1-[w-(n,n-замещенные амино) алкил]-2-(2*991-ацилэтенил) пирролы или их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антиаритмической и противоишемической активностью

Формула изобретения

1-[-(N,N-замещенные амино)алкил]-2-(2¹-ацилэтенил) пирролы общей формулы



где 1-1 n 2, R C₂H₅, R¹ Ph;

1-2 n 3, R CH₃, R¹ Ph;

1-3 n 3 R C₂H₅, R¹ CH₃;

1-4 n 3, R C₂H₅, R¹ Ph;

1-5 n 3, R C₂H₅, R¹ p-BrC₆H₄;

1-6 n 3, R C₂H₅, R¹ p-ClC₆H₄;

1-7 n 3, R C₂H₅, R¹ p-MeOC₆H₄;

1-8 n 3, R C₂H₅,

1-9 n 3, R C₂H₅,

1-10 n 3, R¹ Ph,

и их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антиаритмической и противоишемической активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области химии биологически активных соединений, конкретно к новой группе 1,2-замещенных пиррола-1-[w-(N,N-замещенным амино)алкил] -2-(2¹-ацил-этинил)пирролам и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим антиаритмической и противоишемической активностью, общей формулы

(I)

где n 2 или 3, R C₁-C₂-алкил или RR вместе с атомом азота составляют остаток насыщенного гетероцикла, R¹-Me, арил.

Указанные соединения (I), их свойства и способ получения в литературе не описаны.

Наиболее близким прототипом по химическому строению являются 2-пирролилкетоны [1] Однако описанные соединения отличаются от заявляемых не только по структуре, но и по их фармакологическим свойствам. Так, они обладают анальгетическим, антигистаминным и местноанестезирующим действием. Прототипом для данного ряда соединения по фармакологической активности был выбран антогонист ионов Ca⁺⁺ верапамил, который, как известно, обладает выраженными антиаритмическими и антиишемическими свойствами [2] Более того, согласно предварительным данным, заявляемые соединения обладают способностью блокировать медленные Ca⁺⁺ каналы, т. е. обладают свойствами антагонистов ионов Ca⁺⁺.

Заявляемые соединения общей формулы (I) показали выраженное антиаритмическое действие при хлоридкальциевой, аконитиновой, строфантиновой интоксикациях и на модели Harris с двухстепенной перевязкой коронарной артерии. Кроме того, заявляемые соединения обнаружили способность защищать сердце от острого ишемического повреждения.

Соединения общей формулы (I) обладают малой токсичностью, большой терапевтической широтой, хорошо переносятся животными в эксперименте. Указанные фармакологические и токсикологические результаты позволяют применять соединения для лечения аритмий.

Цель изобретения синтез новых производных пиррола общей формулы (I), обладающих противоаритмическим и антиишемическим действием, в основе которого, согласно предварительных данных, лежит способность этих соединений блокировать медленные Ca⁺⁺ каналы, т.е. проявлять свойства антагонистов ионов Ca⁺⁺.

1-[w-(N, N-замещенные амино)алкил] -2-(2¹-ацилэтенил)пирролы I получают конденсацией в среде абсолютного этилового спирта соответствующего 1-замещенного пирролоальдегида III с соответствующим кетоном IV по следующей схеме:



где II_1-10.

II-1 n=2, R=C₂H₅, R¹=Ph; HX=HOOCCH₂C(OH)COOHCH₂COOH;

II-2 n=3, R=CH₃, R¹=Ph; HX=HOOCCH₂(OH)COOHCH₂COOH;

II-3 n=3, R=C₂H₆, R¹=CH₃; HX=HOOCCH₂(OH)COOCH₂COOH;

II-4 n=3, R=C₂H₅, R¹=Ph; HX=HOOCCH₂(OH)COOHCH₂COOH;

II-5 n=3, R=C₂H₅, R¹=4-BrC₆H₄; HX=HOOCCH₂(OH)COOHCH₂COOH;

II-6 n=3, R=C₂H₅, R¹=4-ClC₆H₄; HX=HOOCCH₂(OH)COOHCH₂COOH;

II-7 n=3, R=C₂H₅, R¹=4-MeOC₆H₄; HX=HOOCCH₂COOH;

II-8 n=3, R=C₂H₅, HX=HOOCCH₂(OH)COOHCH₂COOH;

II-9 n=3, R=C₂H₅, HX=COOHCOOH;

II-10 n=3, R¹=Ph; HX=COOHCOOH.

