способ селекции пшеницы, устойчивой к гербицидам

Формула изобретения

1. Способ селекции пшеницы, устойчивой к гербицидам, включающий изменение генотипа и выделение устойчивых форм на провокационном фоне, отличающийся тем, что изменение генотипа осуществляют путем обработки семян химическим мутагеном, принадлежащим к группе, состоящей из азида натрия, N-метил-N-нитрозомочевины, N-этил-N-нитрозомочевины, этилметансульфата, гидроксиламина и гидразина, выделение устойчивых форм на провокационном фоне проводят в две стадии, при этом на первой стадии семена выдерживают в растворе гербицида, ингибирующего синтазу ацетогидроксикислоты, принадлежащего к конкретному классу гербицидов, а на второй стадии выдержанные в гербициде семена выращивают в почве, предварительно обработанной распылением гербицидом того же действия, принадлежащего к тому же или другому классу, до прорастания растений из почвы и как устойчивые к классу гербицидов, ингибирующих синтазу ацетогидроксикислоты, которые использованы на стадии обработки семян и/или довсходовой обработки, выделяют проросшие растения пшеницы, имеющие нормальный вид.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гербицид, используемый на стадии обработки семян, совпадает с гербицидом, используемым на стадии довсходовой обработки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гербицид, используемый на стадии обработки семян, отличается от гербицида, используемого на стадии довсходовой обработки.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гербицид принадлежит к группе, состоящей из имидазолинонов, сульфамоилмочевин, сульфонилкарбоксамидов, сульфонамидов и сульфонилмочевин.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что имидазолинон принадлежит к группе, состоящей из 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолил-2-ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой кислоты, 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил) никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин2-ил)-5-(метоксиметил)- никотиновой кислоты, 5-формил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил) никотиновой кислоты, 5-(диметилацеталь), 3-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-2-метилкротоновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)метилникотиновой кислоты и смеси метил-6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа селекции пшеницы, устойчивой к гербицидам, включающего изменение генотипа и выделение устойчивых форм на провокационном фоне.

Способ вышеуказанного типа известен, в частности, из авт.св. СССР N 1170991, кл. A 01 H 1/04, 1985 г.

Согласно известному способу у исходных форм растений определяют ответную реакцию на действие гербицидов по нарушению ростовых процессов и по их внешнему виду, а затем изменяют генотип растений путем скрещивания предварительно подобранных исходных форм различающихся по ответной реакции на действие гербицида.

Известный способ однако сложен и недостаточно эффективен для селекции растений с приобретенной способностью противостоять воздействию гербицидов, ингибирующих действие синтазы ацетогидроксикислоты (далее сокращенно АГКС).

Первая ферментативная стадия, общая для процессов биосинтеза у различных растений в отношении аминокислот с разветвленной цепью (валин, лейцин и изолейцин), катализируется ферментом АГКС ("синтаза ацетогидроксикислоты", известная также под названием "ацетолактат"; Е.С. 4.1.3.18). АГКС катализирует две параллельно протекающие реакции: конденсацию двух моль пирувата с получением ацетолактата и конденсацию одного моль пирувата и одного моль альфа-кетобутирата с получением ацетогидрокси-бутирата. Действие этого фермента ингибируется конечными продуктами реакции (валин, лейцин и изолейцин), причем данное явление выступает в качестве одного из известных механизмов регулирования данной реакции у высших растений.

АГКС является объектом действия нескольких классов структурно несвязанных между собой гербицидов. В число указанных гербицидов входят имидазолиноны, сульфамоилмочевины, сульфонилкарбоксамиды, сульфонамиды и сульфонилмочевины.

Известно, что интенсивное сельскохозяйственное производство требует использования гербицидов, которые селективно уничтожают сорняки, оставляя при этом полезные растения в нетронутом виде. Гербициды, ингибирующие АГКС, являются ключевым элементом системы борьбы с сорняками, поскольку они создают меньше экологических и экономических проблем, связанных с токсичностью гербицидов других классов. Однако гербициды, ингибирующие АГКС, оказывают аналогичное нежелательное действие и на полезные растения, подавляя их рост.

Таким образом, в настоящее время существует общественная потребность в получении сортов пшеницы, которые бы могли успешно противостоять воздействию гербицидов, ингибирующих действие АГКС, поскольку они менее токсичны для окружающей среды, чем гербициды других классов.

Задача изобретения состоит в том, чтобы создать эффективный способ селекции мутантных растений, приобретающих способность противостоять воздействию гербицидов, ингибирующих действие АГКС, и, в частности, такого гербицида, как имидазолин.

Задача решается тем, что изменение генотипа осуществляют путем обработки семян химическим мутагеном, принадлежащим к группе, состоящей из азида натрия, N-метил-N-нитрозо-мочевины, N-этил-N- нитрозомочевины, этилметансульфата, гидроксиламина и гидрозина, выделение устойчивых форм на провокационном фоне проводят в две стадии, при этом на первой стадии семена выдерживают в растворе гербицида, ингибирующего синтазу ацетогидроксикислоты, принадлежащего к конкретному классу гербицидов, а на второй стадии выдержанные в гербициде семена выращивают в почве, предварительно обработанной распылением гербицидом того же действия, принадлежащего к тому же или иному классу до прорастания растений из почвы и, как устойчивые к классу гербицидов, ингибирующих синтазу ацетогидрокислоты, которые использованы на стадии обработки семян и/или довсходовой обработки, выделяют проросшие растения пшеницы, имеющие нормальный вид.

Другие, предпочтительные признаки изобретения представлены в зависимых пунктах формулы изобретения и далее поясняются в подробном описании изобретения.

Примечание: химические названия, торговые марки а также номера соединений, использованные в иллюстрациях, имеются в описании изобретения.

На фиг. 1 показан эффект увеличения концентрации гербицида имидазолина торговой марки SCEPTER, в виде отношения числа растений нормального вида к числу семян, вымоченных в растворе, имидазолин.

На фиг. 2 показан эффект увеличения концентрации гербицида имидазолинона под фирменным обозначением PURSUIT, в виде отношения числа растений нормального вида к числу семян, вымоченных в растворе, содержащем имидазолинон.

На фиг. 3 показан эффект увеличения концентрации гербицида имидазолинона под фирменным обозначением ARSENAL, в виде отношения числа растений нормального вида к числу семян, вымоченных в растворе, содержащим имидазолинон.

На фиг. 4 и 5 показан внешний вид пшеницы, устойчивой к воздействию гербицидов, ингибирующих действие АГКС, прошедшей обработку в результате вымачивания семян и довсходовую обработку на почве раствором гербицида PURSUIT, в сравнении с пшеницей, не прошедшей обработку. Устойчивая пшеницы находится в крайнем слева поддоне на фиг. 4 и в среднем поддоне на фиг.5.

На фиг. 6 показан внешний вид пшеницы из семян М-3, которые являются потомством FS-4.

На фиг. 7 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и растений М-3 М-4 разновидности FS-1 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом ARSENAL.

На фиг. 8 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и растений М-3 М-4 разновидности FS-1 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом OUST.

На фиг. 9 показано сравнение высоты растений (в см.) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и растений М-3 М-4 разновидности FS-1 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT.

На фиг. 10 показано сравнение высоты растений (в см.) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и растений М-3 М-4 разновидности FS-1 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом SCEPTER.

На фиг. 11 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и растений М-3 М-4 разновидности FS-1 спустя 4 нед после послевсходовой обработки соединением 2.

На фиг. 12 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-3 спустя 4 нед после довсходовой обработки гербицидом SCEPTER.

На фиг. 13 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-3 спустя 4 нед после довсходовой обработки гербицидом ARSENAL.

На фиг. 14 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-3 спустя 4 нед после довсходовой обработки гербицидом PURSUIT.

На фиг. 15 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-3 спустя 4 нед после довсходовой обработки имидазолиновым гербицидом под обозначением соединение 2.

На фиг. 16 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-4 спустя 2 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT.

На фиг. 17 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT.

На фиг. 18 показано сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки соединением 2.

На фиг. 19 показано сравнение веса свежих растений (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки соединением 2.

На фиг.20 показано сравнение веса свежих растений (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы "Фидель" и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-4 спустя 7 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT.

На фиг. 21 показано сравнение веса свежих растений (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы М-4 разновидности FS-2 и FS-4 спустя 7 нед после послевсходовой обработки соединением 2.

На фиг. 22 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы из общих семян М-3 и М-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом CLASSIC.

На фиг. 23 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы FS-2 из общих семян М-3 и М-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки гербицидом OUST.

На фиг. 24 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы из общих семян М-3 и М-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки сульфамоилмочевинным гербицидом под обозначением соединение 3.

На фиг. 25 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы из общих семян М-3 и М-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки сульфамоилмочевинным гербицидом под обозначением BRACON.

На фиг. 26 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы из общих семян М-3 и М-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки сульфонилкарбоксимидным гербицидом под обозначением соединение 1.

На фиг. 27 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы из общих семян М-3 и М-4 спустя 4 нед после послевсходовой обработки имидазолиновым гербицидом под обозначением соединение 7.

На фиг. 28 и 29 показано сравнение высоты растений (в см) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов М-4 разновидностей FS-1, FS-2 и FS-4 спустя 3 и 6 нед соответственно после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT, соединением 2 или соединением 8.

Фиг. 30 иллюстрирует сравнение урожайности (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов М-4 разновидностей FS-1, FS-2 и FS-4 спустя 10 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT, соединением 2 или соединением 8.

Фиг. 31 иллюстрирует сравнение роста (в процентах к контрольным растениям) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов М5 разновидности FS-4 спустя 6 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT, соединением 2, соединением 8, имидазолиновым гербицидом CADRE или сульфамоилмочевинным гербицидом ACCENT.

Фиг. 32 иллюстрирует сравнение средней урожайности (в г зерна на участок) дикой разновидности пшеницы ("Фидель") и мутантов пшеницы разновидности FS-4 (семена М5) спустя 10 нед после послевсходовой обработки гербицидом PURSUIT, соединением 2, соединением 8, гербицидом CADRE, или гербицидом ACCENT.

