антимикробная композиция

Формула изобретения

1. Антимикробная композиция, содержащая низин, отличающаяся тем, что, с целью расширения спектра воздействия композиции на бактерии и увеличения таким образом бактерицидной активности, она дополнительно содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) при следующем соотношении компонентов, мас.

Низин 0,00001 0,3

ЭДТК 0,003 0,7

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 0,01 1,0 мас. поверхностно-активного вещества тритон X-100, Твин 20 или монолаурин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение является частичным продолжением заявки N 209861, поданной 22 июня 1988 г. Низин представляет собой полипептид с антимикробными свойствами, который вырабатывается в природе разными штаммами бактерий Streptococcus lactis.

Он представляет собой известный пищевой консервант, который замедляет рост спор некоторых видов грамм-положительных бактерий.

Хотя в некоторых источниках его ошибочно и неточно называют антибиотиком, низин более правильно относится к бактериоцинам, т.е. белковое вещество, вырабатываемое бактериями, которое обладает антибактериальной активностью только против тех видов, которые близки к их видам по происхождению.

Низин представляет собой существующий в природе консервант, который в малых концентрациях обнаруживается в молоке и сыре и считается совершенно нетоксичным и не вызывающим аллергических реакций у человека. Ассоциация по пищевым продуктам и лекарствам признала его безопасным для непосредственного использования в качестве пищевого ингредиента в сырных пастах, в переработанных сырных пастах, в сырах и пастах с фруктами, овощами или мясом. Кроме того, поскольку он является полипептидом, любые остатки низина, остающиеся в пищевых продуктах, быстро перевариваются.

Полное описание свойств низина приведено в [1] В этой публикации описано все, что общеизвестно в настоящее время о низине.

Низин, вырабатываемый Streptococcus lactis, имеется на рынке в виде нечистого препарата, низаплина ТН, фирмы Aplin Barrett Ltd. Dorset, England, и его можно получить путем выделения низина из культур Streptococcus lactis с последующей концентрацией его по известным способам. Опубликованы такие способы получения низина путем использования измененных штаммов Streptococcus (см. патент США 4716115, выданный Jouzaler et al, 29 декабря 1987 г.) Вероятно можно получить низин и с помощью рекомбинантной ДНК технологии.

Низин эффективно использовался в качестве консерванта в молочных продуктах, таких как сыры, сливки и молоко. Использование низина в сыроварении и сырных продуктах является предметом последних патентов (см. патенты США NN 4584199 и 4597972). Использование низина для подавления роста некоторых грамм-положительных бактерий хорошо задокументировано. Однако его полный успех и приемлемость в качестве пищевого консерванта затруднены представлением о том, что низин неэффективен против грамм-отрицательных и многих грамм-положительных бактерий. Грамм-отрицательные бактерии почти всегда присутствуют вместе с грамм-положительными и являются основным источником порчи пищевых продуктов (см. Taylor, патент США 5584199, выданный 22 апреля 1986 г. и Taylor, патент США 4597972, выданный 1 июля 1986 г. Tsai and Saudine, "Conjugae Trausfer of Nisin Plasmid Genes from Streptococcus lactis 7962 to Leuconostoc Dextranieum 181, Applied and Environmentae Microbiology, Feb. 1987, p. 352; "A Naturae Preservative", Food Engineering Int"l, May, 1987, pp. 37 37; "Focus on Nisin" Food Manufacture, March, 1987, p. 63).

В настоящее время обнаружено, что в противоположность предшествующим оценкам композиции, включающие низин, в сочетании с разными антибактериальными препаратами имеют широкий диапазон бактерицидной активности против грамм-отрицательных бактерий так же, как повышение активности против более широкого диапазона грамм-положительных бактерий, чем низин в чистом виде.

Повышенная бактериальная активность против грамм-положительных бактерий существует в более широком диапазоне значений pH, чем указывалось ранее. Изобретение предлагает композиции на основе низина или других лантионин содержащих бактерицидов в комбинации с различными небактерицидными препаратами, например веществами, вызывающими образование хелатных соединений, или ПАВ.