Конденсацию проводят в среде метилового или этилового спиртов в присутствии соответствующего алкоголята натрия при комнатной температуре. Затем реакционную массу обрабатывают водой, продукты конденсации экстрагируют органическим растворителем и выделяют перегонкой в вакууме.

Соединения (I, 1-10) представляют собой вязкие высококипящие масла, не растворимые в воде и растворимые в органических растворителях. Часть из полученных соединений при стоянии кристаллизуется.

Соли кислотного присоединения (II, 1-10) получаются при взаимодействии спиртовых растворов соответствующих оснований (I, 1-10) и соответствующих органических кислот. Были получены соли с щавелевой и лимонной кислотами. Соли (II, 1-10) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого цвета, растворимые в воде, водном спирте, не растворимые в эфире, бензоле.

Строение синтезированных соединений I II подтверждено результатами элементного анализа и спектральными данными. Так, в ПМР спектре вещества 1-4 имеются мультиплет 5,3-H протонов ( 6,6-6,8 m.q) и дублет дублетов 4-H протона (6,1 m.q) пиррольного цикла. Протоны фенильного радикала образуют мультиплет (d 7,2 7,4 m.q) для пара- и мета-протонов и мультиплет (d 7,9 8,0 m. q) для орто-протонов. Протоны двух метильных групп и метиленовые протоны при C1¹ дают триплеты соответственно при (d 0,9 m.q) и (d 4,1 m.q). Протоны трех метиленовых групп при атоме азота образуют мультиплет (d 2,1 2,6 m.q). Центрированный мультиплет при (d 1,8 m.q) соответствует метиленовым протонам при C-2¹. Протоны при двойной углеродной связи дают два дублета (d 7,1 m.q) и (7,7 m. q) соответственно для H¹-1 и H¹-2. Целевые вещества I и II могут быть цис- или транс-изомерами либо представлять собой смесь пространственных изомеров. Из данных ПМР-спектров следует, что константа спин-спинового взаимодействия протонов при двойной углеродной связи равна 16 Гц и отсутствует константа вицинального взаимодействия протонов 9 Гц. Из этих результатов следует, что полученные соединения I и II являются транс-изомерами.

Экспериментальная химическая часть

Пример 1. 1-[2¹-(диэтиламино)этил]-2-(3 ¹ -оксопропен-1-ил)пиррол (I-1)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл асб.этанола прибавляют при температуре 10 15^oC раствор 2,64 (0,022 моль) ацетофенона в 10 мл абс. этанола и раствор 3,88 г (0,02 моль) 1-[2¹-(диэтиламино)этил]пиррол-2-альдегида (III-I) в 10 мл абс.этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3x30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакуум, собирая фракцию с т.кип. 208 210^oC при 1 мм рт. ст. Получают 3,73 г (63%) I-1.

Найдено, C 76,97; H 8,19; N 8,97; C₁₉H₂₄N₂O.

Вычислено, C 76,99; H 8,16; N 9,45.

ГИДРОЦИТРАТ II-1

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 2,96 г (0,01 моль) I-1 в 5 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола, т.пл. 89 90^oC. Получают 2,88 г (57%) II-1.

Найдено, C 61,12; H 6,51; N 5,62; C₁₉H₂₄N₂O C₆H₈O₇.

Вычислено, C 61,46; H 6,6; N 5,73.

Пример 2. 1-[3¹-(диметиламино)пропил] -2-(3¹-фенил-3¹-оксопропен-1-ил)пиррол (I-2).

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс. этанола прибавляют при температуре 10 15^oC раствор 2,64 г (0,22 моль) ацетофенона в 10 мл асб. этанола и раствор 3,6 г (0,02 моль) 1-[3³-(диметиламино)пропил]пиррол-2-альдегида (III-2) в 10 мл абс. этанола. Реакционную массу оставляют на 6 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют 3x30 мл бензола. Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 215 216^oC при 2 мм рт.ст. Получают 4,5 г (58,5%) I-2.

