(-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил-(1н)- пиримидин-2-он в кристаллических формах, способы их получения и фармацевтическая композиция

Формула изобретения

1. (-)-Цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он в кристаллических формах.

2. (-)-Цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он по п.1 в виде бипирамидальных кристаллов.

3. Кристаллическая форма по п.1 или 2, отличающаяся тем, что она имеет точку плавления выше 170^oС.

4. Кристаллическая форма по пп. 1 3, отличающаяся тем, что она имеет точку плавления 177 178^oС.

5. Кристаллическая форма по пп. 1 4, отличающаяся тем, что она имеет полосы поглощения в ИК-спектре при значениях 920 и 850 волновых чисел.

6. Кристаллическая форма по пп.1 5, отличающаяся тем, что она не имеет полосы поглощения в ИК-спектре при значении 1110 волнового числа.

7. Кристаллическая форма по пп. 1 6, отличающаяся тем, что она имеет эндотерму при начальной температуре 177 178^oС на ее кривой дифференциальной сканирующей калориметрии.

8. (-)-Цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он по п.1 в форме игловидных кристаллов.

9. Кристаллическая форма по п.1 или 8, отличающаяся тем, что она имеет точку плавления ниже примерно 130^oС.

10. Кристаллическая форма по пп.1, 8 или 9, отличающаяся тем, что она имеет точку плавления 124 127^oС.

11. Кристаллическая форма по п.1 или по любому из пп.8 11, отличающаяся тем, что она имеет эндотерму с начальной температурой 124 127^oС на ее кривой дифференциальной сканирующей калориметрии.

12. Кристаллическая форма по п.1 или любому из пп.8 11, отличающаяся тем, что она имеет полосу поглощения в ИК-спектре при значении примерно 1110 волнового числа.

13. Способ получения (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2 -она в кристаллической форме, отличающийся тем, что кристаллизуют соединение из водного раствора.

14. Способ получения (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2 -она в кристаллической форме, отличающийся тем, что проводят перекристаллизацию из неводной среды соединения (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2 -она.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что неводной средой является С₂ С₆-спирт.

16. Способ по п.14 или 15, отличающийся тем, что неводной средой является этанол или промышленный этанол, денатурированный метиловым спиртом.

17. Способ получения (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2 -она в виде бипирамидальных кристаллов, отличающийся тем, что проводят старение соединения в форме игловидных кристаллов в этаноле или промышленном этаноле, денатурированном метиловым спиртом, при повышенной температуре.

18. Фармацевтическая композиция, проявляющая антивирусную активность, содержащая активное вещество и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2 -она в кристаллической форме.

19. Композиция по п. 18, отличающаяся тем, что она находится в виде, пригодном для орального применения.

20. Композиция по п. 18 или 19, отличающаяся тем, что она находится в виде таблеток или капсул.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к аналогам нуклеозидов и их применению в медицине. Более конкретно изобретение относится к нуклеовидным аналогам 1,3-оксатиолана и к их применению для лечения вирусных инфекций.

Соединение формулы (I)



известно как ВСН-189 или NGPB-21 и было описано как обладающее противовирусной активностью, в частности против вирусов человеческого иммунодефицита (ВИЧ), причинных агентов СПИДа (5-я Противоспидовая конференция, Монреаль, Канада, 5-9 июня 1989 г. Abstracts T.C.O.I и M.C.P, 63; публикация европейской заявки на патент N 0382562). Соединение формулы (I) является рацемической смесью двух энантиомеров формул (I-1) и (I-2):



и было описано и испытано в форме рацемата. Единственным соединением, одобренным в настоящее время для лечения состояний, вызываемых ВИЧ, является 3"-азидо-3"-деокситимидин (AZT, зидовудин BW 509U). Однако это соединение имеет значительную склонность к побочным эффектам и, следовательно, или не может быть выведено у значительного числа пациентов. В результате сохраняется потребность в создании соединений, которые являются эффективными против ВИЧ, но имеющих значительно лучший терапевтический показатель.

В заявке EP N 0337713, кл. C 07 D 473/32, 1989 описаны фармацевтические композиции, проявляющие противовирусную активность.