Изобретение также предлагает эти композиции в разбавленном или суспендированном виде в подходящем носителе, в результате чего получают бактерициды с более широким спектром действия.

В частности, было обнаружено, что раствор с содержанием низина в количестве 0,1 300 мкг/мл в присутствии 0,1 20 мМ, способствующего образованию хелатного вещества агента, например ЭДТК, фактически исключает рост грамм-отрицательных бактерий таких, как Salmonella typhimurium, Escherichia Coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis, Actinobacillus actinomycetescomitans u Klebsiella pneumonial и более активен против грамм-положительных бактерий таких, как Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listriamonocytogenes Streptococcus agalactial u Coryneform, чем низин в чистом виде.

Хотя усиление активности с помощью способствующего образованию хелатного соединения вещества зависит от концентрации, в противоположность тому, что ожидалось концентрации ЭДТК выше 20 мМ, понижали бактерицидную активность низина. Однако в присутствии белкового носителя и поливалентных полимеров таких, как сывороточный альбумин, коллаген, желатин, казеин и кератин, снижение активности низина присутствием ЭДТК в концентрации более 20 мМ уменьшается, таким образом обеспечивая полезный диапазон концентраций ЭДТК, в котором присутствие ЭДТК усиливает активность низина.

Также нашли, что раствор, включающий 0,1 300 мкг/мл низина и 0,1 20 мМ обеспечивающего получение хелатного соединения вещества, еще более повышает эффективность низина против грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий в присутствии 0,01 1,0% ПАВ.

Кроме того, обнаружили, что в присутствии только ПАВ низин имеет повышенную активность против грамм-положительных бактерий.

В изобретении подходящими, способствующими образованию хелатных соединений вещества являются ЭДТК, Ca ЭДТК, Ca a₂ ЭДТК и другие алкилдиамины тетраацетаты, ЭГТК и цитраты. ПАВ, ценные как осветлители и подходящие для комбинирования с низином, с ЭДТК или без нее, включают неионные ПАВ Tweens, Tritons и глицериды, ионные ПАВ такие, как жирные кислоты, четвертичные соединения, анионные ПАВ такие, как додецилсульфат натрия, и амфотерные ПАВ такие, как кокамидопропилбетаин, и эмульгаторы.

Поскольку грамм-положительные и грамм-отрицательные бактерии почти всегда в пищевых продуктах присутствуют вместе, то эффективность композиций на основе низина против грамм-отрицательных бактерий таких, как Salmonella typhimurium, Escherichia Coli, Klebsiella pneumonial, Pseuclomonas aeruginosa, Bacterioides gingivalis, Actinobacillus Actinomycetes comitans и других грамм-отрицательных патогенных и грамм-положительных бактерий очень ценна.

Эти бактерициды, в частности, предназначены для предотвращения порчи сырых ингредиентов, приготовленных пищевых продуктов и напитков патогенными бактериями и другими микроорганизмами. По отношению к пищевым продуктам используется обработка мяса, особенно птицы, яиц, сыров и рыбы и обработка пищевой упаковки и используемого оборудования.

Кроме того, используются пищевые консерванты, такие как в готовых сырах, сливках, молоке, молочных продуктах и при чистке птицы, рыбы, мяса, овощей, молочных продуктов и оборудования пищевой промышленности. Использование композиций на основе низина не должно ограничиваться областями применения в пищевой индустрии, они могли бы использоваться в любой области, где есть необходимость уничтожения грамм-отрицательных и грамм-положительных бактерий.

Указанные композиции могут быть растворены в подходящем носителе, водном растворителе или буфере или суспендированы в любой подходящей жидкости, коллоидной или полимерной среде для получения бактерицида.

Указанные композиции или бактерициды могут быть включены в мази или повязки для использования в медицинских целях таких, как лечение инфекций, повязки на раны или хирургические имплантаты и в качестве целого ряда антисептиков для кожи и полосканий для горла, дезинфицирующих стерильных средств, средств для протирки предметов и косметических средств.