Найдено, C 76,97; H 7,65; N 9,82; C₁₈H₂₂N₂₂O.

Вычислено, C 76,56; H 7,85; N 9,92.

ГИДРОЦИТРАТ II-2

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 2,82 г (0,01 моль) I-2 в 5 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 2,66 г (54%) II-2, т.пл. 104-106^oC.

Найдено, C 60,62; H 6,35; N 6,20; C₁₈H₂₂N₂O C₆H₈O₇.

Вычислено, C 60,75; H 6,37; N 5,9.

Пример 3. 1-[3¹-(диэтиламино)пропил] -2-(3¹-метил-3¹-оксопропен-1-ил)пиррол (I-3).

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс. этанола прибавляют при температуре 10 15^oC раствор 1,28 г (0,022 моль) ацетона в 10 мл абс. этанола и раствор 4,16 г (0,02 моль) 1-[3¹-(диэтиламино)пропил]пиррол-2-альдегида (III-3) в 10 мл абс. этанола.

Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3х30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 181-183^oC при 2 мм рт. ст. nd²³ 1,5725. Получают 2,4 г (54%) I-3.

Найдено, C 72,37; H 9,68; N 11,08; C₁₅H₂₄N₂O.

Вычислено, C 72,54; h 9,74; N 11,28.

ГИДРОЦИТАТ II-3

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 2,48 г (0,01 моль) I-3 в 5 мл этилового спирта. Выпавший осадок отфильтровывают из этилового спирта. Получают 2,37 г (54%) I-3, т.пл. 87-89^oC.

Найдено, C 57,09; H 7,40; N 6,50; C₁₅H₂₄N₂O C₆H₈O₇.

Вычислено, C 57,26; H 7,32; N 6,36.

Пример 4. 1-[3¹-(диэтиламино)пропил] -2-(3¹-фенил-3¹-оксопропен-1-ил)пиррол (I-4).

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс. этанола прибавляют при температуре 10-15^oC раствор 2,64 г (0,022 моль) ацетофенона в 10 мл абс. этанола и раствор 4,16 (0,02 моль) III-3 в 10 мл абс. этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3х30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 224-226^oC при 2 мм рт. ст. При стоянии кристаллизовалось, т.пл. 46-48^oC. Получают 3,72 г (60%) I-4.

Найдено, C 77,64; H 8,34; N 9,00; C₂₀H₂₆N₂O.

Вычислено, C 77,88; H 8,44; N 9,02.

ГИДРОЦИТАТ II-4

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 3,1 г (0,01 моль) I-4 в 10 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 3,1 г (60%) II-4, т.пл. 118-119^oC.

Найдено, C 62,09; H 6,68; N 5,83; C₂₀H₂₆N₂O C₆H₈O₇.

Вычислено, C 62,14; H 6,82; N 5,57.

Пример 5. 1-[3¹-(диэтиламино)пропил] -2-[3¹-(p-бромфенил)-3¹-оксопропен-1-ил]-пиррол (1-5)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс.этанола прибавляют при температуре 10-15^oC раствор 4,38 г (0,022 моль) p-бромецетофенона в 10 мл абс. этанола и раствор 4,16 г (0,02 моль) III-3 в 10 мл абс. этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3х30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 228-230^oC при 1 мм рт.ст. Получают 4,2 г (54% ) I-5.

Найдено, C 61,3; H 6,32; N 7,1; C₂₀H₂₅N₂OBr.

Вычислено, C 61,7; H 6,47; N 7,19.

ГИДРОЦИТАТ II-5

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 3,89 г (0,01 моль) I-5 в 10 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 3,3 г (57%) II-5, т.пл. 117-118^oC

Найдено, C 53,58; H 5,67; N 4,52; C₂₀H₂₅N₂OBr C₆H₈O₇.

Вычислено, C 53,71; H 5,72; N 4,82.

Пример 6. 1-[3¹-(диэтиламино)пропил] -2-[3¹-(p-хлорфенил)-3¹-оксопропен-1-ил]-пиррол (I-6)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс.этанола прибавляют при температуре 10-15^oC раствор 3,39 г (0,022 моль) р-хлорацетофена в 10 мл абс.этанола и раствор 4,16 г (0,02 моль) III-3 в 10 мл абс.этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3х30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 240-242^oC при 2 мм рт.ст. Получают 3,56 г (52%) I-6.