Хотя энантиомеры соединения формулы (I) являются равно мощными против ВИЧ, (-)-энантиомер обладает значительно меньшей цитотоксичностью, чем другой энантиомер, и, следовательно, является предпочтительным соединением как антивирусный агент.

(-)-Энантиомер имеет химическое название (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он. Он имеет абсолютную стереохимию соединения формулы (I-1), которое имеет название (2R, цис)-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он. Это соединение теперь известно как ЗТС.

Предпочтительно ЗТС должен быть практически свободным от соответствующего (+)-энантиомера, т. е. присутствует не более примерно 5% мас./мас. (+)-энантиомера, предпочтительно не более примерно 2% в частности менее 1% мас./мас.

В международной заявке РСТ/GB 91/00706, публикация N WO 91/17159 описано получение ЗТС, это антивирусная активность и его применение в медицине. ЗТС описан и получен в WO 91/17159 в виде лиофильно высушенного порошка.

Теперь мы нашли, что ЗТС может быть получен в кристаллической форме и проявляет полиморфизм.

Таким образом, в первом аспекте изобретение обеспечивает ЗТС в кристаллической форме.

При кристаллизации из водного раствора ЗТС получают в форме кристаллов в виде игл (далее форма I). В этой форме кристаллы не являются удобными для фармацевтической рецептуры в твердых дозированных формах из-за их физических свойств, например плохих характеристик текучести. Теперь мы обнаружили, что в определенных условиях ЗТС может быть получен в виде практически бипирамидальных кристаллов (далее форма II). Кристаллы в виде формы II обладают улучшенными характеристиками текучести и, следовательно, являются предпочтительными при производстве твердых дозированных форм. Кроме того, кристаллы формы I являются менее стабильными полиморфными формами и некоторые операции на фармацевтической установке, такие как измельчение, могут вызвать превращение формы I в форму II, нежелательная характеристика для производства твердых дозированных форм.

ЗТС в виде бипирамидальных кристаллов имеет точку плавления выше примерно 170^oC, в частности 177-178^oC, когда чистое. ЗТС в виде иглоподобных кристаллов имеет точку плавления ниже примерно 124-127^oC в чистом виде.

ЗТС в форме II имеет характеристические полосы поглощения в инфракрасном (ИК) спектре, которые отсутствуют в ИК-спектре формы I. В частности, форма II имеет сильные полосы поглощения при 920 и 850 волновых числах. Далее характеристическая полоса формы I при 1110 волновых числах отсутствует в спектре формы II.

Форма II ЗТС, кроме того, показывает характеристическую эндотерму с началом при температуре 177-178^oC на ее кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Напротив, форма I показывает характеристическую эндотерму на кривой ее ДСК с началом при температуре 124-127^oC.

Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается ЗТС в форме игловидных кристаллов.

В другом аспекте обеспечивается ЗТС в виде бипирамидальных кристаллов.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивается ЗТС в кристаллической форме и имеющий точку плавления выше 170^oC, в частности 177-178^oC. В альтернативном аспекте обеспечивается ЗТС в кристаллической форме и имеющий на его кривой ДСК эндотерму с началом при температуре 177-178^oC.

В еще одном аспекте обеспечивается ЗТС в кристаллической форме и имеющий полосы поглощения при волновых числах примерно 920 и примерно 850 в его ИК-спектре. В частности, обеспечивается ЗТС, у которого в дополнение к полосам поглощения при этих волновых числах практически отсутствует полоса при волновых числах 1110.

ЗТС может быть получен из его рацемата путем разделения по любому способу, известному на данном уровне техники для разделения рацематов на составляющие их энантиомеры. В частности, ЗТС может быть получен из известного рацемата с помощью хиральной ВЭЖХ, с помощью энантиоселективного катаболизма, медиированного ферментом, при использовании подходящего фермента, такого как цитидиндеаминаза, или с помощью селективного ферментативного разложения подходящего производного с использованием 5"-нуклеотида. Подходящие способы получения ЗТС описаны в WO 91/17159.