Указанные бактерициды можно использовать для дезинфекции медицинского инструментария, дооперационных протирок пола и т.п. Указанные бактерициды особенно полезны при таких обстоятельствах, когда необходимо провести дезинфекцию среды, но где нельзя использовать химические препараты из-за опасности коррозионного или другого токсического воздействия.

В отличие от большинства гермицидов с широким спектром действия, который регулируется присутствием комплекса органических соединений, композиции изобретения эффективны в качестве бактерицидов в присутствии органического вещества такого, как молоко или сыворотка.

Известно, что низин оптимально подавляет рост нескольких родственных грамм-позиционных бактерий, в частности некоторых грамм-положительных спорообразующих бактерий при pH 5,0. Бактерицидное действие низина в растворе с хелатирующим агентом было удивительно быстрым и в большой степени усиленным против целого ряда грамм-положительных бактерий при pH больше 5,0 и более того активизировалось против грамм-отрицательных бактерий как при основных, так и при кислотных pH, предпочтительно в диапазоне 5,0 8,0.

Эта неожиданно быстрая и широкого диапазона бактерицидная активность активированного хелатирующим агентом низина делает его пригодным для использования, кроме прочих областей, в качестве дезинфицирующего препарата.

Низин принадлежит к классу пептидных бактерицидов, содержащих лантионин. В этот класс также входят субтилин, эпидермин, циннамицин, дурамицин, анковенин и Pep 5. Каждый из этих пептидных бактерицидов продуцируется разными микроорганизмами. Однако нашли, что субтилин, полученный при культивировании Bacillus subtilis, и эпидермин, полученный при культивировании некоторых культур Staphy lococcus epidepmidis, имеют молекулярное строение, очень близкое молекулярному строению низина (см. Hurst; pp. 85 86 и Schnell et al, Nature, 333, 276 278).

Поэтому полагают, что в результате молекулярной идентичности другие лантионины, содержащие пептидные бактерициды, будут также эффективны, как низин, в комбинации с хелатирующими агентами и неионными ПАВ при борьбе с поражениями, вызываемыми грамм-положительными и грамм-отрицательными бактериями.

Эффективность низина и других лантионинсодержащих пептидных бактерицидов и композиций с ними против грамм-отрицательных бактерий удивительна, так как в известном уровне техники указано об отсутствии такой активности у низина. Усиленная активность низина против грамм-позитивных бактерий в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) при pH больше 5,0 является неожиданной, поскольку ранее считалось, что активность низина оптимальна при pH 5,0.

Кроме того, открытие такой эффективности низина и лантионсодержащих пептидных бактериоцидных композиций, как бактерицидов, удовлетворяет долгоожидаемую потребность в области консервации пищи, которая страдала от отсутствия приемлемого, натурального, нетоксичного агента, эффективного против широкого диапазона бактерий.

Для демонстрации превосходной и неожиданной быстрой активности композиции, содержащей низин, ЭДТК и/или различные ПАВ, против грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий провели ряд экспериментов с этими бактерицидами. Эти эксперименты являются иллюстрацией и не предназначены для ограничения данного изобретения. Можно ожидать, что другие лантиосодержащие пептидные бактериоцины будут эффективными заместителями низина и что хелатирующие агенты, отличные от ЭДТК, будут эффективными заместителями ЭДТК.

Все тесты в следующих примерах проводились при 37^oC. Эффективность увеличенного широкого диапазона бактерицидов определялась измерением бактерицидной активности как процента выживших бактерий после обработки бактерицидов. Обычно после выращивания 10⁷ клеток на мл суспензии целевых видов с новым бактерицидом в течение данного интервала времени бактерии собирали центрифугированием в течение 2 мин.

Бактериальный осадок в пробирке промывали до состояния удаления бактерицида спасательным буфером, далее называемым Phage буфер (50 мМ Трис-HCl буфера pH 7, 8, 1 мМ MgSO₄; 4 мМ CaCl₂; 0,1 М NaCl и 0,1% желатина), повторно суспендировали и выпусками разбавляли в Phage-буфере, а затем 100 мл суспендированных бактерий распыляли на чашки с питательной агаровой средой.

Выживание бактерий определялось подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ) после выращивания в течение 24 28 ч при 37^oC. Эффективным бактерицидом в соответствии с изобретением является тот, который позволяет выжить менее 0,1% начального количества жизнеспособных бактерий.