Найдено, C 69,32; H 7,15; N 8,05; C₂₀H₂₅N₂OCl.

Вычислено, C 69,65; H 7,31; N 8,12.

ГИДРОЦИТАТ II-6

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 3,45 г (0,01 моль) I-6 в 10 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 3,0 г (5,55%) II-6, т.пл. 122-123^oC.

Найдено, C 57,95; H 5,97; N 4,97; C₂₀H₂₅N₂OCl C₆H₈O ₇.

Вычислено, C 58,15; H 6,19; N 5,22.

Пример 7. 1-[3¹-(диэтиламино)пропил] -2-[3 ¹ -(p-метоксифенил)-3¹-оксопропен-1-ил] пиррол (I-7)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс.этанола прибавляют при температуре 10-15^oC раствор 3,3 г (0,022 моль) p-метоксиацетофена в 10 мл абс.этанола и раствор 4,16 г (0,02 моль) III-3 в 10 мл абс. этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3х30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 232-233^oC при 1 мм рт.ст. Получают 3,54 г (52%) I-7.

Найдено, C 73,88; H 8,11; N 8,11; C₂₁H ₂₈N₂O₂.

Вычислено, C 74,08; H 8,29; N 8,23.

ГИДРОЦИТАТ II-7

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 3,4 г (0,01 моль) I-7 в 10 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 2,9 г (54%) II-7, т.пл. 109-110^oC.

Найдено, C 60,48; H 6,62; N 5,29; C₂₁H ₂₈N₂O₂ C ₆H₈O₇.

Вычислено, C 60,89; H 6,81; N 5,26.

Пример 8. 1-[3¹-(диэтиламино)пропил]-2-(3¹-тиенил-3¹-оксопропен-1-ил)-пиррол (I-8)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс.этанола прибавляют при температуре 10-15^oC раствор 2,77 г (0,022 моль) 2 - ацетилтиофена в 10 мл абс.этанола и раствор 4,16 г (0,02 моль) III-3 в 10 мл абс.этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3х30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т. кип. 216-218^oC при 2 мм рт.ст. При стоянии кристаллизовалось, т.пл. 52-4^oC. Получают 3,6 г (57%) I-8.

Найдено, C 68,11; H 7,45; N 8,71; C₁₈H₂₄N₂OS.

Вычислено, C 68,31; H 7,64; N 8,85.

ГИДРОЦИТРАТ II-8

К раствору 2,31 г (0,011 моль) лимонной кислоты в 10 мл этанола прибавляют 3,16 г (0,01 моль) I-8 в 10 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 3,2 г (63%) II-8, т.пл. 80 81^oC.

Найдено, C 56,53; Н 6,30; N 5,85; C₁₈H₂₄N₂OS C₆H₈O₇.

Вычислено, C 56,68; H 6,34; N 5,51.

Пример 9. Гидрооксалат 1-[3¹- (диэтиламино)пропил] -2-(3¹-антрацил-3¹-оксопропен-1-ил)-пиррол (I-9)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) метилата натрия в 10 мл абс.метанола прибавляют раствор 4,62 г (0,021 моль) 10-ацетилантрахинона в 40 мл абс. метанола и раствор 4,16 г (0,02 моль) III-3 в 10 мл абс.метанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3x30 мл). Бензол упаривают, остаток кристаллизуют из этанола, т.пл. 72 73^oC. Получают 4,35 г (53%) I-9.

Найдено, C 81,97; H 7,24; N 6,76; C₂₈H₃₀N₂O.

Вычислено, C 81,91; Н 7,36; N 6,82.

ОКСАЛАТ II-9

К раствору 1,39 г (0,011 моль) щавелевой кислоты в 20 мл этанола прибавляют раствор 4,1 г (0,01 моль) I-9 в 10 мл этанола. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 3,2 г (64%) II-9, т. пл. 183 184^oC.

Найдено, C 71,68; H 6,79; N 5,46; C₂₈H₃₀N₂O C₂H₂O₄.

