способ проведения экстракорпоральной иммуносорбции

Формула изобретения

Способ проведения экстракорпоральной иммуносорбции путем пропускания крови через колонку с антигенсодержащими гранулами гидрогеля, отличающийся тем, что в гранулы включают частицы ферромагнитного материала, а колонку с гранулами помещают в устройство, создающее осевой и поперечный градиент магнитного поля.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к экстракорпоральным методам извлечения специфических антител из крови и других биологических жидкостей, и может применяться в ревматологии и биотехнологии.

Известен способ очистки крови от экзогенных и эндогенных токсинов с помощью иммуносорбентов. Иммуносорбенты представляют собой нерастворимые частицы, к которым физически или химически прикреплены молекулы вещества (антигена или специфических антител), имеющего сродство к удаляемому из крови биологически активному веществу. После пропускания крови через колонку с подобным сорбентом на последнем специфически сорбируются удаляемые из крови компоненты. Очищенная кровь возвращается обратно в организм больного.

В настоящее время в качестве матриц (нерастворимой основы для иммобилизации лигандов) при изготовлении иммуносорбентов применяют активированные угли, сефарозу, коллаген и другие носители. Активированные угли имеют высокую механическую прочность, хорошие перфузионные характеристики, но их применение связано с выраженным травмированием форменных элементов крови; сефароза не имеет недостатков активированных углей, однако стоимость данного носителя настолько высока, что невозможно рассчитывать на возможность его широкого клинического применения [1]

Наиболее близким к предложенному по принципу действия и достигаемому результату является проведение иммуносорбции с использованием в качестве носителей гидрогелей. Последние характеризуются высокой гемосовместимостью, низкой специфической емкостью и хорошей проницаемостью для высокомолекулярных веществ [1]

Недостатком указанного способа является высокое гидродинамическое сопротивление гидрогелей и плохие перфузионные характеристики.

Цель изобретения улучшения реологических и гемодинамических свойств гидрогелей.

Поставленная цель достигается путем включения частиц ферромагнитного материала в структуру гранулы гидрогеля, а колонка с гранулами помещается в устройство, создающее осевой и поперечный градиент магнитного поля.

Пример 1. Получение гранул гидрогеля.

В качестве гранул гидрогеля использовали полиакриламидные гранулы, содержащие нативную ДНК, полученные методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота. Внутрь гранул включались частицы ферромагнитного материала окиси железа, закиси железа или окиси-закиси железа. Размер получаемых гранул 10-100 мкм. Подробно технология получения гранул описана в авт. св. N 1797253.

Пример 2. Установка, создающая осевой и поперечный градиент магнитного поля.

В качестве установки, создающей градиент магнитного поля, использовалось оригинальное устройство, принципиальная схема которого приведена на чертеже. Магнитное поле, создаваемое установкой, принудительно перемещает гранулы вдоль и поперек тока биологических жидкостей, что способствует большому контакту сорбента с протекающей жидкостью и препятствует адгезии частиц друг с другом.

Пример 3. Сжимаемость гранул гидрогеля с использованием предложенного способа.

Через колонку с гранулами гидрогеля объемом 5 мл перфузировалась с помощью насоса "Microperpex" (LKB, Швеция) цельная кровь со скоростью 250 мл/ч. В опыте колонка с гранулами гидрогеля помещалась в устройство, создающее магнитное поле. В контроле использовалась та же колонка, но без использования магнитного поля.

На чертеже показана установка для проведения иммуносорбции в магнитном поле, поясняющая предлагаемый способ.

В экспериментах начальный объем гранул составил 5,0+0,02 мл, конечный объем без применения магнитного поля составил 3,62+0,049 мл (динамика достоверна p < 0.05), при применении вышеуказанного устройства: начальный объем 5,0+0,02, конечный 4,94+0,031 мл (динамика недостоверна, p > 0.05) (проведено 10 экспериментов).

Пример 4. Проверка утечки гранул за пределы экстракорпорального контура.

