гибридный рецепторотоксин s304 и фрагмент днк ns 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин s 304

Формула изобретения

1. Гибридный рецепторотоксин S 304, полученный путем экспрессии в бактериальной системе E.coli, состоящий из фрагмента дифтерийного токсина и фрагмента CD4 рецептора Т-лимфоцитов человека, имеющий первичную структуру I, приведенную в конце текста формулы и подавляющий цитопатическое действие вируса иммунодефицита человека первого типа in vitro.

2. Фрагмент ДНК NS 304, кодирующий гибридный рецепторотоксин S 304 и имеющий первичную структуру II.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и вирусологии и представляет собой гибридный полипептид рецепторотоксин, в котором токсическая часть представляет собой А-фрагмент и неполный B-фрагмент дифтерийного токсина (DT), а рецепторная часть N-концевой фрагмент CD4-рецептора Т-лимфоцитов человека. Полипептид проявляет антивирусную (вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)) активность в системе in vitro и является потенциальным терапевтическим агентом при синдроме приобретенного иммунодефицита, вызываемого ВИЧ. ВИЧ при попадании в организм человека поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Основным путем проникновения ВИЧ в клетку является взаимодействие гликопротеина оболочки вируса gp120 с CD4-рецептором. В этом взаимодействии ключевую роль играют первые два иммуноглобулинподобных домена CD4, расположенных на N-конце молекулы (первые 180 аминокислот) (Nature, 312, 159 161, 1988; 331, 82 84, 1988). На поверхности зараженной клетки экспрессируется gp120 ВИЧ. Показано, что различные растворимые рекомбинантные формы CD4-рецептора, связываясь с ВИЧ, ингибируют как процесс проникновения вируса в чувствительные клетки, так и вирусиндуцированное образование синцитий (Nature, 331, 76 78, 1988; 331, 78 81, 1988). Это предполагает, что различные рекомбинантные формы CD4-рецептора могут быть потенциальными антивирусными агентами при лечении ВИЧ-инфекции. Действие рецепторотоксина основано не только на конкурентном связывании ВИЧ, но и на направленном элиминировании зараженных клеток, так как на поверхности последних экспрессируется вирусный гликопротеин gp120. Например, было показано, что рецепторотоксин на основе CD4-рецептора и экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa блокирует развитие ВИЧ-инфекции in vitro и активен против клеток, экспрессирующих гликопротеины оболочки от различных ретровирусов иммунодефицита приматов (PNAS USA, 86, 9539 9543, 1989).

Дифтерийный токсин принадлежит к группе токсинов, способных инактивировать белоксинтезирующий аппарат эукариотической клетки. В DT каталитической активностью обладает N-концевая часть молекулы А-фрагмент (J. Biolog. Chem. 4265, 7331 7337, 1990).

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный гибридный полипептид S304, состоящий из полипептида продукта фрагмента гена дифтерийного токсина и полипептида продукта фрагмента гена CD4-рецептора, обладающий анти-ВИЧ активностью in vitro; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид S304.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение и экспрессия в Escherichia coli гибридного полипептида S304.

Гибридный полипептид синтезируется в бактериальной системе E. coli с использованием экспрессирующих плазмидных векторов. В качестве штаммов-продуцентов были использованы трансформированные экспрессирующими векторами производные штаммов TG1 и BL21(DE3). Внедрение плазмидной ДНК в клетки E. coli проводили путем их трансформации с использованием хлорида кальция (J. Mol. Biol. 166, 557 580, 1983).

Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей гибридный полипептид, была получена путем объединения в составе экспрессирующих векторов последовательностей ДНК, кодирующих фрагменты CD4-рецептора и дифтерийного токсина. Из Т-лимфоцитов периферической крови человека выделяли ДНК (Eur. J. Biochem. 36, 32, 1973), которую затем амплифицировали с помощью цепной полимеразной реакции (Meth. Enzymol. 155, 335, 1987) с использованием олигодезоксирибонуклеотидных зондов: 5"-GCGAGATCTAGTGGAACTGACCTG-3" и 5"-GCGGGATCCTCCAGCTGAGACAC-3" и после обработки эндонуклеазами рестрикции BgIII и BaMHI выделяли из 1% -ной легкоплавкой агарозы фрагмент ДНК, кодирующий участок CD4-рецептора. Аналогичный метод использовали для выделения фрагмента ДНК, кодирующего участок DT. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали аминофосфитным триэфирным методом в твердофазном варианте с использованием дезоксирибонуклеид-3"- О(-цианэтил-N, N-диизопропиламино)фосфитов (Nucleic Acids Res. 12, 4539, 1984). Определенная методом Сэнгера (PNAS USA, 474, 15463 15467, 1977) первичная структура ДНК, кодирующей гибридный полипептид S304, представлена на фиг. 1.

Приведенная на фиг. 1 последовательность соответствует следующей аминокислотной последовательности, приведенной на фиг. 2.

В гибридном полипептиде присутствуют, таким образом, фрагменты двух белков: дифтерийного токсина и CD4-рецептора. Дифтерийный токсин представлен полным A-фрагментом и B-фрагментом без 50 C-концевых аминокислотных остатков и имеет следующую первичную структуру, приведенную на фиг. 3.

Фрагмент CD4 с Val 14 по Glu 152 представляет собой следующую полипептидную последовательность, приведенную на фиг. 4.

Пример 2. Приготовление лизатов клеток.

Ночную культуру клеток E. coli разводят в 100 раз свежей средой LB и выращивают при постоянной аэрации при 30^oC. После достижения культурой оптической плотности 0,5 при длине волны 530 нм индуцируют экспрессию гибридных генов добавлением изопропилтиогалактозида до конечной концентрации 0,005% После индуцирующего воздействия культуру выращивают при 30^oC и постоянной аэрации в течение 90 мин. Затем клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин и лизируют путем обработки ультразвуком в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 8,0, 10 мМ EDTA и 2 мМ фенилметилсульфонилфторида.

Пример 3. Применение гибридного полипептида S304 в качестве ингибитора цитопатического действия вируса иммунодефицита человека в системе in vitro.

Степень ингибирования рекомбинантным рецепторотоксином цитопатического действия вируса иммунодефицита человека 1 типа определяют следующим образом. Сначала определяют токсичность бактериального лизата для линии клеток SEM (T-лимфоциты человека). Для этого суспензию клеток инкубируют на плашке с различными разведениями лизата в среде RPMI-1640. При этом исходная концентрация клеток составляет 0,5 млн./мл. Затем с использованием витального красителя (трепановой синий) проводят подсчет количества погибших и выживших клеток и выбирают такую концентрацию лизата, при которой нет отличия от клеточного контроля (КК клетки без лизата). При концентрации лизата 0,1 - 0,2 мг суммарного белка/мл не было отличий между опытом и КК ни в проценте погибших клеток (1 2%), ни в значении индекса пролиферации (около 2). Для определения антивирусной активности рекомбинантного рецепторотоксина клетки инкубируют в тех же условиях, добавляя бактериальный лизат, содержащий рецепторотоксин, до конечной концентрации 0,15 мг/мл и 1 ЦТД50 ВИЧ1 (цитотоксическая доза вируса для клеток линии SEM). В качестве контроля используют клеточный контроль (КК), вирусный контроль (ВК суспензия клеток SEM с вирусом без лизата) и контроль лизата (КЛ суспензия клеток SEM с вирусом с добавлением лизата бактерий E. coli, не экспрессирующих рекомбинантный рецепторотоксин, в концентрации 0,15 мг/мл). В контрольных лунках (ВК и КЛ) наблюдали более 30% погибших клеток, а в КК и опыте практически все клетки выжили (менее 1% погибших клеток). Таким образом, рекомбинантный рецепторотоксин практически полностью ингибирует цитопатическое действие вируса иммунодефицита человека in vitro.