Вычислено, C 71,98; H 6,44; N 5,6.

Пример 10. 1-[3¹-(морфолил)пропил] -2-(3¹-фенил-3 ¹-оксопропен-1-ил)-пиррол (I-10)

К раствору 1,36 г (0,02 моль) этилата натрия в 10 мл абс. этанола прибавляют при температуре 10 15^oC раствор 2,64 г (0,022 моль) ацетофенона в 10 мл абс.этанола и раствор 4,44 г (0,02 моль) 1-[3¹-(морфолил)пропил]пиррол-2-альдегида (III-4) в 10 мл абс. этанола. Реакционную массу оставляют на 3 сут. обрабатывают 50 мл воды и экстрагируют бензолом (3x30 мл). Бензол упаривают, остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию с т.кип. 260 262^oC при 1 мм рт.ст. Получают 3,69 г (57%) I-10.

Найдено, C 73,88; H 7,23; N 8,45; C₂₀H₂₄N₂O₂.

Вычислено, C 74,04; Н 7,46; N 8,63.

ОКСАЛАТ II-10

К раствору 1,39 г (0,011 моль) щавелевой кислоты в 20 мл этанола прибавляют раствор 3,24 г (0,01 моль) I в 15 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из этанола. Получают 2,19 г (57%) II-10.

Найдено, C 63,55; H 6,17; N 6,68; C₂OH₂₄N₂O₂ C₂H₂O₄.

Вычислено, C 63,75; H 6,3; N 6,77.

Фармакологическая часть

Пример 1. Определение LD₅₀ заявляемых соединений

Определение LD₅₀ производили по стандартной методике [3] в опытах на беспородных половозрелых белых мышах обоего пола массой 18 20 г.

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Пример 2. Сравнительное изучение антиаритмической активности заявляемых соединений и прототипов на модели хлоридкальциевой аритмии

Хлоридкальциевую аритмию вызывали внутривенным введением 10% -ного раствора хлорида кальция в дозе 250 мг/кг и выше. Аритмия развивается через 3 5 мин и связана в основном с нарушениями функции возбудимости и проводимости или же одновременно обеих функций. Вначале подбирали дозу хлорида кальция, вызывающую летальную фибрилляцию желудочков, затем исследуемые соединения вводили внутривенно за 1 мин до введения установленной летальной дозы хлорида кальция.

Оценку антиаритмического действия соединений проводили по уменьшению количества случаев летальной фибрилляции желудочков.

Результаты экспериментов представлены в табл. 2. В качестве препаратов сравнения использовали верапамил и дилтиазем.

Как видно из табл. 2, все заявляемые соединения на данной модели проявляют антиаритмическую активность, а соединения 1-4, 1-3 и 1-8 по своей антиаритмической активности превосходят прототипы.

Пример 3. Сравнительное изучение влияния заявляемых соединений и прототипов на порог электрической фибрилляции сердца

Опыты проводили на анестезированных кошках (нембутал, 40 мг/кг веса тела животных, в/в) массой 2,7 3,0 кг. Порог электрической фибрилляции желудочков сердца определяли повторяющимся сканированием электрически уязвимого периода сердечного цикла (восходящая часть зубца T на ЭКГ) серией из 20 прямоугольных импульсов постоянного тока увеличивающейся интенсивности (длительность импульса 4 мс, частота 50 имп/с) до возникновения фибрилляции. Величина порога фибрилляции оценивалась по минимальной интенсивности тока (в миллиамперах), вызывающей фибрилляцию. Исследуемые соединения вводили за 5 мин до стимуляции (табл. 3).

Как следует из представленных результатов, все заявляемые соединения в той или иной степени проявляют антифибрилляторную активность. Наиболее эффективными на данной модели оказались соединения 1-4, 1-7 и 1-9.

Пример 4. Сравнительное изучение антиаритмических свойств заявляемых соединений в сравнении с прототипами на модели Харриса

У собак за сутки до начала эксперимента перевязывали сгибающую ветвь левой коронарной артерии на 3 5 мм ниже выхода из-под ушка. Согласно данным модели [4] и собственным наблюдениям через 24 ч у собак, оперированных таким образом, развивается стойкая политопная левожелудочковая экстрасистолия.