ЗТС в виде игловидных кристаллов может быть получен при кристаллизации соединения из водного раствора или путем азеотропной перегонки с пропан-1-олом.

ЗТС в форме предпочтительных бипирамидальных кристаллов может быть получен путем перекристаллизации из неводной среды, в частности низшего (C_2-6) спирта, например этанола, ИМС (промышленного этилового спирта, денатурированного метиловым спиртом) или пропан-1-ола. В предпочтительном варианте ЗТС в бипирамидальной форме может быть получен из ЗТС в виде игл путем старения последнего в промышленном этиловом спирте, денатурированном метиловым спиртом (ИМС) или этаноле при повышенной температуре (30-70^oС, предпочтительно около 50^oC) в течение подходящего периода времени (например, 0,5-3 часа, особенно около 1 часа или более).

Альтернативно ЗТС в бипирамидальной форме может быть получен при нагревании соединения в форме игл при температуре выше точки его плавления 124-127^oC, в частности выше примерно 170^oC, например выше примерно 177-178^oC, и предоставлении расплаву возможности остыть.

При другой альтернативе ЗТС в бипирамидальной форме может быть получен при дроблении или растирании соединения в форме игловидных кристаллов.

Предпочтительно ЗТС в форме бипирамидальных кристаллов практически не содержит игловидных кристаллов. Когда эти кристаллы получают перекристаллизацией или старением в жидкой среде, соединение обычно может быть получено полностью свободным от игловидных кристаллов.

ЗТС в кристаллической форме может быть использован в качестве противовирусного агента, как описано в WO 91-17159, которая приведена здесь в качестве уровня техники.

ЗТС в кристаллической форме может быть сформулирован в виде фармацевтической композиции для использования в качестве противовирусного агента, как описано в WO 91/17159.

На фиг.1 показан ЗТС в виде игловидных кристаллов (форма I); на фиг.2 - ЗТС в виде кристаллов бипирамидальной формы (форма II); на фиг.3 ИК-спектр кристаллов формы I; на фиг.4 приведен ИК-спектр формы II; на фиг.5 приведена ДСК термограмма кристаллов формы I; на фиг.6 приведена ДСК термограмма кристаллов формы II.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не предназначены для его ограничения. Все температуры приведены в ^oC.

Промежуточный продукт 1. 5-Метокси-1,3-оксатиолан-2-метанол, бензоат.

Раствор 1,6 г хлорида цинка в 15 мл горячего метанола прибавляют при перемешивании к раствору 34,2 г диметилацеталя меркаптоацетальдегида и 48,3 г бензоилоксиацетальдегида в 1300 мл толуола, который затем кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 50 минут. Концентрируют охлажденную смесь, разбавляют толуолом, затем фильтруют через кизельгур. Объединенные фильтраты и толуол промывают два раза водным насыщенным раствором бикарбоната натрия и рассолом, сушат над сульфатом магния, затем выпаривают до масла, которое подвергают хроматографии на колонке с силикагелем (2 кг, Мерк 9385), элюируя хлороформом, получают целевой продукт в виде масла (45,1 г) из смеси аномеров (примерно 1:1).

1Н ЯМР (ДМСО-d₆) 3,1-3,3 (4Н), 3,42 (6Н), 4,4-4,6 (4Н), 5,41 (1Н), 5,46 (1Н), 5,54 (1Н), 5,63 (1Н), 7,46 (4Н), 7,58 (2Н), 8,07 (4Н); l_макс (CHBr₃) 1717,6 см^-1.

Промежуточный продукт 2. ()-цис-1-(2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2,4-дион.

Кипятят с обратным холодильником смесь тонко измельченных 9,62 г урацила, 50 мл гексаметилдисилазана и 30 мг сульфата аммония в атмосфере азота до тех пор, пока не получат прозрачный раствор. Его охлаждают и затем выпаривают до бесцветного масла, которое растворяют в атмосфере азота в 100 мл ацетонитрила. Раствор прибавляют к перемешиваемому охлажденному льдом раствору 19,43 г 5-метокси-1,3-оксатиола-2-метанола, бензоата (промежуточного продукта 1) в 600 мл ацетонитрила и прибавляют 14,7 мл триметилсилилтрифторметансульфоната. Убирают баню со льдом и раствор кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 45 минут. После охлаждения и выпаривания остаток очищают хроматографией на колонке с 1 кг силикагеля (Мерк 9385), элюируя хлороформом/метанолом 9:1. Соответствующие фракции охлаждают и выпаривают, получают сырой остаток. Его подвергают фракционной кристаллизации из минимального количества горячего метанола (примерно 1200 мл), получают 6,32 г целевого продукта в виде белых кристаллов.

