способ стереоспецифического анализа и способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа

Формула изобретения

1. Способ стереоспецифического анализа, включающий инкубацию анализа с иммобилизованным на твердой фазе первым антианалитом с последующим проявлением связанного аналита конъюгатом второго антианалита с цветной суспензоидной меткой, отличающийся тем, что в качестве метки используют частицы углерода и красители из группы формазанов, диформазанов и суданов.

2. Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа, включающий соединение антианалита с суспензоидными частицами водонерастворимого красителя, отличающийся тем, что первоначально на частицах сорбируют содержащий функциональные группы водорастворимый полимер, который затем ковалентно пришивают к поверхности частиц и одновременно активируют обработкой гомо- или гетеробифункциональным реагентом, после чего полученный активированный комплекс ковалентно конъюгируют с антианалитом.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве сорбируемого на поверхности суспензоидных частиц полимера используют содержащий функциональные аминогруппы белок, предпочтительно бычий сывороточный альбумин, а в качестве стабилизирующего и активирующего соединения используют реагирующий с аминогруппами гомобифункциональный реагент, предпочтительно глутаровый диальдегид.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления безинструментальных и надежных диагностикумов для генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного анализа. Область применения изобретения может включать практику аналитических исследований в биологии, медицине, сельском хозяйстве, криминологии, выполняемых с фундаментальными или прикладными (диагностическими) целями.

Данное решение относится к объектам, один из которых предназначен для осуществления другого.

К настоящему времени в иммуноаналитической практике разработан ряд методов, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело, введение в него метки и ее визуализация тем или иным способом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический анализ (РИА) (Yalow R.S. Berson S.A. Nature, 1959, V. 184, p. 1648-1649), иммуноферментный анализ (ИФА) (Ngo T.T. Lenhoff H. M. Enzyme-mediated immunoassay, 1985, Plenum Press, New York.), био- и хемилюминесцентные иммуноанализы (Woodhead J.S. Weeks I. Pure Appl. Chem. 1985, v. 57, p. 523-529). Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определить любое соединение, против которого возможно получение специфических антител; избирательностью и специфичностью; высокой чувствительностью. Однако, наряду с достоинствами, у перечисленных (аналогичных заявляемому способу) методов анализа есть существенные недостатки. В первую очередь это опасность для здоровья, которую представляют введение изотопных меток, подготовка и выполнение РИА, а также использование токсических, канцерогенных хромогенов в ИФА; зависимость от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и ограниченно доступных реагентов, используемых либо в технологии изготовления диагностикумов, либо в самой процедуре анализа.

К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных аналиту соединений (анти-аналитов) оптически плотными частицами или водорастворимыми цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток латексы, в том числе цветные (Tarcha et al. Abbot Labs. Eur. pat. appl. 89116594.6), эритроциты (Guesdon J-L. Avrameas S. Ann. Immunol. 1980, v.131 C,p. 389-396), неметаллические коллоиды серы, селена, теллура (Yost et al. Eur.pat.appl. 88110459.0), полимеризованные красители Конго красный, Трипановый голубой, Lissamine blue (Henry Robert P. US Pat. 4.452. 886). Использование данных меток позволяет визуально определить присутствие аналита как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов) например, по агглютинации довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменению спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов, так и в многочисленных гетерогенных системах ЭритроИммуноАдсорбции и, более широко, Седиментационно-Адсорбционном (Иммуно) Анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блотинге, иммуно- и гибридофильтрации (Flow-Through анализах), иммуномиграции (иммунохроматографии) и ряде других по окрашиванию зоны специфического связывания аналита на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение аналита, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.

Наиболее близкими к заявленным объектам по технической сущности и достигаемому результату являются способ стереоспецифического анализа с использованием конъюгатов анти-аналита с частицами коллоидного золота и способ получения конъюгатов для данного анализа (Roth J. Heitz P.U. Immunolabeling with the Protein A Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484).

В анализе-прототипе инкубируемый с иммобилизованным на твердофазном носителе первым анти-аналита определяемый лиганд (аналит) детектируют вторым анти-аналитом, меченным частицами коллоидного золота. В процессе детекции конъюгатом "анти-аналит/коллоидное золото" осуществляют прямую визуализацию специфически связанного аналита. Таким образом исключается дополнительная стадия визуализации самого конъюгата (как, например, стадия субстратного проявления ферментных конъюгатов в дот-ИФА), что принципиально отличает названный прямой прототип от вышеперечисленных аналогов.