Заявляемые соединения вводили через 24 ч от момента перевязки. Оценивали продолжительность и интенсивность эффекта.

Полученные результаты представлены в табл. 4.

Полученные в этой серии экспериментов данные свидетельствуют о том, что на данной модели патологии наибольшую эффективность проявляет соединение 1-4, которое по интенсивности и продолжительности эффекта значительно превосходит прототип. Вместе с тем следует подчеркнуть, что все заявляемые соединения в той или иной мере на модели Харриса проявляют антиаритмическую активность.

Пример 5. Изучение влияния заявляемых соединений на основные показатели гемодинамики и деятельности сердца у анестезированных животных с острой ишемией миокарда

Опыты проводили на беспородных взрослых кошках обоего пола массой 2,5 - 3,5 кг, анестезированных нембуталом (40 мг/кг, в/в). Животных переводили на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью под контролем показателей крови (pH 7,35 7,45; pO₂ выше 90 мм рт.ст.). Температуру тела животного поддерживали на постоянном уровне.

Катетеризировали бедренную вену для введения соединений и бедренную артерию для измерения системного артериального давления, а также для забора проб крови на газовый анализ.

На восходящую часть дуги аорты имплантировали датчик электромагнитного расходомера крови.

В полость левого желудочка сердца через его верхушку вводили катетер для регистрации левожелудочкового давления и его первой и второй производных.

В течение всего эксперимента регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении.

На основании анализа регистрируемых кривых (кривые фазового кровотока в восходящей части дуги аорты, артериального и левожелудочкового давления; ЭКГ) определяли следующие показатели гемодинамики и деятельности сердца: среднее артериальное давление (САД); частоту сердечных сокращений (ЧСС); ударный и минутный объемы сердца; индекс энергетических затрат и работу сердца; сократимость миокарда.

Исследуемые соединения вводили с постоянной скоростью и в постоянном объеме. Соединения растворяли в физиологическом растворе. В контрольных сериях экспериментов животным вводили такой же объем растворителя.

Острую ишемию миокарда вызывали путем одномоментной перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на границе средней и нижней трети.

В контрольной серии экспериментов (табл.5) 60-минутная ишемия миокарда приводит к значительным нарушениям со стороны деятельности сердца и гемодинамики.

Данные о влиянии ряда заявляемых соединений и препарата сравнения верапамила на основные показатели гемодинамики и деятельности сердца в условиях общей ишемии миокарда представлены в табл. 6 9.

Таким образом, на основании полученных данных можно судить о том, что заявляемые соединения в условиях острой ишемии миокарда в определенной мере препятствуют развитию грубых нарушений со стороны гемодинамики и деятельности сердца. Наибольший эффект на этой модели проявило соединение 1 4, которое по своей активности не уступает прототипу.

Пример 6. Изучение влияния заявляемых соединений на внутрисердечную гемодинамику у анестезированных кошек с острой ишемией миокарда

У анестезированных кошек, у которых острая ишемия миокарда была вызвана одномоментной перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на границе средней и нижней трети, с помощью М-эхокардиографии оценивали:

1. D_s передне-задний размер левого желудочка в систолу;

2. B_b передне-задний размер левого желудочка в диастолу;

3. LEVT время сокращения задней стенки;

4. V_s объем левого желудочка в систолу;

5. V_d объем левого желудочка в диастолу;

6. S_v ударный объем сердца;

7. C_o минутный объем крови;

8. V_cf скорость циркуляторного укорочения миокарда;

9. HR частота сердечных сокращений;

10. EF фракция выброса;

11. DS степень укорочения передне-заднего размера левого желудочка.

Соединение 1 4 вводили внутривенно в дозе 5 мг/кг через 30 мин после окклюзии коронарной артерии.

Как видно из табл. 10, трехчасовая ишемия миокарда приводит к грубым нарушениям со стороны внутрисердечной гемодинамики.

Заявляемые соединения (табл. 11) в значительной мере препятствуют развитию нарушений внутрисердечной гемодинамики и поддерживают насосную функцию сердца на адекватном уровне.