1Н ЯМР (ДМСО-d₆) 11,36 (1Н, шир.с), 7,50-8,000 (6Н, м), 6,20 (1Н, т), 5,46 (2Н, м), 4,62 (2Н, м), 3,48 (1Н, м), 3,25 (1Н, м).

Промежуточный продукт 3. ()-(цис)-4-амино-1-(2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он.

Способ (а).

Перемешивают суспензию 20,705 г цитозина и нескольких миллиграмм сульфата аммония в 110 мл гексаметилдисилазана и кипятят с обратным холодильником 2,5 часа в атмосфере азота. Удаляют растворитель выпариванием и растворяют твердый остаток в 350 мл сухого ацетонитрила. Этот раствор переносят, используя технику гибкой иглы, в перемешиваемый охлаждаемый льдом раствор 43,57 г 5-метокси-1,3-оксатиолан-2-метанола, бензоата (промежуточного продукта 1) в 650 мл ацетонитрила в атмосфере азота. Прибавляют 33 мл триметилсилилтрифторметансульфоната, раствору дают нагреться до комнатной температуры (1,5 часа), а затем всю ночь кипятят с обратным холодильником. Оставшуюся смесь концентрируют, разбавляют 500 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, затем экстрагируют 3 х 500 мл этилацетата. Объединенные экстракты промывают 2 х 250 мл воды и 250 мл рассола, сушат над сульфатом магния, затем выпаривают до пены, которую хроматографируют на колонке с 600 г силикагеля (Мерк 7734), элюируя смесями этилацетатметанола, получают смесь аномеров (примерно 1:1 31,59 г). Смесь кристаллизуют из 45 мл воды и 9,0 мл этанола, получают 10,23 г твердого продукта, который перекристаллизовывают из 120 мл этанола и 30 мл воды, получают целевой продукт в виде 9,26 г твердого продукта; l_макс (MeOH) 229,4 мм (E^1% 610) 272,4 мм (E^1% 1 см 1 см 293);

1Н-ЯМР (ДМСО-d₆) 3,13 (1Н), 3,50 (1Н), 4,07 (2Н), 5,52 (1Н), 5,66 (1Н), 6,28 (1Н), 7,22 (2Н), 7,56 (2Н), 7,72 (2Н), 8,10 (2Н).

Способ (б).

Прибавляют 7,0 мл оксихлорида фосфора по каплям к перемешиваемой при охлаждении льдом суспензии 11,65 г 1,2,4-триазола в 120 мл ацетонитрила, затем прибавляют по каплям 22,7 мл триэтиламина, поддерживая внутреннюю температуру ниже 15^oC. Через 10 минут медленно прибавляют раствор 6,28 г ()-(цис)-1-(2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2,4-диона (промежуточного продукта 2) в 330 мл ацетонитрила. Затем продолжают всю ночь перемешивать при комнатной температуре. Смесь охлаждают на ледяной бане и медленно прибавляют 30 мл триэтиламина, затем 21 мл воды. Полученный раствор выпаривают и распределяют остаток между 400 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 3 х 200 мл хлороформа. Объединенные хлороформные экстракты сушат над сульфатом магния, фильтрую и выпаривают, получают 9,7 г сырого остатка. Остаток растворяют в 240 мл диоксана-1,4 и прибавляют концентрированный водный раствор аммиака (уд.масса 0,880, 50 мл). Через 1,5 часа раствор выпаривают и растворяют остаток в метаноле. Это вызывает осаждение твердого продукта, который отфильтровывают. Маточник очищают хроматографией на колонке с силикагелем (600 г, Мерк 9385). Соответствующие фракции объединяют и выпаривают, получают целевое соединение в виде 2,18 г желтовато-коричневого твердого продукта, идентичного полученному в способе (а).