Пример 1. Активность низина и хелатирующего агента против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

Как показано в табл. 1, два теста провели в 20 мМ Трис, pH 8,0 при 37^oC для проявления воздействия бактерицида, содержащего низин и один хелатирующий агент ЭДТК. Тест 1, контрольный, проводился без ЭДТК и показывает действие одного низина на грамм-отрицательные бактерии S. typhimurium.

Увеличенные концентрации низина действительно проявляют некоторую активность, но даже эта активность повышенных концентраций в отсутствие ЭДТК дает только 1,6% выживания при 100 мг/мл низина, что не соответствует целям консерванта пищи. Уровень бактерицидной активности, полученный из низина и ЭДТК, значительный.

Тест 2 (табл. 1) проводили, используя низин плюс 20 мМ ЭДТК, и он показывает превосходную активность композиции на основе низина в уничтожении целевых грамм-отрицательных бактерий.

Табл. 1 показывает, что в тесте 2 при концентрации 20 мМ ЭДТК и 30 мг/мл низина бактерицид проявляет значительную бактерицидную активность против S. typhimurium, в то время как при концентрациях низина 100 мг/мл и выше бактерицид на основе низина и ЭДТК фактически уничтожает бактерии (процент выживания менее 10^-4, что показывает отсутствие выживших бактерий в пробе). Таким образом, комбинация ЭДТК и низина демонстрирует синергистическую активность, в 1000 раз превышающую активность одного низина.

Пример 2. Активность низина, хелатирующего агента и ПАВ против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

Четыре теста (табл. 2) проведены для определения влияния на S. typhimurium бактерицида, содержащего низин и, ЭДТК и ПАВ Тритон X-100 в 20 мМ Трис, pH 8,0 при 37^oC. Контрольный тест (тест 1) идентичен контрольному тесту примера 1 (табл. 1).

Тест (табл. 2) проводили, используя низин и 1,0% Тритон X-100, но без ЭДТК. Присутствие одного детергента подавляет активность низина против грамм-отрицательных бактерий, и низин был неэффективным. Однако в тестах 3 и 4 (табл. 2), которые представляют изобретение, наличие 20 мМ ЭДТК в комбинации с Тритон X-100 является бактерицидом, который значительно увеличивает бактерицидную активность низина против S. typhimurium.

Кроме того, комбинация Тритон X-100 с ЭДТК, но без низина, была эффективной, хотя в меньшей степени, чем в присутствии низина. Хотя в обоих тестах 3 и 4 (табл. 2) низиновые комбинации были очень эффективны, концентрация 1,0% Тритон X-100 (тест 4, табл. 2) была наиболее эффективной.

Наличие неионного ПАВ, Тритон X-100 в комбинации с ЭДТК усиливает активность низина против грамм-отрицательных бактерий даже в большей степени, чем бактерицид, содержащий только низин и ЭДТК (пример 1).

Пример 3. Активность низина, хелатирующего агента и ПАВ против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

Табл. 3 показывает увеличенную активность против S. typhimurium бактерицида, содержащего низин, 20 мМ хелатирующего агента ЭДТК и неионовое ПАВ Твин 20 в 20 мМ Трис, pH 8,0 при 37^oC. Как и в случае Тритон X-100 (пример 2), комбинация низина и ЭДТК с (1%) Твин 20 более эффективна.

Пример 4. Активность низина, хелатирующего агента и ПАВ против грамм-отрицательных бактерий (Escherichia coli)

Воздействие бактерицида, содержащего низин и ЭДТК, на грамм-отрицательные бактерии E. coli показано в табл. 4.

Тесты с и без ЭДТК выполнялись в 20 мМ Трис буферном растворе, pH 8,0 при 37^oC при начальном количестве жизнеспособных бактерий E. coli 110⁷ клеток/мл. Воздействия бактерицидов измеряли как функцию процента выживания бактерий после 2 ч.