Фиг. 33 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на мутантах пшеницы FS-1 (обозначенных WS-1), не прошедших послевсходовой обработки, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 34 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на мутантах пшеницы FS-1 (обозначенных WS-1), прошедших обработку гербицидом на стадии растений в трехнедельном возрасте, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 35 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на дикой разновидности пшеницы ("Фидель"), не прошедших послевсходовой обработки, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 36 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на дикой пшенице ("Фидель"), прошедшей обработку гербицидом на стадии растений в трехнедельном возрасте, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 37 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на мутантах пшеницы ("Фидель"), не прошедшей послевсходовой обработки, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 38 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на мутантах пшеницы ("Фидель"), прошедшей обработку гербицидом на стадии растений в трехнедельном возрасте, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 39 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на дикой пшенице ("Фидель"), не прошедшей послевсходовой обработки, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Фиг. 40 иллюстрирует изучение in vitro энзиматической активности в форме ингибирования активности АГКС на дикой пшенице ("Фидель"), прошедшей обработку гербицидом на стадии растений в трехнедельном возрасте, при использовании валина и лейцина (обозначены V+L) в качестве сравнения и гербицидов SCEPTER, PURSUIT, соединения 9 и OUST.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу селекции мутантов пшеницы, приобретающих способность противостоять воздействию гербицидов, ингибирующих действие АГКС. Мутагенез семян пшеницы осуществляют с использованием химических мутагенов и известных способов. На первой стадии селекции семена вымачивают в растворе, содержащем гербицид, ингибирующий действие АГКС, с использованием опубликованной в литературе методики для сои и пшеницы.

На новой второй стадии селекции семена высаживаются в почву и обрабатываются раствором, содержащим гербицид того же класса что и использованный на стадии вымачивания семян, до появления всходов. Взошедшие семена, имеющие нормальный вид, считаются устойчивыми к данному классу гербицидов, ингибирующих действие АГКС, использованному на указанных двух стадиях селекции. Эти растения обладают следовательно преимуществом, связанным с тем, что их можно выращивать в зоне применения данного класса ингибирующих АГКС гербицидов для уничтожения сорняков, при том, что растения пшеницы останутся целыми. Сохранение наследственности в отношении устойчивости к воздействию ингибирующих АГКС гербицидов иллюстрируется испытаниями нескольких последовательных поколений семян исходных мутантов на предмет наличия у них указанной устойчивости к воздействию гербицидов, ингибирующих действие АГКС. Получающиеся при этом растения могут (хотя это и не обязательно ) быть взаимно толерантными к прочим классам гербицидов, ингибирующих действие АГКС, отличными от гербицидов, использованных на указанных двух стадиях селекции.

Мутагенез семян осуществляют с использованием известных способов и химического мутагена. Методика соответствует описанной в статье Кью и Брайта (Kueh J.S.H. Bright S.W.J. Planta 153, 166-171 (1981), в соответствии с которой семена вымачивают в воде с пробулькиванием через них воздуха, с последующей обработкой мутагеном, например азидом натрия. Затем семена промывают водой и сушат. Применение азида натрия в соответствии с данной методикой является предпочтительными.

Другие химические мутагены и методики их применения, включая использование N-метил-N-нитрозомочевины и N-этил-N-нитрозомочевины, описаны в работе Р. Флюра и А.Чепло, Methods Euzymol. (Plant Mol.Biol.) 118, 611-623 (1986), этилметансульфоната работе С.А. Севастьена с сотр. Crop Sci. 29, 1403 1408 (1989)), и гидроксиламина и гидразина в работе И.Г.Хаманкара, Naharashtra Agric. Univ. 14, 322-325 (1989)).

Подвергшиеся мутагенезу семена затем отбирают на предмет устойчивости к гербицидам, ингибирующим действие АГКС. Вначале проводят исследования in vitro для определения толерантности к гербициду эмбрионов пшеницы, половинок семян и целых семян. Однако подобный отбор занимает очень много времени и является проблематичным вследствие проблем, связанных с загрязнением и различным отзывом пшеницы. Поэтому используют другой способ селекции. Данная процедура разработана на основе методики, разработанной С.А.Севастьеном и Р. С. Шалефом, Crop Science. 27, 948 952 (1987) для селекции толерантной к гербицидам сои. Эта методика включает вымачивание целых созревших семян пшеницы в растворе, содержащем гербициды, ингибирующие действие АГКС, который содержит конкретный класс гербицидов, ингибирующих действие АГКС, в течение определенного промежутка времени, по истечении которого семена высеивают в стерильную почвенную смесь.

В число различных классов гербицидов, ингибирующих действие АГКС входят имидазолины, сульфамоилмочевины, сульфонилкарбоксамиды, сульфонамиды и сульфонилмочевины.

В число примеров имидазолиновых гербицидов, которые можно использовать на стадии вымачивания семя, входят 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) никотиновая кислота, 2 (4 изопропил) 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) 3 хинолинкарбоновая кислота, 5 этил 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) никотиновая кислота, 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) 5 (метоксиметил) никотиновая кислота, 5 формил 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 -имидазолин 2 -ил) никотиновая кислота, 5 - (диметилацеталь), 3 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин - 2 -ил) 2- метил кротоновая кислота, 2 (4 изопропил 4 метил 5 - оксо 2 имидазолин 2 -ил) метилникотиновая кислота, и смесь метил 6 - (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) м толуата и метил 2 (4 изопроил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) п толуата. Предпочтительным является использование 5 этил 2 (4

изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) никотиновой кислоты и 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) никотиновой кислоты. Особо предпочтительным является использование 5 этил - 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолил 2 ил) никотиновой кислоты.

В число примеров сульфамоилмочевинных гербицидов, которые можно использовать на стадии вымачивания семя, входят 1 (4 метокси 6 метил - 9 триазин 2 ил) 3 [(о пропионилфенил ) сульфамоил] мочевина; 1 - (4,6 диметокси 2 пиримидинил 3 [(о пропионилфенил) сульфамоил] мочевина; 1- [(о ацетилфенил) сульфамоил] 3 (4 метокси 6 метил - 2 пиримидинил) мочевина, и 1- [(о ацетилфенил) сульфамоил] 3 (4 - метокси 6 метил S триазин 2 ил) мочевина. В число примеров сульфнилкарбоксамидных гербицидов входят 2 ацетамидо 2,3 диметил N (п толилсульфонил) бутирамид и 2 ацетамидо N (п хлорфенил) сульфонил) 2,3 диметилбутирамид. Примером сульфонамида является N [2,6 - дифторфенил] 5 метил (1, 2, 3) триазоло 1,5 а пиримидин 2 сульфонамид. В число примеров сульфонилмочевин входят 2 [4,6 бис - (дифторметокси) пиримидин] 2 илкарабамоилсульфамоил бензойная кислота, 1 - (4,6 диметоксипиримидин 2 ил ) 3 (диметоксикарбамоил 2 - пиридинсульфонил) мочевина, метиловый эфир о [[3 ( 4,6 диметилпиримидин - 2 ил ) уреидо сульфонил бензойной кислоты и этиловый эфир о [[4 хлор 6 метокси 2 пиримидинил ) карбамоил сульфамоил бензойной кислоты.

Если вымачивание семян является единственным используемым способом отбора, то его следует осуществлять следующим образом. После сушки семена высеивают и спустя определенный промежуток времени, равный например 3 или 4 нед после посева, подсчитывают число взошедших растений; при этом отмечаются также их размер и внешний вид. Проросшие семена, давшие побеги нормального размера и обычного вида могут обладать устойчивостью к имидазолиновым гербицидам, ингибирующим действие АГКС.

Однако отбор способом вымачивания семян может проводить к появлению "случайных ошибок" или ложных положительных результатов на выживание под воздействием гербицида. Для того, чтобы избежать ложных положительных результатов на выживание под действием гербицида, в качестве второй стадии отбора используют довсходовую обработку гербицидом.

После завершения стадии вымачивания семян пшеницы их высеивают в почву. При желании можно применять орошение почвы. Затем на почву, содержащую семена, до прорастания побегов распыляют раствор гербицидов, ингибирующих действие АГКС, содержащий воду или другой подходящий водяной или органический растворитель. Концентрацию распыляемого гербицида уточняют для каждого конкретного имидазолинона посредством мелкомасштабных испытаний.

Гербициды, ингибирующие действие АГКС, используемые на стадии обработки семян гербицидом в почве, выбирают из того же класса, что и гербициды, используемые на стадии вымачивания семян. Конкретный гербицид может совпадать или отличаться для обоих стадий отбора, однако в каждом из случае указанные гербициды следует выбирать из одного и того же класса гербицидов, ингибирующих действие АГКС. Классы гербицидов и примеры для каждого из классов, которые могут использоваться на второй стадии отбора, совпадают с описанными ранее для первой стадии вымачивания семян.

Оценку семян, прошедших две стадии отбора, осуществляют после проявления всходов из почвы. Растения, имеющие нормальный размер, вид и урожайность, свидетельствуют о том, что получены мутанты пшеницы, обладающие желаемой устойчивостью к гербицидам, ингибирующим действие АГКС.

Пшеницу с высокой устойчивостью к гербицидам, ингибирующим действие АГКС, отбирают в соответствии с двухстадийным способом селекции. Подобная система селекции позволяет осуществлять предпочтительную селекцию растений пшеницы с высоким уровнем устойчивости, поскольку семена подвергаются воздействию доз гербицида, смертельных для дикорастущих сортов, на двух стадиях отбора при обработке семян вымачиванием и довсходовой обработке их в почве. Подобное двойное воздействие гербицида устраняет возможность появления ложных положительных результатов и может служить цели устранения мутантов со слабой устойчивостью. Получаемые устойчивые растения пшеницы обладают устойчивостью к воздействию гербицидов именно того класса, который использован на двух стадиях селекции. Растения в определенных случаях могут проявлять устойчивость и к другим классам гербицидов, ингибирующих действие АГКС, однако подобная взаимная устойчивость вовсе не является обязательной.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение в отношении гербицидов, ингибирующих действие АГКС, класса имидазолимона. Другие классы гербицидов, ингибирующих действие АГКС также находятся в пределах заявленной формулы изобретения, поскольку механизм их действия совпадает с механизмом действия АГКС, имеют один и тот же механизм воздействия: их "целью" является фермент АГКС, в результате чего происходит блокада биосинтеза валина, лейцина и изолейцина. В результате блокировки активности АГКС гербициды ингибируют метаболизм растений, что приводит к их гибели.

В случае, когда двухстадийный способ селекции согласно настоящему изобретению используют по отношению к гербицидам класса имидазолинона, в результате получают пшеницу, устойчивую по отношению к классу имидазолиноновых гербицидов. Устойчивая к гербицидам пшеница имеет повышенную устойчивость к имидазолинону, в 50 раз превышающую устойчивость немутагенной пшеницы, не прошедшей селекции. Как было показано, имидазолиноны ингибируют фермент АГКС, один из первых ферментов в разветвленной цепи процесса биосинтеза аминокислот. Результат отбора пшеницы проверялся на предмет активности фермента in vitro (опыты описаны в приведенных ниже примерах), при этом обнаружено, что отсутствует ингибирующее воздействие имидазолиноном на активность АГКС. Однако при этом взаимная устойчивость по отношению к другим классам химических препаратов с аналогичным типом взаимодействия на АГКС, проведенная как для целых растений, так и для активности фермента, либо весьма незначительна, либо вообще отсутствует.