Промежуточный продукт 4. ()-(цис)-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он.

Перемешивают суспензию 8,19 г (цис)-4-амино-1-(2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она (промежуточный продукт 3) и 8,24 г смолы Амберлит ИРА-400 (OH) в 250 мл метанола и кипятят с обратным холодильником 1,25 часа. Отфильтровывают твердые продукты, затем промывают метанолом. Объединенные фильтраты выпаривают. Остаток тщательно растирают с 80 мл этилацетата. Полученный твердый продукт собирают фильтрованием, получают 5,09 г целевого продукта.

1Н ЯМР (ДМСО-d₆) d 3,04 (1Н), 3,40 (1Н), 3,73 (2Н), 5,18 (1Н), 5,29 (1Н), 5,73 (1Н), 6,21 (1Н), 7,19 (2Н), 7,81 (1Н).

Промежуточный продукт 5. (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-/1Н/-пиримидин-2-он.

(i) Три колбы емкостью 50 мл с питательным бульоном (Оксоид Лтд) инокулируют петлей каждый из Escherichia coli (АТСС 23848), соскобленной с Питательной Агаровой пластины. Колбы инкубируют в течение ночи при 37^oC при встряхивании при 250 об/мин, а затем каждую колбу используют для инокуляции 41 СДД среды (глютаминовая кислота, 3 г/л; MgSO₄, 0,2 г/л; K₂SI₄, 2,5 г/л; NaCl, 2,3 г/л; Na₂HPO₄2H₂O, 1,1 г/л; NaH₂PO₄2H₂O, 0,6 г/л; цитидин, 1,2 г/л) в семилитровом ферментере. Культуры ферментируют при 750 об/мин, 37^oC и аэрации 41 мин. После роста в течение 24 часов клетки собирают центрифугированием (5000 g, 30 минут), получают 72 г влажной массы. Шарик клеток повторно суспендируют в 300 мл 20 мМ Трис HCl буфера (pH 7,5) и разрывают озвучиванием (4 х 45 с). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием (30 000 g, 30 минут) и осаждают белок в надосадочной жидкости при добавлении сульфата аммония до 75% насыщения. Осадок собирают центрифугированием (30 000 g, 30 минут), шарик повторно суспендируют в 25 мл HEPES буфера (100 мМ, pH 7,0), содержащего сульфат аммония (насыщение 75%). Готовят раствор фермента при центрифугировании в течение 30 минут при 12 000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают и шарик растворяют в Трис HCl буфере (pH 7,0: 100 мМ) до первоначального объема.

(ii) Растворяют 115 мг промежуточного продукта 4 в 100 мл воды и перемешивают. Прибавляют 0,5 мл раствора фермента и смесь выдерживают при постоянном pH с помощью непрерывного добавления HCl (25 мМ). Конверсию контролируют с помощью хиральной ВЭЖХ, которая показывает, что (+)-энантиомер субстрата предпочтительно деаминирован. Через 22 часа (+)-энантиомер субстрата (время удерживания 12,5 мин) был полностью удален, устанавливают pH раствора, равным 10,5, путем добавления конц. гидроксида натрия.

Полученный выше раствор элюируют через колонку с QAE Сефадекс (A25; фармасиа; 30X 1,6 см), предварительно уравновешенную при pH 11. Колонку промывают 200 мл воды, а затем 0,1 М HCl. Собирают фракции по 40 мл и анализируют ВЭЖХ с обратной фазой. Объединяют фракции 5-13, содержащие (-)-энатиомер субстрата, и устанавливают pH 7,5 с помощью HCl. Устанавливают pH фракции 47, содержащей деаминированный продукт, равным 7,5, с помощью разбавленного гидроксида натрия. Анализ с помощью хиральной ВЭЖХ показал, что этот материал представляет собой смесь, состоящую из одного энантиомера (время удерживания 10,2 мин) в качестве основного компонента с другим энантиомером (время удерживания 8,5 мин) в качестве незначительного компонента (например, примерно 90%).

