма 15 НИИ ЭМ, или R-форма LVS штамма Fr.tularensis subsp. holarctica, или поп S-мутант Fr. tularensis subsp.holarctica), обнаруженный в виде сопутствующих клеток в вакцинном штамме против туляремии (Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии, М, 1975, с.200; Мещрякова И.С. Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии, иммунологии (ЧССР), 1970, т.14, с.420-420; Куделина Р.И. Журнал микробиологии, 1973, N 12, с.98-101).

Применение этого штамма в литературе не описано.

Известные микроорганизмы семейства кишечной палочки и псевдомонад в большей или меньшей степени имеют ряд отрицательных характеристик, к которым можно отнести следующие:

наличие выраженной клеточной стенки, что влияет прежде всего на технологию получения конечного продукта, так как с одной стороны обуславливает применение дорогостоящих реагентов для разрушения клеточной стенки или использование мощных ультразвуковых установок (что вредно для персонала), с другой стороны клеточная стенка бактерий обладает высокой пирогенностью и иммуногенностью, что затрудняет полную очистку конечного продукта от нежелательных примесей;

высокая биохимическая активность, как правило связанная с протеазной активностью, снижает количество чистого продукта, так как при получении биомассы, разрушении бактерий и выделении чистого белка ферменты-протеазы разрушают чужеродный для клетки белок, нарабатываемый рекомбинантной плазмидной ДНК, введенной в штамм-хозяин;

диссоциация микроорганизмов в форму, не позволяющую им быть суперпродуцентами генно-инженерных белков, например для кишечной палочки, показано, что присутствие в клетке-хозяине собственной системы рестракции-модификации заметно влияет на стабильность рекомбинантной плазмиды и экспрессию генно-инженерных белков;

наличие собственных фагов, которые при промышленном производстве биомассы микроорганизмов могут свести к нулю все результаты лизиса микробных клеток, что происходит либо за счет привнесения вирулентных фагов из внешней среды, либо за счет активации умеренного фага, находящегося внутри клетки;

патогенность для животных и людей, что в значительной мере препятствует их применению.

Все перечисленные характеристики обуславливают увеличение стоимости конечного генно-инженерного продукта и мешают изучению физико-химической структуры клонированного биологически активного соединения.

Данные штаммы являются новыми и в литературе не описаны.

В основу изобретения положена задача путем подбора нового штамма-реципиента чужеродной хромосомной или плазмидной ДНК разработать способ, позволяющий создавать новые рекомбинантные штаммы-продуценты биологически активных веществ как белковой природы, так и полисахаридной, расширить возможность получения и применения генно-инженерных продуктов, а также возможность изучения природы вирулентности различных микроорганизмов, в том числе возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний.

Задача решена тем, что в способе получения рекомбинантных микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ, включающем введение в исходный микроорганизм генно-инженерным методом чужеродной хромосомной или плазмидной ДНК с последующим селективным отбором путем посева на питательные среды рекомбинантного микроорганизма, согласно изобретению, в качестве исходного микроорганизма используют штамм Fracisella tularensis subspecis holarctica R, VKPM B-6854.

Данный способ позволяет создавать новые рекомбинантные штаммы - продуценты факторов вирулентности.

Уникальная способность штамма Francisella tularensis subspecies holarctica R, VKPM B-6854 позволяет в нем клонировать и добиваться высокой экспрессии не только белков, но и специфических полисахаридов. А так как для многих возбудителей опасных инфекций одним из составляющих вирулентности является полисахарид, то изучение его экспрессии в авирулентном штамме позволит не только понять физическую природу вирулентности многих микроорганизмов, но и на основе рекомбинантных микроорганизмов получать новые высокоэффективные химические вакцины, высокоспецифические диагностикумы и сыворотки, необходимые для ветеринарии и медицины.

Задача также решена тем, что согласно изобретению предложен новый рекомбинантный штамм Francisella tularensis sups- pecies holarctica R5S - продуцент фактора вирулентности Francisella tularensis nearctica Shu, депонированный 08.08.94 в Русской национальной коллекции индустриальных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики и зарегистрированный за N VКРМ В-6853, и рекомбинантный штамм Francisella tularensis subspecies holarctica RN4 продуцент фактора вирулентности Ps.pseudomallei С-141, депонированный 08.08.94 в Русской национальной коллекции индустриальных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики и зарегистрированный за N VKPM В-6855, а также рекомбинантный штамм Francisella tularensis supspecies holarctica RIA продуцент фактора вирулентности Francisella tularensis nearctica В-399А Сole, депонированный О8.08.94 в Русской национальной коллекции индустриальных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики и зарегистрированный за N VKPM B-6852.