Из 117000 семян пшеницы, использованных для селекции, отобраны 4 растения пшеницы, обладающие свойствами устойчивости к гербицидам. Эти 4 мутанта получили обозначения FS-1, FS-2, FS-3, FS-4. Образцы семян указанных мутантов пшеницы были депонированы 28 марта 1991 г. в Американской коллекции типов культур по адресу 20852, Мэриленд, Роквилл, Парклаун Драйе 12301, где им были присвоены следующие номера:

Мутант пшеницы Номер

FS-1 АТСС 40994

FS-2 АТСС 40995

FS-1 АТСС 40996

FS-2 АТСС 40997

Основываясь на генетических данных можно утверждать, что выбранные мутанты пшеницы FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4 являются аллельными и очевидно выступают в качестве продуктов единой мутации. Устойчивость к гербицидам неследуется в виде единого генетического локуса и является доминантной или полудоминантной при экспрессии. Повышение устойчивости к гербицидам не оказывает отрицательного воздействия на урожайность ни в присутствии, ни в отсутствии испытуемых имидазолиновых гербицидов.

Наследование мутационных свойств при отборе устойчивых к гербицидам мутантов подтверждается исследованием на нескольких последовательных поколениях семян, а также посредством взаимного скрещивания отобранных мутантов. Испытуемые семена подвергают как довсходовой, так и послевсходовой обработке различными классами гербицидов, ингибирующих действие АГКС. При этом наблюдают размер, урожайность и внешний вид растений по сравнению с необработанными контрольными образцами ("Фидель") и контрольными образцами ("Фидель"), прошедшими ту же двухстадийную обработку и отбор.

Результаты описанных испытаний, приведенных в примерах, свидетельствуют о том, что мутанты сохраняют устойчивость к имидазолинонам, свойственным разновидностям FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4 от одного покаления к другому. Специфичность устойчивости иллюстрируется данными, которые свидетельствуют о том, что отобранные мутанты не обладают устойчивостью по отношению к другим классам гербицидов, ингибирующих действие АГКС, таким как сульфонилмочевины, сульфамсилимиочевины, сульфонамиды и сульфонилкарбоксамиды.

Согласно второму варианту изобретения, для двух стадий селекции берут два различных класса гербицидов, ингибирующих действие АГКС. На стадии вымачивания семян используют один класс гербицидов, а на стадии обработки семян в почве другой. В результате растения, которые выживают и нормально растут, становятся устойчивыми к обоим классам гербицидов. Хотя частота мутаций, сохраняющих устойчивость к гербицидам, значительно уменьшается вследствие использования различных классов гербицидов, все же число отобранных семян является достаточным, и возможно получение разновидностей с двойной устойчивостью.

Для лучшего понимания настоящего изобретения приведены следующие ниже примеры. Они служат только для иллюстрации и не могут рассматриваться в качестве ограничивающих формулу изобретения.

Пример 1. Осуществление двухстадийного отбора семян

1. Мутагенез семян. 5000 семян вида "Фидель" (французская озимая пшеница) подвергают мутагенезу согласно способу, описанному в статье Кьюэ и Брайта (Kueh J. S. H, Bright S.W.J. Planta 153, 166-171 (1981). Семена пшеницы вымачивают в воде в течение 18 ч при 5^oC и затем пропускают через них воздух в течение 6 ч при 20^oC. Затем немедленно их обрабатывают 1 мМ раствором азида натрия, являющегося химическим мутагеном, при pH 3 в течение 2 ч. После этого семена промывают водой в течение 30 мин и распределяют тонким слоем на бумажных полотенцах для сушки. После сушки семена высеивают в поле.

Растениям пшеницы дают вырасти до созревания и получают семена М-2. Вырастают примерно 117000 семян пшеницы, которые используют для отбора пшеницы, устойчивой к имидазолинонам. Всхожесть данного семенного материала составляет 100

Стадия 1 вымачивание семян.

В соответствии с методикой, предложенной Севастьеном и Шалеффом, семена пшеницы дезинфицируют с поверхности в 70-ном растворе этанола в течение 30 с с последующей дезинфекцей в 50-ном растворе, содержащем 2,625 гипохлорита натрия, 1-2 капли ТВИН-20 (неионной поверхностно-активный агент - полиэтиленсорбитанмонолаурат, фирменный продукт "Атлас Кемикал Индастриз") на 100 мл раствора, в течение 30 мин в вакууме при осторожном перемешивании посредством плоской магнитной мешалки. Семена промывают стерильной дистиллированной водой и вымачивают в растворе гербицида определенной концентрации в течении заданного промежутка времени, в соответствии с приведенной ниже методикой. Партии по 25 семян помещают в 25 мл описанного ниже раствора гербицида в стерильных пластмассовых чашках Петри 100 х 15 мм и вымачивают соответствующее время. Затем семена промывают водой, сушат на бумажных полотенцах и высеивают в количестве 25 семян/поддон на глубине примерно 0,5 дюйма (12,7 мм) в поддоны с торфом размером 6 х 8 дюймов (15,2 х 20,3 см), содержащие увлажненный, стерильный искусственный грунт под обозначением "Метро- Микс-350" ("Грейс Компани, Кембридж, Массачуссетс). Результаты обработки определяют спустя 4 недели после ее проведения. Тип гербицид, его количество и продолжительность обработки приведены ниже:

Опыт 1:

"ARSENAL": 0, 1, 10, 50, 100, 500 мкМ

"SCEPTER": 0, 1, 10, 50, 100, 500 мкМ

продолжительность 48 ч. Каждый из вариантов обработки повторяют 4 раза. ("ARSENAL" и "SCEPTER" являются фирменными обозначениями продуктов "Америкен Цианэмайд Компани". "ARSENAL" представляет собой 2 (4 изопропил 4 - метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) никотиновую кислоту, описанную в патенте США N 4798619, а "SCEPTER" представляет собой 2 (4 изопропил 4 - метил 5 оксо 2 имидазолин 2 -ил) 3 -хинолинкарбоновую кислоту, описанную в патенте США N 4798619.

ARSENAL ингибирует процессы прорастания семян и роста растений при увеличении концентрации. Хотя при концентрациях до 50 мкМ визуально наблюдается появление некоторого количества потенциально ложных положительных результатов, при более высоких концентрациях происходит полное ингибирование роста растений. При указанных концентрациях, 100 и 500 мкМ некоторым побегам удается прорасти, но они имеют маленькие стебли, скрученные и обычно ненормальные по внешнему виду.

Хотя SCEPTER также ингибирует рост растений при увеличении концентрации, визуальное наблюдение показывает, что побеги восстанавливаются на протяжении 3 4 нед. На деле побеги, обработанные этим гербицидом в концентрации 1 100 мкМ, не отличаются от контрольных образцов, побеги, обработанные им в концентрации 500 мкМ, несколько короче остальных.

Опыт 2:

"ARSENAL": 0, 10, 50, 100, 500 мкМ

"SCEPTER": 0, 10, 50, 100, 500, 750, 1000 мкМ

продолжительность 48 ч. Каждый из вариантов обработки повторяют два раза.

ARSENAL вновь испытывают в тех же концентрациях, что и в предшествующем опыте, получая те же результаты. В данном опыте коцентрацию SCEPTER увеличивают до максимума в 1000 мкМ. К концу опыта из результатов визуального наблюдения становится ясно, что эта концентрация недостаточна для предотвращения "ложных" положительных результатов. Продолжительность обработки гербицидом также оказывает воздействие на число ложных положительных результатов. В опыте 1 семена вымачивают на несколько часов дольше при этом наблюдается некоторое удлинение корешков, однако семена в этом опыте не дают прорастания корешков после завершения обработки. Эффект влияния продолжительности вымачивания семян на концентрацию гербицида, необходимую для предотвращения ложных результатов, исследовался в следующем опыте.

Опыт 3:

"ARSENAL": 0, 10, 50, 100, 500 мкМ

"SCEPTER": 0, 250, 500, 750, 1000, 1500 мкМ

"PURSUIT": 0, 250, 500, 750, 1000, 1500 мкМ

Соединение 1: 0, 500, 1000, 1500, 2000 мкМ

продолжительность 48, 72 или 96 ч. Каждый из вариантов обработки повторяют 2 раза. "PURSUIT" является фирменным обозначениям продукта "Американ Цианэмайд Компани"; он представляет собой 2 (4 изопропил 4 метил 5 - оксо 2 имидазолин 2 -ил) никотиновую кислоту, описанную в патенте США N 4798619. Соединение 1 представляет собой 2 ацетамидо N (п - хлорфенил)сульфонил) 2,3 диметилбутирамид, описанный в патенте США N 4992094).

В соответствии с данным опытом имидазолиноновые гербициды ARSENAL, SCEPTER, PURSUIT и сульфонилкарбосиамидное соединение 1 выбраны в качестве селекционных агентов для отбора вымоченных семян. При этом одновременно определяли связь продолжительности вымачивания семян и концентрации гербицида. На фиг. 1 3 приведены результаты обработки имидазолиноновым гербицидом. В случае, когда семена вымачивают в течение 48 ч, число "нормальных" растений уменьшается при увеличении концентрации гербицида. Однако даже при самых высоких концентрациях гербицида имеются нормальные растения. По мере увеличения продолжительности выдерживания в гербициде концентрация гербицида, необходимая для полной летальности, уменьшается. Концентрации 50 мкМ в случае ARSENAL достаточно, если продолжительность обработки превышает 72 ч, однако при меньшей продолжительности требуется концентрация 75 мкМ.

SCEPTER неэффективен при любой комбинации концентрации гербицида и продолжительности обработки. Напротив, обработка семян либо 1000 мкМ PURSUIT в течение 72 ч, либо 750 мкМ PURSUIT в течение 96 ч предотвращает сохранение потенциально ложных положительных результатов. Соединение 1 не обладает ингибирующим воздействием ни на прорастание семян, ни на рост растений.

ОПЫТ 4

"SCEPTER": 0, 500, 1000, 1500, 2000 мкМ

в течение 3, 4, 7 и 10 сут. Каждый процесс разработки повторяют 2 раза.

Методика соответствует описанной выше за тем исключением, что 35 семян вымачивают в чашках Петри; в поддонах по-прежнему выращивают по 25 семян. Эксперимент повторяют дважды. (Примечание: на 7 и 10 сут в первом случае растения были поражены грибком и исключены из эксперимента. Во втором эксперименте в раствор для вымачивания добавлен фунгицид "Кэптан" для того, чтобы избежать поражения грибком).

Продолжительность вымачивания, равная 7 или 10 сут, является слишком длительной для обработки семян пшеницы. За этот промежуток времени начинается прорастание в случае вымачивания в SCEPTER при концентрации до 1000 мкМ; при этом также начинает проявляться поражение грибком, составляющее проблему при проведении опыта.