В тесте 1 (контрольный, табл.4) без ЭДТК низин проявляет малую неимеющую значение активность против E. coli. В тесте 2 (табл. 4), однако при наличии 20 мМ ЭДТК бактерицидная композиция проявляет значительную активность против бактерий E. coli.

Активность увеличивается в эффективности по мере увеличения концентрации низина. Комбинация низина с ЭДТК как бактерицид демонстрирует 1000 кратное синергистическое увеличение эффективности против E. coli. В тестах 3 и 4 (табл. 4) можно видеть, что Тритон Х-100 не имеет существенной бактерицидной активности против E. coli.

Фактически Тритон Х-100 появляется для подавления активности низина против грамм-отрицательных бактерий, как было установлено с C. typhimurium (табл. 2). Однако общее усиление низина при помощи ЭДТК существенно изменяет тормозящие действия Тритон Х-100, как видно в табл. 2 и 4.

Таким образом, очевидно, что бактерицид, содержащий низин и хелатирующий агент, такой как ЭДТК, является эффективным консервантом пищи против различных грамм-отрицательных бактерий даже в присутствии ПАВ.

Пример 5. Активность низина и хелатирующего агента против грамм-отрицательных бактерий (Klebsiella pneumonial)

Влияние бактерицида, содержащего низин и ЭДТК на грамм-отрицательные бактерии K. pneumonial, показано в табл. 5.

Два теста, один с ЭДТК и другой без (контрольный), проводились в 20 мМ Трис буфере, pH 8,0 при 37^oC при начальном количестве жизнеспособных бактерий 10⁷ клеток/мл K. pneumonial. Эффект измеряли как функцию процента выживших бактерий после 2 ч.

В тесте 1 (контрольный, табл.5) без ЭДТК низин проявляет малую незначащую бактерицидную активность против K. pneumonial. В тесте 2 (табл. 5) при наличии 20 мМ ЭДТК бактерицид проявляет значительную активность против K. pneumonial. Активность увеличивается в эффективности по мере увеличения концентрации низина.

Пример 6. Активность низина против грамм-отрицательных бактерий (Salmonella typhimurium) зависит от концентрации хелатора

Данные в табл. 6 показывают, что увеличенная активность низина против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium) зависит от концентрации ЭДТК в 50 мМ ацетате натрия, pH 5,0 или 20 мМ Трис, pH 8,0 при 37^oC.

В тестах 1 и 3 (контрольные, табл. 6), использующих концентрации ЭДТК без низина, проявляется малая незначащая активность против S. typhimurium при pH 5,0 (1) или 8,0 (3). В тестах 2 и 4 (табл.6), где 10 мг/мл низина были представлены в комбинации с ЭДТК, бактерициды проявляли значительную активность против S. typhimurium. Активность бактерицидов аналогична кислому pH (5,0) и основному pH (8,0) вопреки тому факту, что активность одного низина против грамм-положительных бактерий оптимальна при pH 5,0.

Усиление низина при помощи ЭДТК зависит от концентрации, являясь оптимальным в диапазоне 0,2 10 мМ при значениях pH 5,0 и 8,0. Удивительно, что при концентрациях больше 10 мМ ЭДТК, усиление низина при помощи ЭДТК снижается; это снижение активности значительно больше при pH 8,0, чем при pH 5,0.

Пример 7. Низин и хелатирующий агент против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

Усиление активности низина при помощи ЭДТК против грамм-отрицательных бактерий при наличии биологической ткани было показано при помощи S. typhimurium на мышце цыпленка и приведено в табл. 7.

а) неприсоединенные клетки;

б) содержит 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Выращивание проводили в 50 мМ ацетате натрия, pH 5,0 или 20 мМ Трис, pH 8,0 при 37^oC.

До использования кубики мышцы цыпленка дезинфицировали гипохлоритом натрия и повидон иодом. Для заражения ткани кубики цыпленка погрузили в суспензию 10⁸ клеток/мл S. typhimurium в 20 мМ Трис HCl, pH 8,0.