Основным недостатком прототипа является относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью (цветностью в видимом диапазоне светового спектра) частиц коллоидного золота, что связано как собственно с оптическими характеристиками, которые обусловлены химической природой самих коллоидов золота, так и с ограниченными размерами частиц коллоида. Практически прототип исключает возможность использования в анализе частиц, с размерами, превышающими 80 нанометров, что связано с невозможностью получения более крупных конъюгатов из-за их нестабильности в растворах. (Эффективность прямой визуализации связанного аналита определяется способностью моно- или полислоев частиц метки поглощать или отражать свет. Интенсивность процесса реагирования с светом понятным образом зависит от размеров частиц: чем больше размер до определенного предела, за которым возможно гидромеханическое удаление частиц из зоны связанного аналита в процессе отмывки твердофазного носителя от непрореагировавшего конъюгата тем эффективнее визуализация и выше чувствительность анализа). Указанные причины не позволяют прототипу достигать чувствительности, которая была бы эквивалентна чувствительности большинства известных аналогов (в первую очередь чувствительности наиболее широко используемого и популярного в реальной аналитической практике ферментного дот-анализа).

Что касается способа получения конъюгатов анти-аналита с цветной суспензоидной меткой, то в известном прототипе используют нековалентную процедуру конъюгирования, которая по существу заключается в простом соединении свежеприготовленного метастабильного коллоида золота с анти-аналитом в зоне определенных оптимальных концентраций последнего, которая для каждого конкретного анти-аналита должна быть подобрана в индивидуальных экспериментах. При этом в соединении двух названных реагентов участвуют только нехимические адсорбиционные связи, которые существенно слабее ковалентных. В результате получаемые в прототипе конъюгаты не являются достаточно стабильными, что осложняет возможность их длительного хранения и, кроме того, накладывает ряд существенных ограничений на их использование в самих процедурах анализа - например, не позволяет использовать обычно применяемые в подавляющем большинстве твердофазных анализов с целью подавления неспецифических взаимодействий детергенты, которые способны разрушить нековалентный конъюгат "анти-аналит/коллоидное золото". В целом описанные характеристики критикуют прототип с позиций его неудовлетворительной надежности.

Задачей создания изобретения является увеличение чувствительности систем детекции для широкой группы перечисленных выше безинструментальных методов стереоспецифического анализа, а также увеличение надежности анализа и повышение стабильности конъюгатов для детекции.

Первую поставленную задачу решают путем использования в качестве метки второго анти-аналита частиц углерода и водонерастворимых красителей из группы формазанов, диформазанов и суданов. Данные метки отличаются от используемого в прототипе золота очень высокой степенью оптической плотности в видимом диапазоне светового спектра. Кроме того, заявляемый способ получения конъюгата для анализа, в отличие от прототипа, не ограничивает размеры конъюгата, что дополнительно позволяет увеличивать чувствительность заявляемого способа анализа.

Задачу повышения надежности анализа и стабильности используемых в анализе детектирующих реагентов решают путем ковалентного конъюгирования анти-аналита с цветными суспензоидными частицами. Для этого частицы покрывают водорастворимым полимером, который является инертным амфипатическим соединением, способным относительно прочно сорбироваться на поверхности частиц. Сорбция полимера позволяет получить стабильный в растворах суспензоид цветной метки. Сорбированный полимер экспонирует в водную фазу функциональные группы, способные ковалентно реагировать с гомо- и/или гетеробифункциональными конъюгирующими соединениями. Последующая обработка полученного комплекса бифункциональным реагентом, взятым в большом молярном избытке по отношению к функциональным группам полимера, приводит к ковалентной сшивке между сорбированными молекулами полимера и одновременно к внедрению на поверхность комплекса реакционноспособных групп бифункционального реагента. Последующее соединение освобожденной от избытка конъюгирующего реагента активированной метки с интактным (немодифицированным) анти-аналитом завершается ковалентной пришивкой молекул анти-аналита к поверхности цветной метки. В результате заявленный способ позволяет получать конъюгаты прочной ковалентной структуры, которые устойчивы в растворах, в том числе в присутствии высоких концентраций детергентов, и очень стабильны при длительном хранении в широких температурных пределах (которые зависят только от природных характеристик анти-аналитов). Двухэтапный характер конъюгирования создает дополнительное преимущество, делая заявляемый способ более надежно воспроизводимым независимо от диапазона концентраций тех или иных анти-аналитов. Создаваемый способом положительный эффект в целом характеризуется существенно большей по сравнению с прототипом надежностью и универсальностью.