Визуальные оценки аналогичны случаю обработки PURSUIT в опыте 3. Обработка SCEPTER в концентрации 1000 и 1500 мкМ в течение 3 сут достаточно для селекции устойчивых к имидазолинону мутантов при сведении к минимуму проблемы ложных положительных результатов.

3. Стадия 2: Довсходовая обработка гербицидами

Для определения необходимой концентрации гербицида проводят серию опытов по довсходовой обработке гербицидом путем его распыления в виде аэрозоля. Семена пшеницы разновидности "Фидель" выращивают в торфяных поддонах размером 6 х 8 дюймов (15,2 х 20,3 см ), с искусственным грунтом под обозначением "Метро-Микс-350" в количестве 100 семян/поддон. Перед обработкой гербицидом поддоны поливают. При каждой обработке гербицид распыляют на трех поддонах. Гербициды наносят посредством лабораторного распылителя в количестве 950 л/га при скорости 12,8 с/об с использованием насадки для распыления типа 40015-E (система для распыления под фирменным обозначением "Тиджет"). Спустя 3 4 нед результаты обработки оценивают визуально на предмет токсического воздействия на семена или ростки пшеницы. Выяснено, что PURSUIT и SCEPTER являются наиболее эффективными при довсходовой обработке при концентрации 300 350 г/га, а ARSENAL 40 50 г/га.

4. Отбор и селекция мутантов, устойчивых и гербицидам

Для отбора устойчивых к гербицидам мутантов в качестве примера имидазолинона используют PURSUIT. Семена пшеницы М-2 дезинфицируют с поверхности посредством погружения на 30 с в 70-ный этанол с последующим погружением в 50-ный раствор, содержащий 2,625 гипохлорита натрия, в соответствии с описанным ранее способом. Затем семена трижды промывают стерильной дистиллированной водой и помещают в стерильные пластмассовые чашках Петри 100 х 15 мм в количестве 250 семян на чашку. В каждую чашку добавляют 25 мл 1000 мкМ раствора PURSUIT и вымачивают семена в указанном растворе в темноте в течение 3 сут. Затем с них сливают раствор, сушат на бумажных полотенцах и высеивают в количестве 1000 семян/поддон, в стерильные торфяные поддоны размером 6 х 8 дюймов (15,2 х 20,3 см ), содержащие искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350". Поддоны поливают и немедленно обрабатывают гербицидом PURSUIT в количестве 300 г/га. Гербицид наносят посредством лабораторного распылителя в количестве 950 л/га при скорости 12,8 с/об с использованием насадки для распыления типа40015-E. Спустя 4 нед проводят оценку устойчивости растений по отношению к гербицидам. Семена пшеницы М-2 отбирают из партий по 25000 семян одновременно. Из примерно 117000 семян пшеницы М-2, прошедших двухстадийную селекцию на предмет устойчивости к гербицидам, отбирают 4 растения пшеницы, обладающие устойчивостью к PURSUIT.

Эти растения имеют совершенно другой внешний вид по сравнению с неустойчивыми растениями. Два из указанных мутантов изображены на фиг. 4 и 5. Устойчивая разновидность пшеницы находится в крайнем слева поддоне на фиг. 4 и в среднем поддоне на фиг. 5. Указанные 4 мутанта получают обозначения FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4. Устойчивые растения переносят торфяные поддоны размером 7,5 дюймов (19 см), содержащие искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350".

ПРИМЕРЫ 2 5.

Характеристики мутантов, устойчивых к гербицидам

ПРИМЕР 2

Наследование свойства устойчивости к гербицидам

1. Отбор растений М-3 in vivo

Растения М-3, полученные из четырех исходных мутантов (обозначенных FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4) подвергают отбору на предмет устойчивости к гербициду PURSUIT. По 5 зерен М-3, полученных на стадии созревания указанных исходных мутантов М-2, дезинфицируют посредством погружения на 30 с в 70-ный этанол с последующим погружением на 20 мин в 50-ный раствор, содержащий 2,625 гипохлорита натрия, в соответствии с описанным ранее способом, в вакууме, при осторожном перемешивании посредством магнитной мешалки. Семена дважды промывают стерильной дистиллированной водой.

Партии по 5 семян помещают 10 мл 1500 мкМ раствора PURSUIT в стерильные пластмассовые чашках Петри 60 х 15 мм и вымачивают семена в указанном растворе в течение 3 сут. Затем их промывают, сушат на бумажных полотенцах и высеивают на глубине примерно 0,5 дюйма (12,7 мм) в стерильные торфяные поддоны размером 6 х 8 дюймов (15,2 х 20,3 см), содержащие увлажненный стерильный искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350". Поддоны поливают и обрабатывают до появления всходов гербицидом PURSUIT в количестве 300 г/га. В число контрольных образцов включают семена М-3 из каждой из устойчивых разновидностей, дезинфицированные в соответствии с описанным выше способом, вымоченные в стерильной дистиллированной воде в течение 3 сут, и высаженные в почву. Кроме того, в число контрольных образцов включают семена не подвергшейся селекции пшеницы "Фидель", дезинфицированные в соответствии с описанным выше способом, половину которых обрабатывают PURSUIT (осуществляя стадии вымачивания семян и довсходовой обработки), а вторую половину вымачивают только в стерильной дистиллированной воде. Гербицид наносят посредством лабораторного распылителя в количестве 950 л/га при скорости 12,5 с/об с использованием насадки для распыления типа40015-E.

Спустя 4 нед после исходного вымачивания семян растения пшеницы М-3 оценивают на предмет того, обладают ли они устойчивостью к гербицидам, поражаются ими или гибнут. Устойчивые к гербицидам растения индивидуально переносят в горшки "Азалия" размером 7,5 дюймов (19 см), содержащие искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350". Спустя неделю после пересадки растений на поверхность почвы наносят слой удобрения "ОСМОКОТ" (продукт фирмы "Сьерра" Милпит, Калифорния). Кроме того, указанные растения регулярно удобряют удобрением "Питер 20-20-20" (продукт фирмы "Грейс", Кембридж, Массачуссеттс). Оценка состояния индивидуальных растений производится в сравнении с необработанными контрольными образцами пшеницы "Фидель".

Немутагенные и не прошедшие селекцию семена разновидности "Фидель" не переносят обработку гербицидом PURSUIT в количестве 1500 мкМ (вымачивание семян) и 300 г/га (довсходовая обработка). Этот же семенной материал при вымачивании в стерильной дистиллированной воде и без довсходовой обработки распылением, дает всходы спустя 1-2 нед при средней всхожести 63,3 (среднее значение для двух контрольных партий). Семенной материал М-3, при вымачивании в стерильной дистиллированной воде и без довсходовой обработки распылением, дает всхожесть 53,3 Семена устойчивой разновидности, обработанные гербицидом PURSUIT, обеспечивают следующую всхожесть, FS-1 60, FS-2 - 47,5, FS-3 41,2, FS-4 55.

Большинство растений поколения М-3 после обработки гербицидом имеют такую же скорость роста, как и необработанные контрольные образцы, однако некоторые из растений потомства FS-4 подвергаются воздействию гербицида; у них проявляются такие симптомы, как чахлость, скручивание стебля и/или хлоротическое отслоение (см. фиг. 6). Большинство из них тем не менее уцелевают и продолжают расти. Высота растений спустя 3 недели после обработки гербицидом представлена в табл.1.

Высота растений-мутантов находится в диапазоне от 1 до 28 см. Это иллюстрирует факт разнохарактерности степени устойчивости к гербициду. Высота контрольных растений находится в диапазоне от 8 до 31 см. Все растения переносят в торфяные горшки размером 7,5 дюймов (19 см), содержащие искусственный грунт под обозначением "Метро- Микс-350", и используют для получения гибридов, описанных в части 4 данного примера 2 (генетические исследования).

2. Отбор растений М-3 in vitro

Растения М-3, полученные из четырех исходных мутантов (обозначенных FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4), подвергают отбору на предмет устойчивости к гербициду PURSUIT in vitro Зерна М-3 полученные на стадии созревания указанных исходных мутантов М-2, дезинфицируют посредством погружения на 30 с в 70-ный этанол с последующим погружением на 20 мин в 50-ный раствор, содержащий 2,625 гипохлорита натрия, в соответствии с описанным ранее способом, в вакууме, при осторожном перемешивании посредством магнитной мешалки. Семена вымачивают в стерильных пластмассовых чашках Петри 100 х 15 мм в течение 20 24 ч, после чего зародыши разрезают и культивируют в среде, содержащей PURSUIT в концентрации 10-4, 10-5 или 10-6 М. В число контрольных образцов включают немутагенные зародыши (пшеница "Фидель"), культивируемые на среде с или без гербицида и семена М-3 в среде без гербицида. Состояние эмбрионов оценивают спустя 2,5 или 3 нед после начала культивации.

Ни один из зародышей (контрольные образцы пшеницы "Фидель" или М-3), прошедший культивирование в среде, содержащей 10^-4 М гербицида PURSUIT, не пророс, хотя некоторые из зародышей М-3 демонстрируют небольшой процент первичного появления корешков (1-5 мм). Зародыши М-3 обладают некоторой устойчивостью к PURSUIT при концентрации 10^-5 М, однако при этом все еще имеет место значительное замедление роста. В табл. 2 представлены данные по устойчивости зародышей "у" означает устойчивые, "П" получившие повреждения в результате действия гербицида, и "В" подверженные воздействию гербицида (неустойчивые).

Концентрация PURSUIT 10^-5 М, данные представлены в табл 2.

Концентрация PURSUIT 10^-6 М, данные представлены в табл.3.

Контрольный опыт 1 неустойчивая пшеница "Фидель", среда без гербицида Контрольный опыт 2 неустойчивая пшеница "Фидель", среда с гербицидом. Контрольные образцы М-3 семена М-3 из исходных коллекционных разновидностей; среда с гербицидом.

Основываясь на приведенных данных, полученных in vitro, можно утверждать, что мутанты обладают от 10 до 100 кратной устойчивостью по отношению к гербициду PURSUIT.

3. Изучение (селекционной) сегрегации

Исследования осуществляют с целью определения устойчивости к имидазолинону и однородности поколения М-4 исходных мутантов пшеницы. Для исследований используют семена М-4, полученные из растений М-3 (которые в свою очередь получают из исходных продуктов селекции FS-1 FS-4), прошедших описанный выше двухстадийный отбор. Кроме того, в качестве контрольных образцов наряду с пшеницей "Фидель", используют семена М-4, полученные из растений М-3 каждой из селекций, не проходивших отбор. Семена, как полученные из общего запаса, так и полученные из растений М-3, прошедших отбор, соответствующих каждому урожаю каждой из исходных мутантных разновидностей FS-1 FS-4, выращивают в поддонах, в количестве 25 семян в ряду, 8 рядов в поддоне. Спустя неделю после высеивания, когда растения находятся Z-12 (появление двух листков), растения обрабатывают распылением гербицида PURSUIT в количестве 62,5 г/га. Гербицид наносят с высоты примерно 18 дюймов (46 см) над растениями посредством лабораторного распылителя в количестве 950 л/га при скорости 12,5 с/об с использованием насадки для распыления типа40015-E. В качестве поверхностно активного средства используют ТВИН-20 в количестве 0,25 об. Оценку состояния растений проводят спустя 3 недели после обработки.