Избыточная влага удалена из погруженных кубиков подсачиванием. Образцы ткани цыпленка поместили в достаточный буфер, содержащий композицию на основе низина для покрытия этой ткани, и выращивали 2 ч при 37^oC, после чего эту ткань поместили в Phage буфер, достаточный для покрытия ткани. Бактерии, оставшиеся в испытательном растворе, собрали центрифугированием, промыли Phage буфером и объединили с бактериями, вымытыми из ткани при помощи Phage буфера. Объединенный пробы (термин "неприсоединенные клетки") выпусками разбавили, и 100 мл аликвоты поместили в чашки для определения выживания бактерий.

В тестах 1 и 3 (табл. 7) в отсутствие низина при pH 5,0 и 8,0 один ЭДТК не оказывал значительного влияния на выживание S. typhimurium. В тестах 2 и 4 (табл.7), где присутствовало 300 мг/ мл низина, бактерициды проявляли значительную активность против S. typhimurium на мышце цыпленка при pH 5,0 и 8,0.

Усиление низина при помощи ЭДТК зависит от концентрации, причем оптимальная концентрация находится в диапазоне 0,3 мМ 10 мМ ЭДТК при pH 5,0 и 8,0. При концентрациях больше 10 мМ ЭДТК при pH 8,0 активирование низина ЭДТК снижается. Однако, как показано в тесте 5 (табл.7), в присутствии 1,0% БСА при pH 8,0 эффективность низина против S. typhimurium на мышце цыпленка выражается в диапазоне концентрация ЭДТК до 10 мМ.

Таким образом, бактерициды, содержащие низин и низкие концентрации хелатирующего агента, такого как ЭДТК в диапазоне 0,1 20 мМ, могут быть чрезвычайно эффективными для исключения или предупреждения загрязнения пищи грамм-отрицательными бактериями.

Пример 8. Титрование активности низина против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

Оптимальная концентрация хелатирующего агента, эффективность бактерицида в буфере Трис против грамм-отрицательных бактерий были значительными, как показано в табл. 8.

В тесте 2 (табл. 8) можно увидеть, что 0,3 мкг/мл низина с 1,0 мМ ЭДТК в 20 мМ Трис при pH 8,0 в присутствии 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) значительно понижают выживаемость S. typhimurium. Указанный бактерицид также активен против грамм-отрицательных бактерий, как чистый низин против грамм-положительных Streptococci.

Пример 9. Титрование активности низина против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

При оптимальной концентрации хелатирующего агента эффективность бактерицида против грамм-отрицательных бактерий в присутствии биологической ткани была продемонстрирована на S. typhimurius на мышце цыпленка и представлена в табл. 9.

Кубики мышцы цыпленка промыли хлорноватистокислым натрием и провидон иодом перед использованием. Для инокуляции ткани кубики мышцы цыпленка погрузили в суспензию 10⁸ клеток/мл S. typhimurium в 20 мМ Трис HCl, pH 8,0. Избыток влаги слили. Ткань поместили в содержащие достаточное количество буфера композиции на основе низина так, чтобы покрыть ткань, и инкубировали в течение 2 ч при 37^oC, после чего ткань перенесли в буфер Phage так, что раствор покрывал ткань.

Бактерии, оставшиеся в последующем растворе, собрали центрифугированием, промыли буфером Phage и объединили с бактериями, смытыми с ткани буфером Phage. Объединенные образцы (названные "неприсоединенные" клетки) многократно развели, и 100 мкл аликвоты поместили на пластину для определения количества выживших бактерий.

Пример 10. Активность низина, ЭДТК и метилпарабена против грамм-отрицательных бактерий (S. typhimurium)

Было показано, что бактерицид, содержащий низин, ЭДТК в комбинации с известным пищевым консервантом метилпарабеном, является исключительно эффективным против грамм-отрицательных бактерий, как представлено в табл. 10.

b) 50 мМ в ацетатный буфер, pH 5,0;

c) неприсоединенные клетки

Кубики мышцы цыпленка промыли хлорноватистокислым натрием и провидон иодом перед использованием. Для инокуляции ткани кубики мышцы цыпленка погрузили в суспензию 10⁸ клетки/мл S. typhimurium в 50 мМ натрий ацетатного буфера с pH 5,0.