Заложенный в заявляемый способ принцип двухэтажного ковалентного конъюгирования представляет возможность для очень широкого выбора конкретных сорбируемых полимеров и активирующих/конъюгирующих реагентов. Данное обстоятельство вынуждает заявителей представить формулу изобретения, составленную в принципиальных терминах, попытка конкретизации которых неминуемо привела бы к сужению области действия заявляемых объектов.

В представленных ниже конкретных примерах описан способ получения детектирующих конъюгатов, осуществляемый с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве сорбируемого на поверхности частиц цветной суспензоидной метки полимера и глутарового альдегида в качестве сшивающего (гомо) бифункционального реагента. Использование данных веществ не является принципиальным для осуществления способа. Вместо БСА могут быть эффективно использованы другие как натуральные так и синтетические водорастворимые полимеры, способные сорбироваться на гидрофобных поверхностях и несущие на своей поверхности доступные для ковалентного реагирования функционально активные группы. Такими реагентами могут быть другие белки (иммуноглобулины, желатины) и смеси белков (например, сыворотки) а также искусственные полимерные соединения. Вместо глутаральдегида могут быть использованы другие известные гомо- и гетеробифункциональные соединения, которые в реакциях второго порядка способны реагировать предпочтительно с наиболее универсально представлеными в возможных анти-аналитах и анти-анти-аналитах первичными аминогруппами (хотя, для ковалентного конъюгирования с суспензоидными метками таких анти-аналитов, как Fab" фрагменты антител, более оптимальными могут оказаться, например, малеимидные реагенты, участвующие в реакциях тиол-дисульфидного обмена).

Использование бычьего сывороточного альбумина (БСА) и глутаральдегида является предпочтительным, поскольку дополнительно отвечает требованию универсальности предлагаемого способа. БСА содержит большое количество (до 63-х) доступных для реагирования первичных аминогрупп, а глутаральдегид является гомобифункциональным реагентом, относительно специфично реагирующим с первичными аминогруппами белков. Кроме того, немаловажным обстоятельством является доступность и практически самая низкая стоимость БСА и глутаральдегида, что также выгодно отличает именно эти реагенты от возможных других, использование которых в рамках данного способа с экономической точки зрения, очевидно, является менее выгодной возможностью.

Примеры конкретного выполнения.

Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных детектирующих реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом.

Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемых способов с точки зрения их существенных отличий, которыми в наиболее широком смысле являются использование новых цветных суспензоидных меток в стереоспецифическом анализе и их двухэтапное ковалентное конъюгирование с анти-аналитами.

Пример 1.Получение реагентов активированных цветных суспензоидных меток.

К 20 мл раствора Бычьего Сывороточного Альбумина (БСА) 1-50 мг/мл в 0,01 0,2 М фосфатном Буферном Растворе pH 6-8,5 (ФБР) добавляют 0,1-2 грамма углерода. Смесь перемешивают на магнитной мешалке или роторном встряхивателе типа "Vortex" в течение времени, достаточного для полной предварительной пептизации (смачивания) частиц углерода. Полученную суспензию озвучивают в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обработки суспензии (интенсивность и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирают таким образом, чтобы разбиваемая суспензия при одновременном (возможном) охлаждении не разогревалась до температуры свыше 40^oC. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугируют при 6000 г в течение 5-10 мин с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. Покрытые БСА суспензоидные частицы углерода с размерами 50-350 нм, содержащиеся в супернатанте, в дальнейшем активируют раствором глутаральдегида. Диапазон эффективных концентраций реагента 1-25% время активации от 20 до 120 мин.

Активированный суспензоид освобождают от избытка глутаральдегида и несвязанного БСА 3х-4х кратным центрифугированием или гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В, CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков.

Описанный конкретный способ получения активированного суспензоида на основе коллоидного углерода позволяет в дальнейшем синтезировать конъюгаты черного цвета. Способ получения суспензоидных конъюгатов другого цвета ничем принципиально не отличается от описанного. Для синтеза конъюгатов красного цвета используют Судан II, темно-красного Судан III, серого Судан черный, фиолетового -Тетразолиевый фиолетовый формазан, темно-фиолетового - Неотетразолиевый диформазан, синего Тетразолиевый синий диформазан.