Использование данных штаммов как продуцентов фактора вирулентности Fr. tularensis nearctica Shu, фактора вирулентности Ps. pseudomallei С-141 и фактора вирулентности Fr. tularensis nearctica В-399А Соlе открывает возможности изучения их физико-химической основы, что до настоящего времени пока остается неизвестным. Выделение и очистка фактора вирулентности из указанных рекомбинантных штаммов позволит получить высокоэффективные химические вакцины, высокоспецифичные диагностикумы и сыворотки, а также иммуномодуляторы, которые найдут широкое применение.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделяют хромосомную или плазмидную ДНК, содержащую необходимый для передачи в исходный штамм Fr. tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854 ген (гены). Исходный штамм высевают на плотную питательную среду и помещают в термостат. После выращивания культуру смывают солевым или буферным раствором с желатином и центрифугируют. Супернатант сливают, а осадок микробных клеток суспендируют до плотности клеток 10 10 кл/мл. К полученной суспензии клеток добавляют хромосомную или плазмидную ДНК в количестве 1,0-5,0 мкг, перемешивают и инкубируют при О^oС или при комнатной температуре. После инкубации данную смесь либо прогревают при температуре 42^oС одну минуту (тепловой шок) и помещают в термостат при 37^oС и через 1 ч высевают на плотные питательные среды (в случае введения хромосомной ДНК), либо помещают в кельвинатор (-55^oС), затем оттаивают и высевают на плотную питательную среду (в случае введения плазмидной ДНК). Засеянные плотные питательные среды помещают в термостат. Через 18 ч подросшую культуру смывают и вновь проводят серию посевов с отбором колоний рекомбинантного микроорганизма (клетки исходного штамма при приобретении хромосомной или плазмидной ДНК образуют капсулу, что приводит к резкому изменению внешнего вида образующихся колоний). Учет результатов проводят на 3-5 сут по мере роста колоний рекомбинантных микроорганизмов. В качестве контроля используют клетки исходного штамма, проводя их через все этапы, кроме добавления хромосомной или плазмидной ДНК.

Возможность осуществления способа основана на знании особенностей штамма Francisella tularensis holaretica R, VKPM В-6854, при которых данный микроорганизм приобретает способность воспринимать с помощью трансформации чужеродную хромосомную или плазмидную ДНК, стабильно ее сохранять и экспрессировать необходимые биологически активные вещества.

Культурально-морфологический свойства исходного штамма Francisella tularensis holarctica R, VKPM В-6854 (R форма штамма 15 НИИ ЭМ). Бактерии представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,2-0,7 мкм в 2-2,5 раза более крупные, чем клетки вирулентного или вакцинного штаммов, неподвижны, грамотрицательны, капсула не выражена. данный штамм аэроб, не растет на обычных средах, ауксотроф, культивируется при 37^oС в средах, богатых витаминами, например, желточная среда МакКоя, агар, содержащий цистеин (0,05-0,1% ) и 1% глюкозы с добавлением 5-10% дефибринированной крови (черным альбумином либо гемоглобином). Из жидких сред используют среды Шегера. Посев культуры на питательные среды выдерживают от двух до пяти суток. Авирулентная форма дает задержку роста клеток во времени (на сутки) в сравнении с вирулентной формой, что наиболее заметно после длительного ее хранения (задержка в росте может составлять 2-5 сут). Выращивать R-форму можно на средах с мозговой, селезеночной, печеночной тканями, экстрактами сердца.

На плотных непрозрачных средах клетки R-формы штамма 15 НИИ ЭМ образуют плоские прозрачные колонии серого цвета. При дальнейших пересевах культура стабильно сохраняет приобретенные признаки.

Клеточная стенка, характерная для всех других грамотрицательных микроорганизмов, отсутствует, и поэтому клетки R-формы штамма 15 НИИ ЭМ чувствительны не только к низким концентрациям различных детергентов (додецил сульфат натрия, тритон Х-100, дезоксихолат натрия), но даже к дистиллированной воде при рН меньше 6 или больше 10, которая частично лизирует взвесь микроорганизма в течение суток. Обнаружено также литическое действие на клетки R-формы Твин-80 и желчи. Однако при выращивании культуры в больших ферментерах (где рН среды и другие параметры строго контролируются) лизисе на происходит, и концентрация клеток в питательном бульоне может достигать больших величин (свыше ста миллиардов кл/мл) в сравнении с другими известными микроорганизмами.

Ультратонкая структура клеток R-формы характеризуется наличием обширного осмиефильного капсулоподобного покрова, связанного с клеткой и не теряющегося в ультратонких срезах. Цитоплазма клеток гранулярная, ДНК расположена в центральной ее части.

Биохимические свойства. Клетки R-формы штамма 15 НИИ ЭМ обладают низкой биохимической и протеазной активностью. Они расщепляют белки с выделением сероводорода, на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу, непостоянно ферментируют декстрозу и фруктозу, не обладают цитруллинуреидазной активностью. Биохимические свойства клеток R-формы нестабильны и зависят не столько от свойств самого штамма, сколько от состава питательных сред и способности микроорганизма ферментировать белки, продукты распада которых маскируют образующиеся одновременно с ними кислоты. Главным путем усвоения аминокислот является окислительное дезаминирование. R-форма содержит фермент оксидоредуктазу.