(iii) Повторяют описанную выше стадию (ii) в большом масштабе. Инкубируют 363 мг соединения примера 1 в 250 мл воды с 0,5 мл раствора фермента, приготовленного, как на стадии (i). Добавляют дополнительные аликвоты 0,5 мл фермента через 18 и 47 часов. Реакционную смесь перемешивают 70 часов, затем оставляют стоять еще 64 часа. Анализ с помощью хиральной ВЭЖХ показывает, что (+)-энантиомер субстрата полностью деаминирован, и устанавливают pH полученного раствора, равным 10,5, с помощью гидроксида натрия.

Описанный выше раствор загружают в такую же QAE колонку и элюируют, как на стадии (i). Объединяют фракции 2-6, содержащие смесь остаточного субстрата и деаминированного продукта. Фракции 7-13, содержащие остаточный субстрат (-)-энантиомер, объединяют и устанавливают pH 7,5. Фракции 25-26, содержащие деаминированный продукт, объединяют и нейтрализуют.

Фракции 2-6 выше повторно элюируют через такую же QAE колонку. Фракции 3-11 из этой второй колонки содержат непрореагировавший субстрат (-)-энантиомер. Фракция 70 содержит деаминированный продукт.

(iv) Объединяют фракции разделенного субстрата со стадии (ii) и (iii) и устанавливают pH 7,5. Этот раствор элюируют через колонку ХАД-16 (40 х 2,4 см), залитую водой. Колонку промывают водой, а затем элюируют ацетоном: водой (1: 4 объем/объем). Объединяют фракции, содержащие целевой (-)-энантиомер, и сушат с вымораживанием, получают 190 мг белого порошка.

Использованные выше методы ВЭЖХ являются следующими:

1. Аналитическая ВЭЖХ с обратимой фазой.

Колонка: основной патрон Сферисорб ODS (5 uM) 150 х 4,6 мм

Элюент: дигидрофосфат аммония (50 мМ)+5% MeCN

Скорость потока: 1,5 мл/мин

Детекция: УФ, 270 нм

Время удерживания: ВСН 189 5,5 мин

деаминированный ВСН-189 8,1 мин

2. Хиральная аналитическая ВЭЖХ.

Колонка: Циклобонд 1 ацетил 250 х 4,6 мм

Элюент: 0,2% триэтиламмонийацетат (pH 7,2)

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Детекция: УФ, 270 нм

Время удерживания: ВСН 189 11,0 и 12,5 мин

деаминированный ВСН 189 8,5 и 10,2 мин

(Биопревращение затем контролировалось по потере пика при 12,5 мин и накоплении продукта при 10,2 мин).

Пример 1. Суспензию 64,8 г промежуточного продукта 5 в 200 мл воды нагревают до 45^oC для получения раствора. Раствор охлаждают до 30^oC.

Продукт кристаллизуется в виде неперемешиваемой массы. Его разбивают и перемешивают суспензию при примерно 10^oC в течение 1 часа.

Продукт выделяют фильтрацией и промывают этанолом (ИМС, 2 х 30 мл, затем сушат в вакууме при 45^oC в течение 24 часов, получают ЗТС в виде формы 1 (тонкие игловидные кристаллы).

Соединение имеет ИК-спектр и ДСК термограмму, идентичные фиг.3 и 5 соответственно.

Пример 2. Суспензию 10,0 г соединения примера 1 в промышленном этаноле, денатурированном метиловым спиртом (ИМС, 200 мл, 20 объемов), кипятят с обратным холодильником для получения прозрачного раствора. Раствор фильтрую горячим и фильтрат разгоняют при атмосферном давлении до тех пор, пока не останется 100 мл (10 объемов) раствора. Раствор засевают аутентичным материалом и дают ему остыть от 80^oС до 25^oС в течение 1 часа. Кристаллизация начинается при 79^oC. Суспензию перемешивают 1 час при 15^oC. Продукт выделяют фильтрацией и промывают ИМС (10 мл, 1 объем). Сушка в вакууме при 50^oС дает целевое соединение в виде агрегатов бипирамид (8,42 г), т.пл. 179-181^oС (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-2,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-она.