Избыточную влагу спустили. Ткань поместили в достаточное количество буфера, содержащего композиции низина, так, чтобы раствор покрывал ткань, и инкубировали в течение 2 ч при 37^oC, после чего ткань перенесли в буфер Phage, который покрывал ткань. Оставшиеся в исследуемом растворе бактерии собрали центрифугированием, промыли буфером Phage и объединили с бактериями, намытыми из ткани буфером Phage. Объединенные образцы (назовем "неприсоединенные" клетки) многократно разбавили, и 100 мкл аликвоты поместили на пластины для определения количества выживших бактерий.

В тесте 1 (табл.10) показано, что метилпарабен в присутствии 10 мМ ЭДТК эффективен против S. typhimurium только в концентрации 1,0% В тесте 2 (табл. 10), однако, видно, что в присутствии 300 мкг/мл низина эффективность метилпарабана и низина против S. typhimurium значительно увеличилась.

Композиции, содержащие низин и ЭДТК, значительно улучшают использование пищевого консерванта метилпарабена. Кроме того, бактерициды могут способствовать значительному снижению концентраций или исключить потребность в таких общеизвестных, хотя мало описанных пищевых консервантах, как метилпарабен.

Пример 11. Активность низина и хелатирующего агента против грамм-положительных бактерий (Staphylococcus aureus)

Активация низина хелатирующим агентом зависит от pH среды. Данные, приведенные в табл. 11, подтверждают, что при pH 5,0 низин в большей степени является бактерицидным препаратом против S. acreus, чем при pH 8,0. При pH 5,0 ЭДТК не повышает активность низина против S. acreus и при концентрациях ЭДТК больше 10 мМ ЭДТК понижает бактерицидную активность низина. Однако бактерицидная активность низина, активированного с помощью ЭДТК при pH 8,0, значительно больше бактерицидной активности чистого низина или низина в сочетании с ЭДТК при pH 5,0.

Из данных табл. 11 видно, что

а) первоначальное количество живых 8,010⁶ клеток/мл.

Инкубирование проводили в 50 мМ натрий ацетатном буфере, pH 5,0 или 20 мМ Трис-HCl буфере, pH 8,0, при 37^oC.

Сообщалось, что бактерицидная активность чистого низина (см. Hurst) является максимальной при pH 5,0 или ниже, и данные табл. 11 подтверждают это. На основании этой информации считаем, что активирование бактерицидной активности низина с помощью ЭДТК против S. acreus будет также больше при меньшем pH.

Однако из табл. 11 можно видеть, что в противоположность ожиданиям (см. табл. 6) ЭДТК не увеличивает активность низина против грамм-положительных бактерий при pH 5,0. Однако понижение активности низина при высоких концентрациях ЭДТК также наблюдалось при pH 5,0. Так, активирование низина хелатирующим агентом существует только в диапазоне концентраций хелатирующего агента, в отношении грамм-положительных бактерий, зависит от pH с предпочтительным диапазоном pH больше 5,0.

Пример 12. Активность низина и хелатирующего агента против грамм-положительных бактерий

Воздействие ЭДТК на бактерицидную активность низина при pH 8,0 не ограничивается S. aureus важным патогенным для человека видом, но также наблюдается и в случае Streptococcus mutans, ответственных за зубной налет (табл.12А), патогенный вид пищевого происхождения (табл.12B) и в случае смешанной популяции подмышечных бактерий Coryneform, ответственных за запах тела (табл. 12C).

Из данных табл.12А видно, что

а) первоначальное количество живых 6,010⁶ клеток/мл

Инкубирование проводили в 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 при 37^oC.

Из данных табл. 12В следует, что

а) первоначальное количество живых 1,0x10⁶ клеток/мл

Инкубирование проводили в 20 мМ Трис-HCI, pH 8,0 при 37^oC.

Пример 13. Ускорение бактерицидной активности низина путем активирования хелатирующим агентом

Бактерицид, включающий низин с ЭДТК, действует значительно быстрее, как показано в таблице 13A. Суспензии грамм-положительных бактерий S. mutans при концентрации 10⁷ клеток/мл инкубировали в 20 мМ Трис буфере, pH 7,3 при температуре 37^oC при нескольких концентрациях низина, активированного 1 мМ ЭДТК. Суспензии инкубировали в течение различного времени от 0,5 до 60 мин с бактерицидом.