Пшеница "Фидель" полностью неустойчива к PURSUIT в количестве 62,5 г/га (все растения уничтожены). Согласно результатам данных опытов в теплицах, устойчивые и имидазолинону селекционные культуры зимней пшеницы обладают отличной способностью переносить послевсходовую обработку гербицидом PURSUIT в количестве 62,5 г/га. Потомки, полученные из селекционных разновидностей FS-1, FS-2, и FS-4 являются однородно устойчивыми к PURSUIT, хотя и обнаруживаются в небольшом количестве растения-предки и растения- потомки, подверженные действию гербицида и дающие плохую урожайность. Можно считать эти 3 разновидности гомозиготными в отношении устойчивости к гербицидам. Потомки разновидности FS-3 дают расщепление свойств, являясь либо целиком устойчивыми, либо целиком неустойчивыми. Из потомков с расщепляющимися свойствами, обладающих хорошей урожайностью, примерно четверть индивидуальных растений являются неустойчивыми к гербициду. Данная селекционная разновидность совершенно очевидно гетерозиготна и требует дополнительного поколения, полученного самоопылением, для того чтобы иметь однородный гомозиготный селекционный материал. Увеличенные партии семян всех потомков высеивались в поле. В соответствии с описанным выше испытанием в теплице, потомство с нерасщепленными свойствами, полученное из каждой индивидуальной разновидности, смешивают, получая достаточное количество семян для проведения полевых испытаний (см. полевые испытания 1, часть 1, пример 4).

4. Генетические исследования

С целью определения, являются ли селекционные разновидности мутантов пшеницы аллельными (и возможности их получения из той же мутации) или различными, необходимо провести скрещивание мутантов. Кроме того, необходимо осуществить скрещивание линий, обладающих устойчивостью, с линиями, подверженными действию гербицида (пшеница "Фидель"), для установления степени наследственности свойства устойчивости к гербицидам. В соответствии с приведенными выше соображениями проделаны все возможные скрещивания и обратные скрещивания между пятью линиями предков ("Фидель", FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4). Гибриды Ф-1, которые получают в результате скрещивания, проверяют на наличие устойчивости, самоопыляют и подвергают обратному скрещиванию с предками, подверженными действию гербицидов, с целью получения соответствующих потомков и определения степени наследственности и аллельности селекционных разновидностей.

Опыт 1 В 6 поддонов, содержащих искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350", высеивают гибриды Ф-1, полученные в результате каждого из следующих скрещиваний FS-1 "Фидель"; FS-2 "Фидель"; FS-3 "Фидель"; FS-4 "Фидель" и "Фидель" (неустойчивый, исходный вид). Спустя неделю поддоны обрабатывают гербицидом PURSUIT в количестве 50, 100, 150, 200 и 250 г/га (по 1 поддону на каждую из концентраций), с целью определения генетических условий сохранения свойства устойчивости к гербицидам у селекционных разновидностей FS-1 FS-4. Гербицид наносят посредством лабораторного распылителя в количестве 950 л/га при скорости 12,5 с/об с использованием насадки для распыления типа40015-E. В качестве поверхностно активного средства используют ТВИН-20 в количестве 0,25 об. Оценку состояния растений проводят спустя 10 сут после обработки гербицидом.

Гибриды получаются низкорослыми, но не погибают при воздействии PURSUIT в количестве 250 г/га, что свидетельствует о даже в гетерозиготных условиях данные растения экспрессируют довольно высокий уровень устойчивости к гербицидам. Пшеница "Фидель" гибнет при концентрации гербицида PURSUIT, равной 150 г/га, и ее рост в значительной степени нарушается при концентрациях 50 и 100 г/га. Все гибриды FS-1 "Фидель", FS-2 "Фидель", FS-3 "Фидель" и FS-4 "Фидель". Определенное отношение при расщеплении свойств (1 устойчивый на 1 неустойчивый) предполагает гетерозиготность. Однако этот факт не наблюдается ни в одном из 4 селекционных вариантов. Основываясь на приведенных выше данных, можно утверждать, что ген, соответствующий устойчивости к гербицидам, является у устойчивых мутантных разновидностей доминантным и гомозиготным.

Опыт 2:

В этом опыте продолжается оценка мутантных разновидностей пшеницы посредством исследования устойчивости к гербицидам у материала, полученного обратным скрещиванием и самоопылением. Обратное скрещивание получают между растениями М-3 для каждого из четырех исходных мутантов и между этими разновидностями и пшеницей "Фидель". Потомство от указанных скрещиваний, а также как потомство, полученное самоопылением растений, использованных при скрещивании, выращивают в горшках "Азалия" размером 6 дюймов (15,2 см), содержащих искусственный грунт "Метро- Микс-350". Для каждого скрещивания берут 10 горшков, в каждый из которых помещают по 2 зерна. Спустя 10 сут все самоопыленные и обратным образом скрещенные растения обрабатывают гербицидом PURSUIT в количестве 200 г/га. Обработку гербицидом осуществляют согласно описанному в опыте 1 способу. Растения разреживают до 1 растения на горшок (посредством удаления более слабого из двух растений) спустя неделю после обработки гербицидом. Наблюдается 100-ное прорастание семян обратных скрещиваний мутантов и свыше 90 для семян мутантов, полученных самоопылением. Ни один из гибридов, полученных скрещиванием, не подвергается воздействию гербицида PURSUIT.

Опыт 3

Испытуемые гибриды Ф-1 (описанные в опыте 10), подвергнутые обратному скрещиванию с "Фидель", обрабатывают гербицидом PURSUIT в количестве 200 г/га. Ниже перечислены варианты скрещиваний, которые выращивают в горшках "Азалия" размером 6 дюймов ( 15,2 см ), содержащих искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350". Число горшков для каждого варианта скрещивания приведено в виде цифры после обозначения самого варианта скрещивания:

"Фидель" х ("Фидель"/FS-1) 12

"Фидель" х ("Фидель"/FS-2) 21

"Фидель" х ("Фидель"/FS-3) 9

"Фидель" х ("Фидель"/FS-4) 8

"Фидель" х 20

(* По 2 растения разновидности " Фидель" в каждом из 20 горшков). Примерно месяц спустя растения подвергают обработке (за исключением "Фидель"), гербицид PURSUIT (200 г/га) применяют согласно описанное ранее методике. Оценку состояния растения проводят спустя 3,5 нед.

Из подвергшихся обработке 49 скрещенных гибридов 29 выживают и 20 гибнут. Степень раделения 29 20 близка к ожидаемому соотношению разделения 1:1, которое имеет место в том случае, если наследственность управляет доминантным или полудоминантным геном. Однако мнимые гетерозиготные разновидности согласно данному опыту поражаются значительно более сильно, чем обработанные растения при той же дозе гербицида, что и в предшествующем опыте. Здесь не вполне ясно, вызывает ли обработка на более поздней стадии роста большую степень воздействия на гетерозиготы, или имеют место другие факторы.

Опыт 4

Устойчивые разновидности FS-1 FS-4, скрещивают с пшеницей "Фидель" и подвергают самоопылению семена Ф-1, полученные из указанных гибридов. При этом применяют следующие варианты скрещивания

("Фидель" х FS-2) самоопыление

("Фидель" х FS-3) самоопыление

("Фидель" х FS-4) самоопыление

Потомство Ф-2 указанных гибридов и их неустойчивую разновидность "Фидель" использованную для получения потомства, выращивают в поддонах. Для каждого из четырех вариантов скрещивания используют пять потомков Ф-2. Для каждого из потомков каждого из вариантов скрещивания берут 1 поддон, состоящий из шести рядов с 25 семенами в каждом из рядов. Поддоны подвергают послевсходовой обработке гирбицидом PURSUIT в количестве 200 г/га спустя 11 сут, гербицид PURSUIT применяют в соответствии с описанным выше способом.

Такое количество PURSUIT оказывается гибельным для неустойчивой пшеницы, хотя все еще не смертельным для растений, гомозиготных или гетерозиготных в отношении устойчивости. Разделение по признаку устойчивости к гербицидам в данном поколении подтверждает, что свойство устойчивости для каждой из четырех селекционных разновидностей (FS-1 FS-4) наследуется в качестве единственной доминанты или полудоминантного свойства. Потомство Ф-2 каждого из четырех вариантов скрещивания дает отчетливое соотношение 3 1 (устойчивые неустойчивые) при послевсходовой обработке PURSUIT в количестве 200 г/га.

Опыт 5:

Между четырьмя мутантными разновидностями пшеницы проводят скрещивание и обратное скрещивание. Семена Ф-1, полученные при указанных скрещиваниях, выращивают и самоопыляют растения. Собирают семена поколения Ф-2 и используют их в данном опыте для определения аллельности указанных четырех разновидностей. В поддоны, содержащие искусственный грунт под обозначением "Метро-Микс-350", высеивают по 100 зерен на каждый вариант скрещивания (четыре ряда по 25 семян в ряду). Кроме того, в каждый из поддонов высеивают ряд неустойчивой пшеницы "Фидель" Для каждого варианта скрещивания применяют три источника. По мере того, как растения достигнут стадии развития Z-12, поддроны подвергают обработке гербицидом PURSUIT в количестве 200 г/га. Раствор PURSUIT применяют в соответствии с описанным выше способом. Спустя четыре недели определяют количество неустойчивых растений.

Исследования аллельности четырех устойчивых селекционных разновидностей пшеницы свидетельствует о том, что все разновидности являются аллельными или очень тесно связанными. В поколении Ф-2, полученном в результате гибридного скрещивания, практически или полностью не наблюдается неустойчивых растений. В случае, если гены являются неаллельными и несвязанными, следует ожидать, что потомство Ф-2 будет давать расщепление свойств в соотношении 15 1 (устойчивые неустойчивые). В табл. 4 представлены результаты генетических исследований: отношение числа растений (устойчивые/ неустойчивые) при обработке PURSUIT в концентрации 200 г/га. Данные получены через 3 нед. после обработки.

Ни в одном случае число неустойчивых разновидностей с расщепленными свойствами не приближается к 1/16 от общего их количества ( см. табл. 4 ). Также не наблюдается наследования свойств по материнской линии. Эти данные также поддерживают предположение о том, что все четыре селекционных разновидности получены в результате одной и той же мутации или очень тесно связаны между собой.