Серологические и иммунохимические свойства. Живые клетки R-формы штамма 15 НИИ ЭМ при введении лабораторным животным (мыши, хомячки, морские свинки, кролики и другие) не вызывают иммунного ответа макроорганизмов, поэтому на них невозможно получить специфические сыворотки. R-форма содержит обедненный состав гликолипидов, поэтому не способна вступать в серологические реакции с эритроцитарным диагностикумом Fr.tularensis subsp. holarctica (из-за отсутствия видоспецифических антигенов). В серологических реакциях со специфическими сыворотками, полученными на вакцинный или вирулентный штаммы, взвесь клеток R-формы образует мелкозернистую агглютинацию (все иные клетки семейства Francisella tularensis образуют крупнохлопчатую агглютинацию). В иммуноэлектрофорезе лизат R-формы штамма 15 НИИ ЭМ не дает специфического иммунного профиля, характерного для полисахарид белкового комплекса родительского микроорганизма. Клетки R-формы в высокой степени чувствительны к бактерицидному действию сыворотки крови теплокровных животных.

Плазмиды и фаги данного вида. R-форма штамма 15 НИИ ЭМ, как и семейство Francisella, собственных плазмид и фагов не имеет.

Генетические особенности, маркеры. Клетки R-формы стабильны и ни при каких естественных или искусственных манипуляциях с ними не приобретают признаков родительского штамма 15 НИИ ЭМ либо каких-то иных, то есть они неизменны по фенотипическим и генетическим признакам. R-форма обладает природной устойчивостью к полимиксину, пенициллинам, макролидам (эритромицину, олеандомицину), высокочувствительна к антибиотикам тетрациклиновой группы, аминогликозидам, хлорамфениколу, рифампицину, налидиксовой кислоте.

Патогенность. Одной из особенностей живых клеток R-формы в отличие от родительского штамма 15 НИИ ЭМ является то, что при введении их лабораторным животным (мышам, хомякам, морским свинкам, кроликам) в концентрации не менее одного миллиарда кл/мл они не вызывают токсических реакций, не обладают пирогенностью и не формируют специфического иммунитета.

Активность и продуктивность штамма. Наличие специфических полисахаридов, определяющих характерные отличия данного микроорганизма от других грамотрицательных бактерий, а также эксперссии экзо- и эндотоксина в R-форме штамма 15 НИИ ЭМ не обнаружено.

Условия и состав для хранения и поддержания. Музейная культура клеток R-формы штамма 15 НИИ ЭМ хранится при температуре +4^oС на косяках среды МакКоя до 6 мес, в лиофильно высушенном состоянии до 5 лет.

Среда для культивирования. Плотная среда с черным альбумином или гидролизованным гемоглобином, жидкая среда Шерера.

Технологические особенности при культивировании. Технологических особенностей при культивировании нет. R-форма штамма 15 НИИ ЭМ культивируется, как обычная вакцина 15 НИИ ЭМ или вирулентный штамм возбудителя туляремии Fr. Tularensis subsp. holarctica.

Устойчивость к дезинфектантам. Клетки R-формы в течение 2-5 мин убиваются 2-3% раствором лизола, 3-5% раствором карболовой кислоты, 3% раствором перекиси водорода, 1:1000 раствором сулемы, в течение нескольких минут инактивируются при ультрафиолетовом облучении, легко разрушаются при воздействии ультразвука.

Приведенные свойства R-формы штамма 15 НИИ ЭМ делают этот микроорганизм уникальным реципиентом, на основе которого возможно создание рекомбинантных микроорганизмов продуцентов биологически активных веществ. Ни один из известных штаммов продуцентов биологически активных веществ не обладает совокупностью следующих достоинств:

полная авирулентность клеток для животных и человека, следовательно, безопасность для здоровья персонала, постоянно работающего с R-формой или продуцентом биологически активных соединений на его основе, в промышленном производстве или лабораторных условиях;

нетоксичность лизатов для всех видов животных и человека, что также означает безопасность персонала при выделении из клеток продуцентов биологически активных соединений и меньшую степень очистки конечного продукта от бактериальных примесей, что позволит удешевить стоимость получаемого препарата;

неспособность R-формы штамма 15 НИИ ЭМ самостоятельно существовать в природе (лабораторный микроорганизм) говорит об экологической безопасности производства и использования продуцентов биологически активных соединений на его основе;

маленькие размеры клеток позволяют в одном объеме получать большее количество биомассы в сравнении с другими микроорганизмами, а значит и больший выход конечного продукта;

низкая протеазная активность микроорганизма позволяет значительно снизить потери конечного продукта в процессе его выделения;

отсутствие выраженной клеточной стенки позволяет легко разрушать клетки без использования ультразвука (вредного для здоровья персонала) или дорогостоящих реагентов, разрушающих клеточную стенку;

отсутствие собственных фагов у данного микроорганизма позволяет исключить потери при промышленной наработке культуры клеток в больших объемах, так как попадание их в ферментеры из внешней среды приводит к остановке и потере наращиваемой биомассы.