Полученные в этой серии экспериментов данные хорошо коррелируют с результатами, приведенными в предыдущем примере, и позволяют сделать вывод о том, что заявляемые соединения обладают противоишемическими свойствами.

Пример 7. Изучение противоишемических свойств заявляемых соединений на ультраструктурном уровне

В опытах на анестезированных кошках ишемию миокарда вызывали путем одномоментной перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на границе средней и нижней трети. Через 3 ч от момента начала ишемии животных забивали, а миокард левого желудочка забирали для ультраструктурных исследований.

Для этой цели кусочки мышцы сердца экспериментальных животных субэндокардиальных областей и из глубины миокарда в ишемизированной и неишемизированной зонах фиксировали в 3,5%-ном растворе глютарового альдегида на 0,2 М какодилатном буфере (pH 7,1) с добавлением ионного и коллоидного (pH 8,2) лантана, постфиксировали в 1%-ной осмиевой кислоте на том же буфере и с добавлением того же трейсера, а после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации заключали в смесь эпона и аралдита.

Как показал электронно-микроскопический анализ контрольной серии, после трехчасовой ишемии в ишемизированных областях субэндокарда обнаруживаются отек саркоплазмы кардиомиоцитов, снижение количества гранул глюкогена вплоть до полной элиминации, образование крупных вакуолей, происходящих как из дилатированного саркоплазматического ретикулума, так и из погибших резко отечных митохондрий. Особенно выраженным был отек в околоядерной саркоплазме, отмечалась маргинация хроматина в ядрах кардиомиоцитов. Встречались кардиомиоциты с относительно сохранной ультраструктурой, слегка просветленной межфибриллярной саркоплазмой, однако в них отмечался локальный лизис миофибрилл. Ионный лантан можно было видеть как на границе кардиомиоцитов, так и внутри их саркоплазмы, а также в митохондриях необратимо измененных кардиомиоцитов.

У животных, которым через 60 мин от момента начала ишемии было внутривенно введено соединение 1 4 (забор материала производили также, как и в контрольной серии: через 3 ч от момента начала ишемии) в кардиомиоцитах ишемизированного субэндокарда выявлялись незначительные участки просветления и отека межфибриллярного пространства, незначительное снижение числа цитогранул гликогена, выявлялись отдельные липидные включения, лизосомы, небольшие вакуоли, происходящие из лишенных крист митохондрий, однако основная масса митохондрий имела интактную структуру. В ишемизированном субэндокарде ионный лантан не проникал через сарколемму кардиомиоцитов, он скапливался на границе клеток, а также наблюдался в субсарколеммальных везикулах.

Полученные результаты свидетельствуют о выраженном противоишемическом действии заявляемых соединений.

Пример 8. Изучение влияния заявляемых соединений в сравнении с прототипом на рецепторы дигидропиридиновых блокаторов входа Ca⁺⁺ в эмбриональных фибробластах человека

Известно, что эмбриональные фибробласты человека содержат L-потенциалзависимые кальциевые каналы, избирательно блокирующиеся дигидропиридиновыми антагонистами ионов Ca⁺⁺ (к ним относятся: фенилалкиламины верапамил; тиобензазепины дилтиазем и 4-арил-1,4-дигидропиридины нифедипин, нитрендинин) [5]

Дигидропиридиновые блокаторы являются наиболее избирательными и высокоэффективными ингибиторами входа ионов Ca⁺⁺. Причем константы сродства этих соединений к участкам связывания в составе кальциевого канала находятся в диапазоне 5 10^-10 5 10^-9 M [6] В этом интервале концентраций практически полностью отсутствуют какие-либо эффекты этих соединений на другие регуляторные системы клеток: калмодулиновую [7] фосфодиэстеразную [8] атфазную [9] и др. Поэтому принято считать, что существует прямая связь между рецепторами дигидропиридиновых блокаторов и кальциевыми каналами L-типа в плазматической мембране клеток, для которых характерным является наличие одного класса невзаимодействующих участков связывания дигидропиридиновых кальциевых антагонистов. Правомерность этого вывода прямо подтверждается данными об идентификации полноценных кальциевых каналов в искусственных мебранах, содержащих реконструированные очищенные рецепторы дигидропиридиновых блокаторов [10]