Опыт 6:

Семена самоопыленного потомства второго обратного скрещивания устойчивых мутантов с пшеницей "Фидель" ( исходная неустойчивая культура) выращивают в стандартных поддонах, содержащих искусственный грунт "Метро-Микс-350"; для этого берут по 30 семян на каждый из экспериментов. Спустя 7 10 сут после посева поддоны обрабатывают гербицидом PURSUIT в количестве 200 г/га. Спустя 3 нед после обработки производят оценку расщепления свойства устойчивости у растений. Как и ожидалось, одни потомства обладают полной устойчивостью, другие потомства дают расщепление свойства, т.е. часть данного потомства обладает свойством устойчивости, а другая часть не обладает, тогда как еще одно потомство полностью неустойчиво к действию гербицида. Отбирают гомозиготные устойчивые растения и используют их для усиления качества семян в питомниках с целью получения разновидности с улучшенным свойством устойчивости.

ПРИМЕР 3

Изучение устойчивости к действию гербицидов

1. Уровень и диапазон устойчивости к действию гербицидов

Данные испытания, проводимого в теплицах, предназначены для определения уровня и диапазона устойчивости к действию гербицидов мутантных разновидностей на уровне целых растений. Для испытаний применяют четырех различных имидазолинона (PURSUIT, SCEPTER, ARSENAL, и соединение 2 ), а также сульфонилмочевину (OUST, фирменное обозначение продукта фирмы "Е.И.Дюпон де Немур", который представляет собой метиловый эфир о [[3-( 4,6-диметилпиримидин -2- ил) уреидо] сульфонил] бензойной кислоты ). Соединение 2 представляет собой потенциально действенный имидазолинон с коротким остатком и является 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 - имидазолин 2 -ил) 5 (метоксиметил) никотиновую кислоту. Скорости роста, определяемые по высоте растений, сравниваются для растений, прошедших обработку, и необработанных контрольных образцов. Семена поколения М-4, полученные из растений М-3, прошедших селекцию на предмет устойчивости к гербицидам, используют для проведения двухстадийного (вымачивание семян и обработка распылением) отбора; не проходившие отбор растения М-3, перемешанные после посева, не дают расщепления свойств ( см. исследование расщепления свойств). Данные линии соединяют в соответствии с их линиями предков FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4 В качестве контрольного образца и для сравнения свойств используют пшеницы "Фидель" (дикорастущая культура). По пять семян каждой из указанных линий (включая "Фидель") выращивают в каждом из 6-дюймовых (15,2 см) горшков для азалий, прореживая их затем до трех растений на горшок. Для каждого варианта обработки (различные препараты и различные дозы) применяют по три параллельных образца; в качестве контрольных используют шесть параллельных образцов на каждую линию пшеницы. Растения подвергают послевсходовой обработке спустя 10 сут. после посадки, применяя следующие гербициды и их концентрации.

Имидазолиноны:

PURSUIT: 20, 40, 80, 160, 320 г/га

SCEPTER: 40, 80, 160, 320, 640 г/га

ARSENAL^*: 3, 6, 12, 24, 48 г/га

Соединение 2: 20, 40, 80, 160, 320 г/га

Сульфонилмочевина

OUST 5, 10, 20, 40, 80 г/га

(^* Примечание Растения, обработанные ARSENAL, выращивают на 3 сут раньше остальных растений, однако измерения проводились одновременно с остальными вариантами обработки. Кроме того, хотя для оценки воздействия ARSENAL используют три параллельных опыта, в горшке оставляют только по два растения вместо трех. Перед обработкой в растворы гербицидов добавляют ТВИН-20 в количестве 0,25 об. Гербициды наносят посредством лабораторного распылителя в количестве 400 л/га при скорости подачи 8,2 с/об с использованием насадки для распыления типа65015-E. Высоту растений определяют непосредственно перед обработкой и через недельные интервалы на протяжении четырех недель. Все четыре разновидности являются аналогичными как по диапазону гербицидов, так и по степени устойчивости, FS-3 несколько менее устойчив по сравнению с тремя остальными. Хотя FS-3 отобран в качестве гетерозиготного образца, отдельные гтерозиготные или неустойчивые растения вполне могут быть включены в общую массу семян для проведения данных опытов. Основываясь на данных по высоте растений спустя четыре недели после обработки, можно утверждать, что пшеница устойчива к воздействию PURSUIT в концентрации более 320 г/га, к воздействию SCEPTER в концентрации более 640 г/га, к воздействию ARSENAL в концентрации более 48 г/га, к воздействию соединения 2 в концентрации более 80 г/га, и к воздействию OUST в концентрации более 5 г/га. Эти значения соответствуют примерно 8 кратному увеличению устойчивости по отношению к PURSUIT, более чем 16 кратному увеличению устойчивости по отношению к SCEPTER и ARSENAL, и 16 кратному увеличению устойчивости по отношению к соединению 2 и 2 кратному увеличению устойчивости по отношению к OUST. На фиг. 7 11 иллюстрируется устойчивость одной из разновидностей мутантной пшеницы (FS-1) по отношению соответственно к ARSENAL, OUST, PURSUIT, SCEPTER и соединению 2.

2. Устойчивость к гербицидам при довсходовой обработке

В данном опыте применяют имидазолиноны PURSUIT, SCEPTER, ARSENAL и соединение 2, а также сульфонилмочевину (OUST), применяя довсходовую обработку вместо послевсходовой (описанной в части 1 примера 3) пшеницы "Фидель", и устойчивых разновидностей FS-2 и FS-4 с целью определения устойчивости к гербицидам.

В опыте используют семена поколения М-4 двух мутантных разновидностей, FS-2 и FS-4 и семена неустойчивой разновидности "Фидель". По пять семян из указанных линий пшеницы выращивают в каждом из 6-дюймовых (15,2 см) горшков для азалий в грунте "Сассафрас" (песчаный глинозем). Для каждого варианта обработки (различные препараты и различные дозы) применяют по четыре параллельных образца; в качестве контрольных используют шесть параллельных образцов без обработки на каждую линию пшеницы. Спустя сутки после высеивания семян их подвергают обработке, применяя следующие гербициды и их концентрации, г/га:

PURSUIT 40, 80, 160, 320, 640

SCEPTER 40, 80, 160, 320, 640

ARSENAL 2,5, 5, 10, 20, 40

Соединение 2 5, 10, 20, 40, 80

OUST 5, 10, 20, 40, 80

Гербициды вводят согласно тому же способу, что и описанный выше, как в отношении диапазона концентраций, так и в отношении выбора гербицидов. После обработки горшки поливают. Высоту растений измеряют спустя 4 нед после обработки.

Основываясь на росте растений спустя 4 нед после обработки, можно утверждать, что разновидности FS-2 и FS-4 обеспечивают примерно 8 кратное увеличение устойчивости по отношению к PURSUIT и ARSENAL (см. фиг. 13 и 14 соответственно) от 8- до 16-кратного увеличение устойчивости по отношению к соединению 2 (фиг. 15) и SCEPTER (фиг.12). Увеличение устойчивости по отношению к OUST лежит в пределах от 2 до 4 раз. Аналогичные результаты получают по данным взвешивания корней и стебля спустя 7 нед после обработки.

3. Устойчивость к гербицидам при послевсходовой обработке

В данном втором опыте в теплице исследуют верхние пределя устойчивости мутантных разновидностей к PURSUIT при послевсходовой обработке. В нем используют семена поколения М-4 двух мутантных разновидностей, FS-2 и FS-4, и семена пшеницы "Фидель". По пять семян каждой из указанных линий пшеницы выращивают в каждом из 6-дюймовых (15,2 см) горшков для азалий в стерильном грунте "Метро-Микс". Непосредственно перед обработкой гербицидом растения прореживают, оставляя по три растения на горшок. Для каждого варианта обработки (различные препараты и различные дозы) применяют по три параллельных образца на каждую из линий пшеницы; в качестве контрольных используют шесть параллельных образцов без обработки на каждую линию пшеницы. Растения обрабатывают после появления всходов, 10 сут после посева, используя следующие гербициды в приведенных ниже концентрациях, г/га:

PURSUIT 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500

Соединение 2 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500

Гербициды вводят в соответствии с описанным ранее способом. Высоту растений определяют непосредственно перед обработкой; кроме того, высоту растений измеряют спустя 2 и 4 нед после обработки, а взвешивание корней и стебля осуществляют спустя 7 нед после обработки.

При всех комбинациях обработки селекционные культуры имеют первоначальные признаки замедления роста по сравнению с не прошедшими обработку растениями спустя 2 нед после введения гербицида (см. фиг. 16 и 18). Однако спустя 4 нед после обработки, высота растений разновидностей FS-2 и FS-4 равняется высоте растений, не проходивших обработку, при концентрациях гербицида PURSUIT 500 1000 г/га (см. фиг. 17) и при концентрациях соединения 2 25 50 г/га (см. фиг. 19). Селекционные культуры обеспечивают примерно 40 100-кратное увеличение устойчивости по отношению к PURSUIT и соединению 2 по сравнению с пшеницей "Фидель" (не проходившей селекцию) при послевсходовой обработке. Данные по весу корней, получаемые спустя 7 нед после обработки свидетельствуют о том, что FS-2 и FS-4 при тех же концентрацих гербицида обеспечивает вес свежих корней, равных 90 100 от массы свежих корней контрольных образцов, не проходивших послевсходовой обработки (см. фиг. 20 и 21).

4. Устойчивость к сульфамоилмочевине при довсходовой обработке

Проводят два опыта для определения того, сохраняет ли устойчивая к действию имидазолинонов пшеница устойчивость также и по отношению к сульфамоилмочевинным гербицидам. При этом исследуют на устойчивость на 4 сульфамоилмочевинных гербицида (приведенных ниже) и один сульфонилмочевинный гербицид (OUST) при до- и послевсходовой обработке.

В соответствии с первым опытом, мутантную разновидность пшеницы FS-2 в виде объединенных семян поколений М-3 и М-4 и семена пшеницы "Фидель" выращивают в 6-дюймовых (15,2 см) горшках для азалий в грунте "Сассафрас" (песчаный глинозем). Первоначально высаживают по три растения на горшок, которые затем прореживают, оставляя по два растения. Для каждого опыта берут по три параллельных группы; кроме того, используют контрольную группу из 15 единиц для каждой из разновидностей (FS-2 и "Фидель"). Растения подвергают обработке до появления всходов, применяя следующие гербициды и их концентрации:

Сульфамоилмочевины. г/га:

Соединение 3 12,5, 25, 50, 100, 200

Соединение 4 62,5, 125, 250, 500, 1000

Соединение 5 12,5, 25, 50, 100, 200

Соединение 6 12,5, 25, 50, 100, 200

Соединение 3 представляет собой 1 (4 метокси 6 метил 9 - триазин 2 ил) 3 [(о пропионилфенил) сульфамоил] мочевину, соединение 4 представляет собой 1 (4,6 диметокси 2 пиримидинил 3 - [(о пропионилфенил)сульфамоил] мочевину; соединение 5 представляет собой 1- [(о ацетилфенил) сульфамоил] 3 (4 метокси 6 метил 2 пиримидинил) мочевину, и соединение 6 представляет собой 1- [(о ацетилфенил) сульфамоил] 3 (4 метокси 6 метил S триазин 2 ил) мочевину. Все 4 указанные соединения описаны в патенте США N 4622065.