Бактерицидная эффективность бактерицидов измерялась путем определения процента выживших бактерий. Активированный ЭДТК низин при такой низкой концентрации, как 10 мкг/мл в этой композиции, способен снизить количество бактерий на 6 порядков за 1 мин.

Быстрое бактерицидное действие является необходимым для эффективной дезинфекции. Так, предсказывается, что указанные композиции будут эффективными бактерицидами, в частности, как показано в настоящей заявке, в качестве компонента для полоскания полости рта, полосканий, зубной пасты или других аналогичных зубных паст, порошков, активных против налета, образуемого C. mutans.

Активность низина, активированного ЭДТК, против грамм-отрицательных бактерий через 2 3 ч показана в примерах 1-7. Также наблюдается быстрый бактерицидный эффект низина, активированного ЭДТК, против грамм-отрицательных бактерий, и это показано данными в табл. 13B.

Как следует из данных табл. 13А,

а) контрольное количество жизнеспособных клеток 1,0 x 10⁷ клеток/мл

Инкубирование проводили в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,3 при 37^oC.

Как следует из данных табл. 13В,

а) начальное количество жизнеспособных клеток 1,0 x 10⁷ клеток/мл

Инкубирование проводили в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,3 при 37^oC.

Пример 14. Воздействие двухвалентных катионов на способность ЭДТК активировать активность низина

Двухвалентные катионы связывают ЭДТК и другие хелатирующие агенты, и можно было бы ожидать, что они нейтрализуют способность ЭДТК активировать низин. Однако, как видно из данных, приведенных в табл. 14, бактерицидная активность низина против S. mutans активируется 1 мМ ЭДТК даже в присутствии 1 мМ Ca²⁺ иона, и лишь при концентрации выше 3 мМ ионы Ca²⁺ подавляют способность ЭДТК активировать низин. Это особенно важно для полосканий полости рта, где концентрации ионов кальция существенные.

Из данных табл. 14 видно, что

Е) 1мМ Na₂ ЭДТК

а) первоначально жизнеспособное количество 1,0 x 10² клеток/мл

Инкубирование проводили в 10%-ной фетальной сыворотке при 37^oC.

Пример 15. Активность композиции на основе низина с ПАВ против грамм-положительных бактерий

Бактерицидную активность низина можно также значительно повысить путем введения одного ПАВ. Это наилучшим образом иллюстрируется при ограниченных концентрациях низина (0,2 мкг/мл), как показано в табл.15A. При концентрациях до 0,1% ПАВ пищевой марки монолаурин обладает малой бактерицидной активностью против Streptococcus agalactial в сложной молочной среде.

Низин при концентрация до 0,2 мкг/мл также не проявляет значительной активности в молоке. Однако композиция, в которой оба эти агента сочетаются, 0,1% монолаурина и 0,2 мкг/мл низина, очень активна против S. agalactial. Этот бактерицид более чем в 100 раз более активен, чем это можно ожидать для добавочного эффекта, и в 10000 раз более активен, чем каждый из компонентов отдельно. Таким образом, когда применение низина ограничивается его активностью, то можно ожидать, что бактерицид, включающий низин с ПАВ, будет более полезен.

Пример, когда использование низина ограничивается его имеющейся активностью, проиллюстрирован данными, приведенными в табл. 15B. Хотя низин, и в частности бактерицид, включающий низин и ЭДТК, является бактерицидом против L. monocytogenes, данные, приведенные в табл.15B, показывают, что в сложной среде, такой как молоко, имеющаяся активность низина против этого микроорганизма ограничена.

Однако бактерицид, включающий низин вместе с глицеридом, моноолеат, является эффективным в молоке против этого патогенного пищевого происхождения микроорганизма, даже если моноолеат сам по себе не обладает бактерицидной активностью против этого микроорганизма.

Из данных табл.15А видно, что

а) первоначально жизнеспособное количество 6,0 x 10⁷ клеток/мл.