Знание приведенных свойств штамма Francisella tularensis subspecies holaretica R, VKPM В-6854 при получении рекомбинантных штаммов методом трансформации дает уникальную возможность изучения природы вирулентности очень многих микроорганизмов, возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний (туберкулез, сальмонеллез, дизентерия, меллиоидоз, туляремия и многие другие), а также создавать штаммы продуценты факторов вирулентности.

Для исследования выживаемости, загрязненности и идентичности указанного штамма культуру разводили физиологическим раствором по стандарту мутности до 5 млрд. клеток на 1 мл и последовательно раститровывали до 1000 клеток на 1 мл. По 0,1 мл взвеси клеток из каждого разведения микроорганизмы были высеяны на плотные питательные среды, содержащие необходимые компоненты для их роста. После культивирования культуры на чашках Петри отмечено следующее.

По способности окрашиваться по Граму и восприимчивости к Сафранину, по морфологии и тинкториальным свойствам клетки в мазке соответствуют Fr.tularensis.

При визуальном осмотре чашек с выросшей культурой и мазков при микроскопии загрязненность посторонней микрофлорой отсутствует.

Выживаемость Francisella tularensis subspecies holarctica R VKPM В-6854 соответствует концентрации ста миллионам живых микробных клеток в 1 мл. Остаточная вирулентность (патогенность) указанного штамма была изучена на беспородных белых мышах при подкожном заражении. Для заражения использовали суспензии микроорганизмов в рабочих разведениях от 100 до 510⁹ клеток по оптическому стандарту мутности. Параллельно проводили определение живых микробных клеток в приготовленных суспензиях методом высева до единичных колоний на питательные среды, содержащие необходимые компоненты для их роста (среда Difco, содержащая гемоглобин, глюкозу и цистеин в необходимых пропорциях). Соответствие двух методом определения концентрации микроорганизмов составило 50%

В эксперименте находилось девять групп по шесть животных в каждой. Заражение беспородных мышей проводили подкожно в дозах от ста клеток на мышь до 510⁹ клеток на мышь с десятикратным шагом в объеме 0,1 мл. В качестве контроля использовали группу животных, которая не подвергалась заражению. Срок наблюдения за экспериментальными и контрольной группами составил 21 день.

В результате проведенных исследований установлено отсутствие остаточной вирулентности исследуемого штамма в дозе до 5 млрд. микробных клеток на мышь. Таким образом, штамм Fr. tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854 может быть отнесен к 5 группе микроорганизмов по международной классификации (полная авирулентность).

Полученный данным способом новый рекомбинантный штамм Fr.tularensis subsp. holarctica R5S VKPM В-6853 продуцент фактора вирулентности Fr. tularensis nearctica Shu характеризуется следующими основными свойствами:

Культурально-морфологические свойства. Бактерии представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,1-0,5 мкм в 2-2,5 раза более мелкие, чем клетки Fr. tularensis subsp. holarctica VKPM В-6854, неподвижны, грамотрицательны, образуют выраженную капсулу. Указанный штамм R5S не растет на обычных средах, ауксотроф, культивируется при 37^oС в средах, богатых витаминами, например, желточная среда МакКоя, агара, содержащем цистеин (0,05-0.1% ) и 1% глюкозу с добавлением 5-10% дефибринированной крови (черного альбумина либо гемоглобина). Из жидких сред использует среду Шерера. Рост культуры продолжается от двух до пяти суток. После длительного хранения штамм R5S дает задержку роста клеток во времени. Штамм R5S можно выращивать на средах с мозговой, селезеночной, печеночной тканями, экстрактами сердца. Музейная культура на косяках среды МакКоя хранится до 6 месяцев. На плотных непрозрачных средах клетки указанного штамма после высева из органов беспородных мышей находятся в SR-форме и образуют выпуклые полупрозрачные колонии белого цвета с голубым отливом. Эти клетки обладают высокой иммуногенностью и остаточной вирулентностью для белых мышей. через 5-6 пересевов на плотных питательных средах рекомбинантная культура снижает вирулентность для белых мышей, но исходный штамм практически не диссоциирует. Для поддержания определенного уровня остаточной вирулентности рекомбинантного штамма периодически им необходимо заражать беспородных мышей и из органов павших животных выделять более вирулентную культуру R5S (как это следует из инструкции по работе с известным вакцинным штаммом 15 НИИ ЭМ).

Биохимические свойства. Клетки штамма R5S расщепляют белки с выделением сероводорода, на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу, непостоянно ферментируют декстрозу и фруктозу. Нечувствительны к эритромицину, олеандомицину, полимиксину, пенициллину, стрептомицину, не обладает цитруллинуреидазной активностью.

Иммунохимические и серологические свойства. Кроличья экспериментальная сыворотка, полученная на рекомбинантный штамм R5S, бедна антителами в сравнении с экспериментальной кроличьей и коммерческой сыворотками, полученными на штамм 15 НИИ ЭМ. Однако данная сыворотка обладает более высокой специфичностью к Fr.tularensis в сравнении с коммерческой сывороткой.

Отношение к фагам данного вида. Рекомбинантный штамм R5S, как и все семейство Francisells, собственных фагов не имеет.