Сульфонилмочевина

OUST 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25 г/га

Гербициды вводят в соответствии с описанным ранее способом. Исследование при довсходовой обработке дает очень плохую всходимость; при этом визуально не замечено каких-либо отличий между пшеницей "Фидель" и устойчивыми селекционными культурами.

4. Устойчивость к сульфамоилмочевине при послевсходовой обработке

В соответствии со вторым опытом, мутантную разновидность пшеницы FS-2 в виде объединенных семян поколений М-3 и М-4 и семена пшеницы "Фидель" выращивают в 6-дюймовых (15,2 см) горшках для азалий в стерильном грунте "Метро-Микс-350". Первоначально высаживают по три растения на горшок, которые затем прореживают, оставляя по два растения. Для каждого опыта берут по три параллельных группы; кроме того, используют контрольную группу из 15 единиц для каждой из разновидностей (FS-2 и "Фидель"). Растения подвергают обработке после появления всходов, применяя следующие гербициды и их концентрации:

Сульфамоилмочевины, г/га:

Соединение 3 12,5, 25, 50, 100, 200

Соединение 4 62,5, 125, 250, 500, 1000

Соединение 5 12,5, 25, 50, 100, 200

Соединение 6 12,5, 25, 50, 100, 200

Сульфонилмочевина, г/га

OUST 6,25, 12,5, 25, 50, 100

Гербициды вводят в соответствии с описанным ранее способом. Устойчивые и неустойчивые разновидности пшеницы обрабатывают гербицидом в концентрациях, которые, как можно ожидать, вызывают сильное подавление или полное уничтожение неустойчивой пшеницы. К сожалению, неустойчивая культура пшеницы ("Фидель") не подвергается воздействию гербицида (что следует из визуального определения) даже при самых высоких уровнях сульфамоилмочевинных гербицидов при послевсходовой обработке. Либо пшеница "Фидель" является относительно устойчивой к сульфамоилмочевинным гербицидам и их концентрации недостаточны для нанесения ее ущерба, либо же данные гербициды не действуют на пшеницу по каким-то другим причинам (состав гербицидной композиции, влияние окружающей среды и тому подобное) Устойчивые разновидности пшеницы демонстрируют 2- 4 - кратное увеличение устойчивости к OUST при послевсходовой обработке; этот результат аналогичен полученному в предшествующем опыте.

6. Диапазон устойчивости к гербицидам пшеницы поколений М-3 М-4

Согласно данному опыту исследуют возможность сохранения у устойчивой к действию имидазолинонов пшеницы устойчивости также и по отношению к 3 сульфонилмочевинным гербицидам (BEACON, CLASSIC и OUST). (BEACON является фирменным обозначением фирмы "Циба-Гейги" и представляет собой 2 [4,6 бис (дифторметокси) пиримидин] 2 илкарбамоилсульфамоил] бензойную кислоту, CLASSIC является фирменным обозначением фирмы "Е.И. Дюпон де Немур" и представляет собой этиловый эфир о [[4 хлор 6 метокси 2 пиримидинил) карбамоил сульфамоил] бензойной кислоты, сульфамоилмочевинному гербициду (соединение 3), сульфонилкарбоксамиду (соединение 1) и имидазолиноновому гербициду (соединение 7 которое представляет собой 3 (4 изопропил 4 - метил 5 оксо 2 имидазолин 2 ил) 2 метилкротоновую кислоту); целью данного опыта является определение возможности проявления взаимной устойчивости к гербицидам, ингибирующим действие АГКС, отличным от имидазолинонов. Мутантную разновидность пшеницы FS-2 в виде объединенных семян поколений М-3 и М-4 и семена пшеницы "Фидель" выращивают в 5- дюймовых ( 12,7 см) горшках для азалий в стерильном грунте "Метро- Микс-350". Первоначально высаживают по три растения на горшок, которые затем прореживают, оставляя по два растения. Для каждого опыта берут по три параллельных группы; кроме того, используют контрольную группу из 6 единиц для каждой из разновидностей (FS-2 и "Фидель"). Растения подвергают обработке после появления всходов, спустя 7 сут после посадки, применяя следующие гербициды и их концентрации:

Сульфонилмочевины, г/га:

BEACON 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250

CLASSIC 31,3, 62,5, 125, 250, 500

OUST 6,25, 12,5, 25, 50, 100

Сульфамоилмочевина, г/га:

Соединение 3 125, 250, 500, 1000, 2000

Сульфонилкарбоксамид, г/га:

Соединение 1 250, 500, 1000, 2000, 4000

Имидазолинон, г/га:

Соединение 7 187,5, 375, 750

Гербициды вводят в соответствии с описанным ранее способом. Рост растений оценивают спустя 2, 3 и 4 нед после обработки гербицидом.

Взаимная устойчивость по отношению к сульфонилмочевинам (см. фиг. 22, 23 и 25) сульфамоилмочевине (см. фиг. 24), или сульфонилкарбоксамиду (см. фиг. 26), увеличивается в 0 2 раза, что аналогично результатам, наблюдаемым в предшествующих исследованиях с применением OUST. Устойчивость по отношению к имидазолиноновому производному соединению 7 аналогична наблюдаемой ранее для случая PURSUIT или ARSENAL (более чем 10 кратное улучшение, см. фиг. 27). Из результатов опыта следует, что не наблюдается сколь-нибудь заметного улучшения устойчивости по отношению к гербицидам, не относящимся к классу имидазолинонов.

ПРИМЕР 4

Полевые испытания

1. Полевое испытание 1

Полевые испытания проводят с целью оценки устойчивости пшеницы селекционных разновидностей FS-1 FS-4, устойчивых к действию имидазолинонов, при послевсходовой обработке ее имидазолиноновыми гербицидами. Разновидность пшеницы "Фидель", из которой и были получены указанные селекционные культуры, включена в качестве неустойчивого образца для сравнения. Ввиду того, что "Фидель" представляет собой французскую зимнюю пшеницу, не приспособленную к условиям штата Нью-Джерси, данный опыт предназначен только для оценки относительного эффекта обработки гербицидами на урожайность, без определения действительной потенциальной урожайности генотипов. Поэтому результаты представлены в виде урожайности в г/делянку, а не в виде бушелей на акр или тонн с гектара.

Для полевых испытаний используют объединенные семена поколения М-4 разновидностей FS-1, FS-2, FS-3, FS-4, и дикой пшеницы "Фидель". Опыт проводят по методике неполного разделения делянок, когда главная делянка используется для различных комбинаций гербицидов и их концентрации, а выделенная в качестве генотипа. Каждый вариант обработки ( различные гербициды и различные концентрации ) повторяют в виде трех параллельных опытов, однако параллельные опыты 2 и 3 не включают мутантную разновидность FS-3 вследствие недостатка соответствующих семян. Делянки имеют 3 м в длину и 1,5 м в ширину 7 рядов с расстояниями между ними в 7 дюймов (17,8 см) в каждом ряду высаживается примерно 25 семян.

Предусмотрено метровое расстояние между различными линиями пшеницы и 10-метровое между параллельными опытами.

Обработка включает следующие варианты: Необработанные контрольные образцы PURSUIT 100 и 200 г/га; соединение 2: 50 и 100 г/га соединение 8: 100 и 200 г/га.

Соединение 8 представляет собой 5 формил 2 (4 изопропил 4 - метил 5 оксо 2 имидазолин 2 ил) никотиновую кислоту в форме 5 - (диметилацеталя) и описано в опубликованной европейской патентной заявке N 322616.

Обработку осуществляют при концентрации 400 л/га с использованием распылителя, смонтированного на тракторе. В качестве поверхностно активного средства используют ТВИН-20 в количестве 0,25 об. Пшеницу обрабатывают на стадии развития Z-226, когда растение имеет высоту примерно 6 дюймов (15,2 см). Высоту растений и степень воздействия гербицидов оценивают спустя 3 и 6 нед после обработки. Урожай собирают спустя 10 нед после обработки.

Спустя 3 нед после обработки устойчивые селекционные сорта не проявляют никаких последствий обработки данными гербицидами, что следует из данных по высоте растений (фиг.28). Не замечено никаких видимых результатов обработки устойчивых селекционных культур данными гербицидами. Данные селекционные разновидности в отсутствии обработки несколько короче необработанной пшеницы "Фидель". Рост неустойчивой разновидности ( "Фидель") существенно замедляется в результате той же обработки.

Обработка гербицидами устойчивых селекционных культур все еще не сказывается на росте растений спустя 6 нед после обработки (см. фиг. 29). "Фидель" становится в значительной степени низкорослым или гибнет в результате гербицидной обработки, тогда как устойчивые селекционные культуры практически не поддаются воздействию такой же обработки. Окончательная высота растений, не прошедших обработку, практически равна высоте необработанной разновидности "Фидель", несмотря на то, что спустя 3 нед селекционные разновидности несколько короче необработанной пшеницы "Фидель". Устойчивые сорта пшеницы очевидно растут несколько медленнее необработанной разновидности "Фидель", возможно вследствие отрицательных рецессивных мутаций. Подобные рецессивные мутации можно устранить посредством обратного скрещивания с использованием способов, известных специалистам в данной области.

FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4 не дают уменьшения урожайности в результате послевсходовой обработки любыми гербицидами. Напротив, "Фидель" имеет урожайность на 35 меньше при обработке PURSUIT в количестве 100 г/га и более чем на 75 уменьшенную урожайность при обработке гербицидами других типов. Необработанная разновидность "Фидель" дает значительно более высокую урожайность по сравнению с FS-1 или FS-4 (133 г/делянку по сравнению с соответственно 40 г/делянку и 76 г/делянку). Средняя урожайность FS-2 (98 г/делянку) также меньше, чем у необработанного вида "Фидель", однако она не столь значительно меньше спустя 10 нед после обработки (фиг. 30). Более низкая урожайность селекционных культур не является неожиданной мутанты обладают меньшей силой и скоростью роста по сравнению с "Фидель", возможно вследствие наличия генов отрицательных свойств, появление которых вызвано мутагенезом, но не связано со свойством противостоять действию имидазолиноновых гербицидов. Отчасти удивительно, что существует столь значительный разброс урожайности у культур FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4, учитывая тот факт, что все три разновидности весьма вероятно являются результатами одной и той же мутации. Селекционные культуры полностью устойчивы к действию гербицидов, что иллюстрируется как высотой растений, так и урожайностью по зерну.