Использование магнитного поля позволило существенно снизить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура. Если гранулы применялись для иммуносорбции в обычной колонке, то при начальном весе гранул 4897 мг утечка сорбента составляла 265 + 24 мг вещества на колонку объемом 5 мл (динамика достоверна p < 0,05). Если гидрогель использовался в колонке, помещенной в оригинальное устройство, то утечка сорбента составляла 0,85 + 0,22 мг вещества (динамика недостоверна, p < 0,05) (проведено 10 экспериментов).

Пример 5. Исследование частоты тромбообразования в колонке с гранулами гидрогеля.

Через колонку с гранулами гидрогеля пропускали гепаринизированную кровь доноров в течение 1 ч. После окончания процедуры колонку отмывали 0,9% раствором NaCl и визуально оценивали наличие тромбов.

Частота тромбообразования в колонке с гранулами гидрогеля без использования магнитного поля составила 7 случаев из 20, причем в 3 из них тромбы препятствовали току крови. При проведении иммуносорбции в вышеуказанной установке 1 раз из 20 наблюдений были обнаружены микротромбы, которые не были препятствием для успешного завершения процедуры иммуносорбции (критерий хи-квадрат равен 16,88, p < 0.001).

Пример 6. Исследование эффективности сорбции антител с использованием предложенного способа и без него.

В экспериментах по проверке сорбционных свойств гранул использовались ДНК-содержащие гранулы гидрогеля. Через 1 мл гранул перфузировались 3 мл сыворотки крови больных системной красной волчанкой, имеющих указанные выше антитела, со скоростью 5 мл/ч. После отмывки колонки 0,9% раствором NaCl до значений экстинции в отмывной жидкости менее 0,05 на длине волны 280 нм проводилась элюция антител буфером глицин-HCl, pH 2,8. Элюат нейтрaлизовался до нормальных значений pH 1М раствором K₂HPO₄, после чего проводился диализ элюатов 18 ч при 4^oC против 0,9% раствора NaCl. Впоследствии в элюатах определялся уровень общего белка по Лоури (проведено 10 экспериментов).

Эксперименты показали, что использование установки для проведения иммуносорбции в магнитном поле позитивно влияет на эффективность сорбции. Если в обычных условиях сорбционная емкость составила 3,5+0,3 мг/мл сорбента, то в магнитном поле данный показатель был равен 4,845+0,24 мг/мл ИГАП (различия достоверны, p < 0,005).

Пример 7. Удаление антител к нативной ДНК из сыворотки крови экспериментальных животных в экспериментах in vivo.

Перед проведением экспериментов in vivo была проведена иммунизация 6 лабораторных животных (кроликов) дезоксирибонуклеиновой кислотой.

После стерилизации колонки этиловым спиртом под нембуталовым наркозом была проведена иммуносорбция антител к нативной ДНК с использованием указанных выше гранул.

Исследования показали, что колонка с ИГАП не тромбировалась в процессе процедуры иммуносорбции. Лишь 1 раз после процедуры в колонке были обнаружены микротромбы, которые не препятствовали нормальному току крови.

Сорбционная емкость ИГАП, определяемая после процедуры, была равна 4,36+0,13 мг/мл сорбента.

Взвешивание гранул показало отсутствие их утечки за пределы экстракорпорального контура за время сеанса; вес гранул составил до сорбции 5238+84, после нее 5197+63 (динамика недостоверна, p > 0,1).

Таким образом, эксперименты показали, что предложенный способ позволяет улучшить реологические свойства гидрогелевых иммуносорбентов: уменьшить сжимаемость последних и снизить их высокое гидродинамическое сопротивление, уменьшить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура, существенно снизить риск тромбообразования в колонке с сорбентом. За счет улучшения перфузионных характеристик сорбента, улучшения его контакта с кровью удалось увеличить эффективность иммуносорбции.

Предложенный способ был успешно осуществлен в экспериментах in vivo с использованием лабораторных животных.