Кроме того, известно, что фибробласты эмбриона человека, помещенные в коллагеновый гель, вызывают его контракцию [11] в основе которой лежит увеличение концентрации в цитоплазме свободных ионов Ca⁺⁺ [12] регуляция содержания которых осуществляется через дигидро-пиридин-зависимые Ca⁺⁺ каналов фибробластов (каналы L-типа) [13]

В работе использовали фибробласты эмбриона человека, приготовление коллагенового геля и измерение концентраций производили согласно стандартной методике [14]

В результате исследований показано (табл. 12), что заявляемые соединения, также как и прототипы, блокируют кальций-зависимые L-каналы эмбриональных фибробластов, т.е. проявляются свойства антагонистов ионов Ca⁺⁺.

Пример 9. Изучение влияния заявляемых соединений на трансмембранные ионные токи через мембрану кардиомиоцитов

В предыдущем примере была показана способность ряда заявляемых соединений препятствовать контракции геля эмбриональных фибробластов человека, что позволяет высказывать предложение о возможности блокады под влиянием этих соединений потенциалзависимых Ca⁺⁺ каналов. Однако для более определенного ответа на этот вопрос представлялось необходимым непосредственно оценить влияние заявляемых соединений на величину трансмембранных ионных токов.

Опыты проводили согласно стандартной методике, описанной в работе [16]

В экспериментах с фиксацией потенциала на препарате предсердной трабекулы лягушки, помещенном в систему двойного сахарозного мостика, показано, что при перфузии трабекулы стандартным раствором Рингера, содержащим соединение 1-4 в концентрации 10 мм, наблюдалось уменьшение величины суммарного входящего тока при всех значениях мембранного потенциала (табл. 13).

Так, при значении деполяризующего мембранного потенциала 40 мВ, при котором наблюдается максимальная величина входящего тока, равная 1,56 мкА, угнетение составляет 68% При дальнейшем возрастании величины деполяризующего мембранного потенциала до 50 и 60 мВ усиливается угнетающее действие на величину входящего тока, максимально составляя 82,5 при 60 мВ.

При изучении влияния соединения 1-4 на величину медленного входящего Ca⁺⁺ тока в тех случаях, когда быстрый входящий Na⁺ ток устранялся заменой в растворе NaSl на эквивалентное количество холинхлорида, показано, что соединение 1-4 полностью блокировало медленный входящий Ca⁺⁺ ток при любых значениях деполяризующего мембранного потенциала (табл. 14).

При изучении влияния соединения 1-4 (10 нМ) на быстрый входящий Na⁺ ток показано, что оно в определенной степени предупреждает стимулирующее влияние PGL₂-Na на мембранные токи (ранее К. Келеменом с соавт. показано, что простациклин (PGL₂-Na) в безкальциевой среде увеличивает быстрый входящий Na⁺ ток через мембрану кардиомиоцитов [15]

Таким образом, согласно данных, полученных при изучении влияния заявляемых соединений на величину трансмембранных ионных токов показано, что соединение 1-4 полностью прекращает медленный входящий Ca⁺⁺ и в определенной мере уменьшает быстрый входящий Na⁺ токи через мембрану кардиомиоцитов.

При сравнении полученных нами данных относительно влияния заявляемых соединений на величину медленного входящего Ca⁺⁺ тока через мембрану кардиомиоцитов с материалами, известными из литературы [17, 18] следует отметить, что заявляемые соединения по интенсивности и длительности блокады медленного трансмембранного Ca⁺⁺ тока превосходит прототипы верапамил и дилтиазем.

Таким образом, согласно данных фармакологических исследований приведенные выше заявляемые соединения обладают выраженной антиаритмической и противоишемической активностью и в ряде случае в значительной мере превосходят по интенсивности действия прототипы верапамил и дилтиазем.

Основываясь на наших данных, можно высказать предположение о том, что определяющую роль в реализации антиаритмического и противоишемического эффектов заявляемых соединений играет их способность блокировать медленные Ca⁺⁺ каналы мембраны кардиомиоцитов, т.е. заявляемые соединения проявляют свойства, присущие антагонистам ионов Ca⁺⁺.