2. Полевое испытание II

Второе полевое испытание проводят с целью оценки устойчивости пшеницы селекционной разновидности FS-4, устойчивой к действию имидазолинонов, при послевсходовой обработке ее имидазолиноновыми гербицидами PURSUIT, CADRE, соединением 2 и соединением 8, а также сульфонилмочевинным гербицидом ACCENT. CADRE является фирменным обозначением "Америкен Цианэмайд Компани" и представляет собой 2 (4 изопропил 4 метил 5 оксо 2 имидазолин 2 ил) метилникотиновую кислоту, описанную в патенте США N 4798619. ACCENT является фирменным обозначением фирмы "Е.И. Дюпон де Немур" и представляет собой 1 (4,6 диметоксипиримидин 2 ил) 3 диметоксикарбамоил 2 - пиридинсульфонил) мочевину). Разновидность пшеницы "Фидель" включена в качестве неустойчивого образца для сравнения.

Семена поколения М-5 наиболее урожайных линий разновидности FS- 4, полученных в виде потомства при полевых испытаниях 1, смешивают и используют для данного полевого испытания наряду с семенами разновидности "Фидель".Опыт проводят по методике неполного разделения делянок при этом главная делянка используется для обработки гербицидом, а выделенная в качестве генотипа. В данном опыте используют 11 вариантов обработки и проводят по 3 параллельных эксперимента для каждого вариант обработки (различные гербициды и различные концентрации ). Делянки имеют 3 м в длину и 1,5 м в ширину (7 рядов с расстояниями между ними в 7 дюймов (17,8 см); плотность посева составляет примерно 100 семян/кв.м. Предусмотрено 0,5- метровое расстояние между различными линиями пшеницы и 3-метровое между параллельными опытами.

Обработка включает следующие варианты: Необработанные контрольные образцы; Имидазолиноны PURSUIT 100 и 200 г/га; соединение 2 50 и 100 г/га; соединение 8 100 и 200 г/га CADRE 50 и 100 г/га; Сульфонилмочевина ACCENT 20 и 40 г/га.

Обработку осуществляют при концентрации 200 л/га с использованием ранцевого распылителя. В качестве поверхностно- активного средства используют неионный агент Х-77 ("Бейлент Корпорейшн") в количестве 0,25 об. Пшеницу обрабатывают на стадии развития Z-22 Z28, когда растение имеет высоту примерно 30 35 см. Высоту растений и степень воздействия гербицидов оценивают спустя 1, 2, 3 и 6 недель после обработки. Урожай собирают спустя 10 нед после обработки.

Спустя 3 нед после обработки рост посевов разновидности "Фидель" резко замедляется всеми видами гербицидов. Устойчивая разновидность FS-4 обладает устойчивостью к действию всех испытуемых имидазолинонов, однако при этом не наблюдается взаимной устойчивости по отношению к гербициду класса сульфонилмочевин (ACCENT). На фиг. 31 представлены результаты измерений, проведенных спустя 6 нед после обработки, которые указывают на то, что эффект послевсходовой обработки PURSUIT, CADRE, соединения 2 или соединения 8 на конечную высоту растения отсутствует. Устойчивая пшеница при этом обладает весьма слабой устойчивостью по отношению к ACCENT, или не обладает ею вообще. Сравнительная неустойчивая разновидность очень сильно угнетается или гибнет при применении указанных концентраций гербицидов. Урожайность, представленная в виде среднего для трех параллельных экспериментов, приведена на фиг. 32. Урожайность устойчивой селекционной пшеницы FS-4 не уменьшается в результате воздействия любых имидазолиноновых гербицидов. Урожайность разновидности "Фидель" значительно падает или сводится к нулю в результате обработки имидазолиноновыми гербицидами. Как устойчивая, так и неустойчивая ("Фидель") разновидности дают очень малый урожай или вообще не дают урожая после обработки ACCENT. Воздействие обработки имидазолинонами на урожайность "Фидель" проявляется даже еще сильнее, чем описанное выше уменьшение высоты растений.

Пшеницу, использованную для данного полевого испытания, получают в результате смешивания нескольких типов семян, полученных на делянках размножения из семенного материала, полученного согласно полевым испытаниям 1. Каждая делянка размножения засеивается семенами из одного растения. Хотя для данного материала не проводилось обратного скрещивания с "Фидель", возможно провести отсеивание семенного материала с плохой всхожестью и другими сельскохозяйственными характеристиками. В результате урожайность устойчивых разновидностей значительно увеличивается по сравнению с достигнутой при полевых испытаниях 1. Урожайность, достигнутая в случае устойчивой пшеницы на необработанных контрольных делянках, равна урожайности неустойчивой разновидности "Фидель" на необработанных делянках. Данный факт свидетельствует о том, что введение гена устойчивости к имидазолинонам не дает отрицательного эффекта на выход зерна.

ПРИМЕР 5

Ферментативные исследования

1. Первоначальное исследование (Растения поколения М-3)

Обработка гербицидом Растения М-3 четырех исходных мутантных разновидностей (FS-1, FS-2, FS-3 и FS-4) исследовались на метаболическую активность АГКС. Растения, которые приобретают свойство устойчивости после первой селекции способами вымачивания семян и обработки распылением PURSUIT переводят из поддонов в индивидуальные горшки. Когда возраст растений достигнет 3 нед, по два растения каждой из мутантных разновидностей FS-1 - FS-4 проходят вторую обработку PURSUIT в количестве 62,5 г/га, тогда как еще два растения каждой из разновидностей остаются необработанными. В опыте применяют также обработанные и необработанные растения неустойчивой пшеницы "Фидель". Примерно половину листвы каждого растения над поверхностью почвы удаляют и испытывают спустя 2 сут после введения гербицида на предмет ингибирования АГКС с применением валина и лейцина (в качестве контрольных образцов), SCEPTER, PURSUIT, OUST и сульфонилкарбоксамидного гербицида - соединения 9. Соединение 9 представляет собой 2 ацетамидо 2,3 диметил - N (п толилсульфонил) бутирамид и описано в патенте США N 4883914.

В случае необработанных растений наблюдается слабая устойчивость к PURSUIT для линий устойчивой пшеницы. Однако при этом наблюдается значительное увеличение устойчивости АГКС по отношению к PURSUIT на обработанных растениях FS-1 FS-4 по сравнению с обработанной дикой разновидностью. На фиг. 33 36 приведены полученные результаты для одной из селекционных культур (FS-4) и для дикой (неустойчивой) пшеницы "Фидель". Следовательно, устойчивость разновидностей FS-1 FS-4 к PURSUIT должна быть обусловлена наличием в них изменением АГКС, резистентной к ингибированию PURSUIT.

Экстракция фермента: для экстракции АГКС 10 г растительной ткани переводят в порошок в жидком азоте и гомогенизируют в 100 мМ буфере на основе фосфата калия (pH 7,5), содержащем 10 мМ пирувата натрия, 5 мМ хлорида магния, 5 мкМ ЭДТУК, 100 мкМ. ФАД, 1 мМ валина, 1 мМ лейцина, 10 глицерина и 10 мМ циствина. Гомогенизированную смесь фильтруют через нейлоновую ткань (размер отверстий 53 мкм) и центрифугируют при 15000 в течение 20 мин. Поверхностный слой доводят до 50-ного насыщения по отношению к сульфату аммония и выдерживают в течение 20 30 мин во льду. Затем смесь центрифугируют при 15000 в течение 20 мин и отбрасывают поверхностный слой. Таблетку сульфата аммония растворяют в 50 мМ буфера на основе фосфата калия (pH 7,5), содержащем 1 мМ ЭДТУК и 100 мМ хлорида натрия и используют для опытов.

Исследование АГКС Активность АГКС исследуют посредством оценки продукта ацетолактата после превращения в ацетон (декарбоксилирования) в присутствии кислоты. Стандартные реакционные смеси содержат фермент в 50 мМ буфере на основе фосфата калия (pH 7,5), содержащем 100 мМ пирувата натрия, 10 мМ хлорида магния, 1 мкМ тиаминфирофосфата и 100 мкМ ФАД. Эту смесь выдерживают при 37^oC в течение 1 ч, по истечении которого реакцию останавливают добавлением серной кислоты таким образом, что конечная концентрация серной кислоты в пробирке составляет 0,85 Продукт реакции декарбоксилируют при 60^oC в течение 15 мин. Образовавшийся ацетон определяют посредством выдерживания с креатином (0,17) и 1 нафтолом (1,7 в 4Н NaOH) по способу Вестерфилда (В.В. Вестерфилд, J.Biol.Chem. 161, 495 502 (1945)). Максимальное окрашивание наблюдается при выдерживании при 60^oC в течение 15 мин и последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение 15 мин. Поглощение окрашенного комплекса измеряют при 520 нм. Проделывают также соответствующую проверку непосредственного образования ацетона в ходе ферментативного исследования. Каждое определение повторяют по меньшей мере дважды и указанные эксперименты повторяют минимум 2 раза.

2. Ферментативное исследование 1 (Растения М-4)

Обработка гербицидом 2 поддона, в которых выращивают примерно 100 семян каждой из селекционных разновидностей (FS-1, FS-2 и FS-4) и пшеницы "Фидель" в стерильном грунте "Метро-Микс-350". Спустя 2 сут каждый поддон обрабатывают после появления всходов распылением PURSUIT в количестве 62,5 г/га. Гербицид наносят в количестве 400 л/га при скорости подачи 8,2 с/об с использованием насадки для распыления типа65015-E. В качестве поверхностно- активного средства используют ТВИН-20 в количестве 0,25 об. Растения выращивают в течение еще 3 сут и испытывают на предмет активности АГКС.

Экстракция фермента и исследование АГКС: Как и в предшествующем опыте.

3. Ферментативное исследование II (Растения М-4)

Обработка гербицидом Как описано выше в ферментативном исследовании 1 за тем исключением, что гербицид распыляют в количестве 950 л/га при скорости подачи 12,8 с/об с использованием насадки для распыления типа40015-E.

Экстракция фермента и исследование АГКС: Как и в предшествующем опыте.

Результаты обоих серий опыты аналогичны. АГКС активность для всех четырех гомозиготных устойчивых мутантных линий, достигнутая для необработанных растений, соответствует среднему уровню устойчивости по отношению к PURSUIT по сравнению с ферментом, полученным из контрольных диких растения ("Фидель"). Однако значительно более высокий уровень устойчивости к PURSUIT наблюдается для фермента из селекционных культур, прошедших обработку, по сравнению с ферментом из обработанных растений разновидности "Фидель" (см. фиг. 37 40). Наблюдается также некоторый уровень устойчивости по отношению к SCEPTER и OUST однако этот уровень устойчивости ниже соответствующего значения для PURSUIT Диапазон и уровень устойчивости к различным гербицидам весьма близок для всех четырех мутантов, которые могут быть результатом единой мутации. Данный вывод подтверждается описанными выше генетическими исследованиями.