Рабочая концентрация конъюгатов, используемая в анализах составляет 0,03 в пересчете на сухой вес метки.

2. Получение конъюгатов активированных суспензоидных меток (АСМ) с анти-аналитами (Белком А, Стрептавидином, Антителами).

На роторном встряхивателе соединяют 9 объемов АСМ с 1 объемом раствора анти-аналита в ФБР в концентрации, позволяющей получить конечную концентрацию в объеме реакции от 0,1 до 2,0 мг/мл. Реакцию проводят в течение 2-4 ч при комнатной температуре. Полученные конъюгаты освобождают от избытка анти-аналита центрифугированием или гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков, фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяют и добавляют БСА и глицерин до конечных концентраций соответственно 1% и 20%

По описанной схеме были синтезированы конъюгаты Белок А Углерод, использованные в нижеописываемых примерах анализа (п.п. 1.и 2.), Стрептавидин-Углерод, Стрептавидин-Судан III, Стрептавидин-Тетразолиевый синий диформазан, Стрептавидин-Неотетразолиевый диформазан (п.3), Анти-ХГЧ антитела (АВ 0421) Углерод (п.4).

Способ анализа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Иммунохроматографическое определение IgG человека с использованием конъюгата Белок А Углерод в сравнении с Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нанометров.

В анализе использовали полоски нитроцеллюлозы (Millipore) с размерами пор 5 микрометров с иммобилизированными на них в виде пятен IgG человека (наносимый объем 0,001 мл.) из кратных 10 разведений 1мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл. Край полоски, предварительно блокированной в растворе 1 казеина в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,05 Твина 20 (ФБР-Тв.), помещали в раствор конъюгатов на 10-15 сек. (время, достаточное для прохождения за счет капиллярных сил фронтом реагентов расстояния около 10 мм. ), а затем в ФБР-Тв. По мере прохождения фронтом мигрирующего диагностикума зоны иммобилизации лиганда наблюдали проявление в виде черных пятен результатов анализа. Чувствительность системы детекции с использованием конъюгата Белок А Углерод составляла 10 пг/пятно, с конъюгатом Белок А Золото 100 пг/пятно.

Пример 2. Серологическое определение анти-ВИЧ антител на непористой твердой фазе с использованием конъюгата Белок А Углерод.

В качестве твердой фазы использовали планшеты для серийных разведений из полистирола, внутреннюю поверхность лунок которых покрывали суммой синтетических пептидов, представляющих собой детерминанты основных структурных белков ВИЧ-1,3, на которую наносили по 0,001 мл. сыворотки кролика против ВИЧ антигенов из разведений кратных двум. После 15 мин инкубации и отмывки ФБР-Тв. в лунки вносили конъюгат Белок А Углерод на 15 мин, после чего, удалив конъюгат, наблюдали результаты анализа в виде четких контрастных пятен. Параллельно связанные антитела определяли Белком А, меченным пероксидазой хрена. Чувствительность анализа оценивали по конечному разведению сыворотки, дающему отличное от фона пятно. В результате сравнительного анализа получили чувствительность определения при помощи Углеродного конъюгата 1/20.480, с использованием ферментного конъюгата 1/1.280 (в стандартной процедуре проявления 4-хлорнафтолом) и практически неразличимые результаты определения конъюгатом Белок А Золото.

Пример 3. Дот-гибридизационный анализ ДНК фага лямбда.

Кратные 10 серийные разведения денатурированной ДНК фага лямбда апплицировали в объемах по 1 мкл на нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм. Иммобилизированную мишеневую ДНК припекали в течение 2-х ч при 80^oC в вакууме.

Гибридизацию проводили с использованием в качестве зонда химически биотинилированной ДНК фага лямбда.

Отмытые мембраны обрабатывали блокирующим буфером с 0,5 коллоидного казеина и 1 желатина в течение часа и осуществляли определение инкубацией с рабочими разведениями конъюгатов Стрептавидина с Углеродом (черный), с Суданом-III (темно-красный), с Тетразолиевым синим диформазаном (синий), с Неотетразолиевым диформазаном (темно-фиолетовый) в течении 30 мин при комнатной температуре и мягком покачивании, с последующей 3х-кратной отмывкой ФБР-Тв перед финальным учетом результатов. Параллельно детекцию осуществляли стандартным конъюгатом Стрептавидин-Пероксидаза Хрена с визуализацией гибридизованных образцов в колориметрической реакции с о-дианизидином.