Патогенность для лабораторных животных. Рекомбинантный штамм R5S обладает средней остаточной вирулентностью для беспородных мышей, слабо вирулентен для морских свинок и не вирулентен для кроликов.

Способ получения рекомбинантного штамма. Генно-инженерный, реципиентные клетки Fr.tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854 трансформируют фрагментом хромосомной ДНК, кодирующим синтез фактора вирулентности от возбудителя туляремии Fr.tularensis nearctica Shu.

Генетические особенности. Клетки рекомбинантного штамма R5S обладают природной устойчивостью к пенициллинам, полимиксинам, макролидам, хромосомные гены фактора вирулентности возбудителя туляремии маркированы стрептомицинустойчивостью.

Продуктивность штамма. Рекомбинантный штамм R5S является продуцентом фактора вирулентности Fr.tularensis nearctica Shu, который определяется иммунохимическими и биохимическими методами как синтез комплекса белка и специфического полисахарида.

Условия и состав сред для хранения и поддержки рекомбинантного штамма. Музейная культура штамма R5S хранится при температуре +4^oС на косяках среды МакКоя до 6 мес, в лиофильно высушенном состоянии до 5 лет.

Среда для культивирования штамма. Плотная среда с черным альбумином, жидкая среда Шерера.

Указанный рекомбинантный штамм R5S прошел испытания на выживаемость, загрязненность, идентичность и остаточную вирулентность в Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов при Министерстве здравоохранения и медицинской промышленности РФ и Федеральном управлении медико-биологических и экстремальных проблем. Испытания проводились по методике, аналогичной описанной для исходного штамма.

Результаты испытаний указанного штамма R5S показали следующее.

По способности окрашиваться по Граму и восприимчивости к Сафранину, по морфологии и тинкториальным свойствам клетки в мазке соответствуют Fr.tularensis.

При визуальном осмотре чашек с выросшей культурой и мазков при микроскопии загрязненность посторонней микрофлорой отсутствует.

Выживаемость соответствует концентрации ста миллионов живых микробных клеток в 1 мл.

В результате проведенных исследований установлено наличие остаточной вирулентности штамма R5S. LD₅₀ для белых беспородных мышей составила 25 тыс. микробных клеток. Специфичность гибели мышей подтверждена наличием роста культуры Fr.tularensis subsp. holaretica R5 из отпечатков органов на питательных средах. Гибель животных в контрольной группе отсутствовала.

Таким образом, в соответствии с установленной остаточной вирулентностью штамм R5S может быть отнесен 4-й группе микроорганизмов по международной классификации.

Рекомбинантный штамм Fr. tularensis subps. holarctica RIA, VKPM В-6852 характеризуется следующими основными свойствами.

Культурально-морфологические свойства. Бактерии представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,2-0,7 мкм, неподвижны, грамотрицательны, образуют капсулу. Рекомбинантный штамм RIA не растет на обычных средах, ауксотроф, культивируется при 37^oС в средах, богатых витаминами, например, желточная среда МакКоя, агаре, содержащем цистеин (0,05-0,1% ) и 1% клюкозу с добавлением 5-10% дефибринированной крови (черного альбумина либо гемоглобина). Из жидких сред используют среду Шерера. Рост культуры на питательных средах продолжается от двух до пяти суток. После длительного хранения указанный штамм дает задержку роста клеток во времени. Штамм RIA можно выращивать на средах с мозговой, селезеночной, печеночной тканями, экстрактами сердца. Музейная культура на косячках среды МакКоя хранится до 6 мес. На плотных непрозрачных средах клетки указанного штамма после посева из органов беспородных мышей находятся в SR-форме и образуют колонии белого цвета с голубым отливом. Эти клетки обладают высокой иммуногенностью и остаточной вирулентностью для белых мышей. Через 5-6 пересевов на плотных питательных средах рекомбинантная культура снижает вирулентность для белых мышей, но в исходный штамм практически не диссоциирует. Для поддержания определенного уровня остаточной вирулентности рекомбинантного штамма им периодически необходимо заражать беспородных мышей и из органов павших животных выделять более вирулентную культуру RIA (в соответствии с инструкцией по работе с известным вакционным штаммом 15 НИИ ЭМ).

Биохимические свойства. Клетки штамма RIA расщепляют белки, мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу, непостоянно ферментируют декстрозу и фруктозу. Не чувствительны к эритромицины, олеандомицину, полимиксину, пенициллину, стрептомицину, не обладают цитруллинуреидазной активностью.

Иммунохимические и серологические свойства. Кроличья экспериментальная сыворотка, полученная на рекомбинантный штамм RIA, бедна антителами в сравнении с экспериментальной кроличьей и коммерческой сыворотками, полученными на штамм 15 НИИ ЭМ. Однако данная сыворотка обладает более высокой специфичностью к Fr.tularensis в сравнении с коммерческой сывороткой. В реакциях со специфическими сыворотками на стекле взвесь клеток RIA образует крупнохлопчатую агглютинацию.

Отношение к фагам данного вида. Рекомбинантный штамм RIA, как и все семейство Francisella, собственных фагов не имеет.