В результате описанных экспериментов в ряде воспроизводимых серий чувствительность анализа с применением обеих систем определения с использованием как суспензоидных (4-х различных цветов), так и ферментного конъюгатов составила от 1-до 0,1 пиктограммов мишеневой ДНК на точку.

Пример 4. Двухсайтное иммунохроматографическое определение хорионического гонадотропина человека с использованием суспензоидного конъюгата Углерод-Моноклональные Антитела.

Приготовление связывающих ХГЧ пористых полосок.

На прозрачную (ПВХ) толстую (0,5 мм) жесткую клейкую ленту приклеивали полоску из 5-мкм нитроцеллюлозного фильтра с размерами 216 мм. Один из узких концов плотно, с помощью той же клейкой подложки, соединяли с впитывающим элементом (11 см квадрат толстой высокопористой хроматографической бумаги), считая в последующем данный конец верхним. На середину нитроцеллюлозной полоски тонкой линией с помощью Гамильтоновского шприца наносили моноклональные анти-ХГЧ антитела (АВ 0420), 1 мг/мл в ФБР. После подсыхания полоски 30 мин после нанесения связывающих антител полоску блокировали замачиванием в 1 казеине в ФБР-Тв на 1 ч при комнатной температуре, после чего отмывали ФБР-Тв и вновь высушивали.

Определение стандарта ХГЧ.

Стандарт ХГЧ разводили кратно 2 в ФБР-Тв и моче здорового донора, добавленной твином-20 до 0,1 К 50 мкл стандартных разведений ХГЧ, выполненных в лунках микротитровального планшета, добавляли по 50 мкл суспензоидного конъюгата анти-ХГЧ анитела (АВ 0421) Углерод в рабочем разведении в ФБР-Тв. Сразу же после этого в лунки опускали нижние концы хроматографических полосок с иммобилизированными на них моноклональными анти-ХГЧ антителами. Через 2-3 мин результата анализа определяли визуально по наличию (положительный результат: черные полосы на белом фоне) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител. Чувствительность анализа в нескольких сериях испытаний сконструированной системы составила 50 МЕ/л. Данная чувствительность удовлетворяет уровню диагностической потребности иммунохимического определения ранней беременности сроком в 1 неделю.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в существенном увеличении чувствительности и надежности стереоспецифического анализа с прямой визуализацией аналитов. Повышенная чувствительность анализа определяется исключительно высокой оптической плотностью предлагаемых меток по сравнению с оптической плотностью используемых в прототипе частиц коллоидного золота. Надежность анализа детерминируется предлагаемым универсальным способом двухэтапного синтеза реагентов для детекции, который позволяет получать очень стабильные ковалентные конъюгаты анти-аналитов с цветными суспензоидными метками. Способ может быть использован для получения конъюгатов анти-аналитов не только с предлагаемыми новыми, но и с ранее известными метками в том числе, например, с теми же коллоидами золота.

От известных и широко распространенных аналогов, таких как ИФА, предлагаемый способ анализа выгодно отличается простотой, оперативностью и безопасностью, что определяется отсутствием дополнительной стадии субстратного проявления, предполагающей работу с вредными для здоровья хромогенами. Кроме того, цветные преципитаты ферментных реакций выцветают при длительном хранении, в то время как предлагаемый способ дает возможность неограниченно длительно сохранять результаты анализа.

Технология получения конъюгатов цветных суспензоидных меток независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Универсальность и надежная воспроизводимость предлагаемого способа доказана в 26 сериях повторных синтезов конъюгатов с различными анти-аналитами.

Способ стереоспецифического анализа вследствие высокой чувствительности, надежности, простоты и оперативности может служить основой создания эффективных безинструментальных систем для упрощенного диагностического тестирования и эффективно использоваться в разнообразных "один пациент один тест" наборах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, включая срочные клинические и эпидемиологические ситуации, а также в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального использования.

Применение заявляемых цветных меток с целью увеличения чувствительности стереоспецифических анализов представляет универсальный и одновременно независимый технологический и методический подход, которым могут быть эффективно дополнены известные системы иммуноанализа.