Патогенность для лабораторных животных. Рекомбинантный штамм RIA обладает высокой вирулентностью для беспородных мышей, слабо вирулентен для морских свинок и авирулентен для кроликов.

Способ получения рекомбинантного штамма. Генно-инженерный. Геципиентные клетки Fr. tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854 с привнесенным методом трансформации фрагментом хромосомной ДНК от Fr. tularensis nearctica В-399 А Соle.

Генетические особенности. Клетки рекомбинантного штамма RIA обладают природной устойчивостью к пенициллинам, полимиксинам, макролидам, хромосомные гены фактора вирулентности маркированы стрептомицинустойчивостью.

Продуктивность штамма. Рекомбинантный штамм PIA является продуцентом фактора вирулентности Fr. tularensis nearctica В-399 А Соlе, который определяется иммунохимическими и биохимическими методами как синтез комплекса белка и специфического полисахарида.

Условия и состав сред для хранения и поддержки рекомбинантного штамма. Музейная культура штамма RIA хранится при температуре +4^oС на косяках среды МакКоя до 6 мес, в лиофильно высушенном состоянии до 5 лет.

Среда для культивирования штамма. Плотная среда с черным альбумином, жидкая среда Шерера.

Испытания указанного штамма на выживаемость, загрязненность и идентичность, проведенные аналогично вышеописанным, показали, что для штамма RIA:

по способности окрашиваться по Граму и восприимчивости к Сафранину, по морфологии и тинкториальным свойствам клетки в мазке соответствуют Fr.tularensis;

при визуальном осмотре чашек с выросшей культурой и мазков при микроскопии загрязненность посторонней микрофлорой отсутствует;

выживаемость соответствует концентрации пятьдесят миллионов живых микробных клеток в 1 мл.

В результате проведенных исследований установлено наличие остаточной вирулентности указанного штамма. LD₅₀ для белых беспородных мышей составила 30 тыс микробных клеток. Специфичность гибели мышей подтверждена наличием роста культуры Fr.tularensis holarctica RIA из отпечатков органов на питательных средах. Гибель животных в контрольной группе отсутствовала. Таким образом, в соответствии с установленной остаточной вирулентностью, указанный штамм RIA может быть отнесен к 4-й группе микроорганизмов по Международной классификации.

Рекомбинантный штамм Fr. tularensis subsp. holarctica RN4, VKPM В-6852 характеризуется следующими основными свойствами.

Культурально-морфологические свойства. Бактерии представляют собой кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,3-0,8 мкм в 3-4 раза более крупные, чем клетки Fr.tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854 неподвижны, грамотрицательны, образуют капсулу. Указанный рекомбинантный штамм RN4 не растет на обычных средах, ауксотроф, культивируется при 37 С в средах, богатых витаминами, например, желточная среда МакКоя, агаре, содержащем цистеин

0,05-0,1% глюкозу 1% и 5-10% дефибринированной крови (черного альбумина или гемоглобина). Из жидких сред используют среду Шерера. Рост культуры на питательных средах продолжается от двух до пяти суток. После длительного хранения указанный штамм RN4 дает задержку роста клеток во времени. Штамм RN4 можно выращивать на средах с мозговой, селезеночной, печеночной тканями, экстрактами сердца. Музейная культура на косяках среды МакКоя хранится до 6 мес. На плотных непрозрачных средах клетки указанного штамма RN4 после высева из органов беспородных мышей находятся в SR-форме и образуют выпуклые полупрозрачные колонии белого цвета. Эти клетки обладают высокой иммуногенностью и остаточной вирулентностью для белых мышей и золотистых хомячков. Через 5-6 пересевов на плотных питательных средах рекомбинантная культура снижает вирулентность для мышей и золотистых хомячков, однако в R-форму штамма 15 НИИ ЭМ практически не диссоциирует. Для поддержания определенного уровня остаточной вирулентности рекомбинантного штамма им периодически необходимо заражать беспородных мышей и из органов павших животных выделять более вирулентную культуру RN4 (в соответствии с инструкцией по работе с известным вакцинным штаммом 15 НИИ ЭМ).

Биохимические свойства. Клетки указанного штамма RN4 расщепляют белки с выделением сероводорода. на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу, непостоянно ферментируют декстрозу и фруктозу. Не чувствительны к эритромицину, олеандомицину, полимиксину, пенициллину, стрепромицину, не обладают цитруллинуреидазной активностью.

Иммунохимические и серологические свойства. Кроличья экспериментальная сыворотка, полученная на рекомбинантный штамм RN4, бедна антителами в сравнении с экспериментальной кроличьей и коммерческой сыворотками, полученными на штамм 15 НИИ ЭМ, и обладает высокой специфичностью к Fr.tularensis в сравнении с коммерческой сывороткой.

Отношение к фагам данного вида. Рекомбинантный штамм RN4, как и все семейство Francisella, собственных фагов не имеет.

Патогенность для лабораторных животных. Рекомбинантный штамм RN4 обладает высокой остаточной вирулентностью для мышей и золотистых хомячков, слабо вирулентен для морских свинок и авирулентен для кроликов.

Способ получения рекомбинантного штамма. Генно-инженерный. Реципиентные клетки Fr. tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854 трансформируют фрагментом хромосомной ДНК на векторной плазмиде, кодирующем синтез фактора вирулентности от возбудителей меллиоидоза Ps.pseudomallei С-141.

Генетические особенности. Клетки указанного рекомбинантного штамма RN4 обладают природной устойчивостью к пенициллинам, полимиксинам, макролидам, хромосомные гены факторов вирулентности возбудителя меллиоидоза маркированы стрептомицинустойчивостью.

Продуктивность штамма. Указанный рекомбинантный штамм RN4 является продуцентом фактора вирулентности возбудителя меллиоидоза Ps.pseudomallei С-141, который определяется иммунохимическими и биохимическими методами как синтез комплекса белка и специфического полисахарида.

Условия и состав сред для хранения и поддержки рекомбинантного штамма. Музейная культура хранится при температуре +4^oС на косяках среды МакКоя до 6 мес, в лиофильно высушенном состоянии до 5 лет.

Среда для культивирования штамма. Плотная среда с черным альбумином или гидролизованным гемоглобином, жидкая среда Шерера.

Испытания указанного штамма RN4 на выживаемость, загрязненность и идентичность, проведенные аналогично вышеописанным, показали, что для штамма RN4:

по способности окрашиваться по Граму и восприимчивости к Сафранину, по морфологии и тинкториальным свойствам клетки в мазке соответствуют Fr.tularensis;

при визуальном осмотре чашек с выросшей культурой и мазков при микроскопии загрязненность посторонней микрофлорой отсутствует;

выживаемость соответствует концентрации пятьдесят миллионов живых микробных клеток. В результате проведенных исследований установлено наличие остаточной вирулентности указанного штамма RN4. LD₅₀ для белых беспородных мышей составила 35 тыс микробных клеток. Специфичность гибели мышей подтверждена наличием роста культуры Fr.tularensis subsp. holarctica RN4 из отпечатков органов на питательных средах. Гибель животных в контрольной группе отсутствовала. Таким образом, в соответствии с установленной остаточной вирулентностью указанный рекомбинантный штамм RN4 может быть отнесен к 4-й группе микроорганизмов по Международной классификации.

Использование рекомбинантных штаммов в качестве продуцентов указанных факторов вирулентности позволит изучить их физико-химические основы. Это принципиально важно, так как штаммы-возбудители инфекционных заболеваний относятся к категории опасных или особо опасных инфекций, против которых нет специфической защиты в виде живой или химической вакцины. Для генной инженерии клонирование в авирулентном реципиенте Fr.tularensis subsp. holarctica R, VKPM В-6854, группы генов, кодирующих синтез комплекса полисахарида и белка (белков), отвечающего за вирулентность определенного возбудителя инфекции, является новым направлением в этой области, ранее не изученным. Выделение и очистка фактора вирулентности из рекомбинантного штамма позволит получать высокоэффективные химические вакцины, высокоспецифичные диагностикумы и сыворотки, а также иммуномодуляторы, которые найдут широкое применение в медицине и ветеринарии.

Пример 1. Получение рекомбинантного штамма Fr.tularensis subsp. holarctica R5S, VKPM В-6853 продуцента факторов вирулентности Fr. tularensis nearctica Shu.

Микробные клетки штамма Francisella tularensis subspecies holarctica R, VKPM В-6854 высевают на плотную питательную среду (мясо-пептонный агар), содержащую 5% гемоглобина, 1% цистеина, 1% глюкозы, и выдерживают в термостате при 37^oС в течение суток. Подросшую культуру смывают GS-буфером (1% желатины, 0,85% натрия хлорида) и центрифугируют при +4^oС и 6000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сливают, а осадок микробных клеток суспендируют в том же буфере и промывают микробные клетки, повторяя процедуру два раза. После отмывки осадок суспендируют в ТМ-буфере (на 100 мл,г: натрия хлорид 1,6 кальция хлорид 0,6 магния сульфат 0,6; Трис-НСl 0,6; треонин 0,5; лизин 0,06; пролин 0,4; цистеин 0,03; серин 0,02; спермин 0,004; аргинин 0,04; аспарагиновая кислота 0,04; гистидин 0,04; рН 6,2) до плотности клеток 10 кл/мл, разливают в пробирки по 300 мкл и добавляют 50 мкл хромосомной ДНК, содержащей гены фактора вирулентности Fr.Tularensis nearctica Shu в количестве 5 мкг. Данную смесь перемешивают и выдерживают при 0^oС в течение 30 мин. После инкубации смеси ее прогревают при 42^oС в течение 1 мин (тепловой шок) и выдерживают в термостате при 37^oС в течение 1 ч. Затем смесь высевают на плотную питательную среду аналогичного указанному состава. Плотную питательную среду с высеянной взвесью клеток помещают в термостат при 37^oС на 18 ч. Через 18 ч подросшие клетки смывают GS-буфером, готовят суспензию концентрацией 10¹¹ кл/мл и проводят на плотных питательных средах серию посевов с отбором колоний рекомбинантного микроорганизма (клетки исходного штамма при приобретении хромосомной ДНК образуют капсулу, что приводит к резкому изменению внешнего вида колоний. Образующиеся колонии выпуклые, полупрозрачные, белого цвета). Учет результатов проводят на 3-5 сут по мере роста колоний рекомбинантного штамма. Получают рекомбинантный штамм Fr.tularensis subsp. holarctica R5S продуцент фактора вирулентности Fr.tularensis nearctica Shu.

В качестве контроля используют тот же микроорганизм, проводя его через все этапы, кроме добавления хромосомной ДНК. На селективных средах клетки исходного штамма не дают роста колоний. Выросшие на селективных средах колонии полученного рекомбинантного штамма проверяют на вирулентность, токсичность и иммуногенность по известной методике.

Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Fr.tularensis subsp. holarc tica RIA, VKPM В-6852 продуцента фактора вирулентности Fr.tularensis nearctica В-399 А Соle.

Микробные клетки штамма Francisella subspecies holarctica R, VKPM В-6854 высевают на плотную питательную среду аналогичного примеру 1 состава и выдерживают в термостате при температуре 37^oС в течение суток. Подросшую культуру смывают GS-буфером (1% желатин, 0,85% натрия хлорида) и центрифугируют при температуре +4^oС и 6000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сливают, а осадок микробных клеток суспендируют в том же буфере и промывают микробные клетки, повторяя процедуру два раза. Затем осадок суспендируют в ТМ-буфере (состав аналогичен примеру 1) до плотности клеток 10¹⁰ кл/мл, разливают в пробирки по 300 мкл и добавляют 50 мкл хромосомной ДНК, содержащей гены вирулентности Fr.tularensis nearctica В-399А Соle в количестве 3 мкг. Данную смесь перемешивают и выдерживают при 0^oС в течение 30 мин. После инкубации смесь прогревают при температуре 42^oС в течение 1 мин и выдерживают в термостате при 37^oС в течение 1 ч. Затем смесь высевают на плотную питательную среду аналогичного состава и помещают в термостат при 37^oС на 18 ч. Через 18 ч подросшие клетки смывают GS-буфером, готовят суспензию концентрацией 10¹⁰ кл/мл и проводят на плотных питательных средах серию посевов с отбором колоний рекомбинантного штамма. Образующиеся колонии рекомбинантного штамма полупрозрачные, белого цвета с голубым отливом.

Учет результатов проводят на 3-5 сут по мере роста колоний рекомбинантного штамма. Получают рекомбинантный штамм Fr.tularensis subsp. holarctica RIA продуцент фактора вирулентности Fr.tularensis nearctica В-399 А Соlе. Контроль эксперимента проводят аналогично примеру 1. Выросшие на селективных средах колонии рекомбинантного штамма проверяют по известной методике на вирулентность, токсичность и иммуногенность.

Пример 3. Получение рекомбинантного штамма Fr.tularensis subsp. holarctica RN4, VKPM В-6855 продуцента фактора вирулентности Ps.pseudomallei C-141.

Микробные клетки штамма Francisella tularensis subspecies holarctica R, VKPM В-6854 высевают на плотную питательную среду аналогичного примеру 1 состава и выдерживают в термостате при 37^oС в течение суток. Подросшую культуру смывают буферным раствором аналогичного примеру 1 состава и центрифугируют при комнатной температуре и 6000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сливают, а осадок микробных клеток суспендируют в 0,2М калия хлорида до плотности клеток 10¹⁰ кл/мл. Полученную суспензию клеток разливают по 25 мкл и добавляют равный объем солевого буфера (200 мМ магния сульфата, 10 мМ трис-ацетата, 10% полиэтиленгликоля 600, рН 7,5). К 50 мкл суспензии добавляют 10 мкл плазмидной ДНК, содержащей гены фактора вирулентности Ps.pseudomallei С-141, в количестве 1,5 мкг, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Данную смесь помещают в кельвинатор (-55^oС) на 15-20 мин, затем оттаивают на водяной бане при 37^oС в течение 5 мин и высевают на плотную питательную среду аналогичного примеру 1 состава пятном без растирания по всей поверхности. Плотную питательную среду с высеянной взвесью клеток помещают в термостат при 37^oС на 18 ч. Через 18 ч подросшую культуру смывают 0,2 М калия хлоридом и готовят суспензию концентрацией 10¹⁰ кл/мл и проводят на плотных питательных средах серию посевов с отбором колоний рекомбинантного микроорганизма. Образующиеся колонии рекомбинантного штамма выпуклые, полупрозрачные, белого цвета.

Учет результатов проводят на 3-5 сут по мере роста колоний рекомбинантного микроорганизма. Получают рекомбинантный штамм Fr.tularensis supsp. holarctica RN4 продуцент фактора вирулентности Ps.pseudomallei C-141.

Контроль эксперимента проводят аналогично примеру 1. Выросшие на селективных средах колонии рекомбинантного штамма проверяют на вирулентность, иммуногенность, токсичность.