В анализе найдено, C 41,9; H 4,85; N 18,35.

Для C₈H₁₁N₃O₃S требуется, C 41,9; H 4,8; N 18,3.

Соединение имеет ИК-спектр и ДСК термограмму, идентичные фиг.4 и 6 соответственно.

Пример 3. Медленно перемешивают суспензию 20,0 г продукта примера 1 в 100 мл (5 объемах) промышленного этанол, денатурированного метиловым спиртом (ИМС), при 50^oС в течение 1 часа.

Удаляют маленький образец (примерно 100 мг), сушат в вакууме при 50^oC и исследуют под микроскопом и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

Образец представляет собой 100% формы II (бипирамидальная). Суспензию перемешивают при 50^oС еще 2 часа и извлекают образец. Микроскопия не показывает изменений. Суспензию перемешивают при 50^oС в течение 22 часов, затем охлаждают до 20^oС и перемешивают 1 час. Суспензию фильтруют, продукт промывают 20 мл (1 объемом) ИМС и сушат в вакууме, получают 17,13 г белого кристаллического продукта (-)-цис-4-амино-1-(2-оксиметил-2,3-оксатиолан-5-ил)-(1Н-пиримидин-2-она, т.пл. 180-181^oС.

В анализе найдено, C 41,85; H 4,85; N 18,3.

Для C₈H₁₁N₃O₃S требуется, C 41,9; H 4,8; N 18,3.

Продукт имеет ИК-спектр и ДСК термограмму, идентичные приведенным на фиг.4 и 6 соответственно.

Пример 4. Данные рентгеновской кристаллографии для формы II.

Данные для кристалла:

C₈H₁₁N₃O₃S, M 229,26

Тетрагональ, а в 8,749 (3), с 26,523(0)А, V 2030/2/А³ (путем обработки по методу наименьших квадратов углов на диффрактометре для 14 автоматически центрированных отражений, I 1,54184А).

Пространственная группа P4₃2₁2 (N 96), Z 8, D_с 1,50 г/см^-3.

F(000) 960, м (Cu Ka) 27,5 см^-1.

Размеры данных кристалла 0,48 х 0,32 х 0,30 мм.

Единичные кристаллы формы II (бесцветные бипирамиды) были исследованы рентгеновской диффракцией. Было измерено всего 1651 отражение /3<2J<115) на диффрактометре Сименс R³ м/V с монохроматизированным Cu-Ka излучением и использованием 2J/W разверток. Структура была разрешена прямыми методами и анизотропно уточнены неводородные атомы. Атомы водорода, присоединенные к углероду, были идеализированы (C-H 0,96A) и направлены на их родственные атомы углерода. Три водорода на -NH₂ и -OH-группах были локализованы по различию Фурье-спектров. Все атомы водорода были уточнены изотропно. Уточнение конвергенции дало R 0,068, R_w 0,069, + 0,005(F)². Максимальная остаточная плотность электронов равна 0,45 eA^-3. Абсолютная хиральность была подтверждена при использовании теста Роджерса (h 0,99(9)).

Пример 5. Фармацевтические рецептуры.

а) Таблетки 100 мг

Ингредиенты для таблетки, мг:

ЗТС (форма II) 100,0

Микрокристаллическая целлюлоза НФ 189,5

Натрий крахмал гликолят НФ 9,0

Стеарат магния НФ 1,5

Всего 300,0

Просеивают ЗТС (форма II), микрокристаллическую целлюлозу и натрий крахмал гликолят и смешивают в У-смесителе в течение примерно 15 минут. Затем прибавляют просеянный стеарат магния и продолжают перемешивание еще 2 минуты.

Смесь прессуют на стандартном таблетирующем оборудовании, а затем покрывают пленкой из водной суспензии серого Опадри для получения эстетически приемлемых таблеток.

б) Таблетки 300 мг

Ингредиенты для таблеток, мг:

ЗТС (форма II) 100,0

Микрокристаллическая целлюлоза НФ 179,0

Натрий крахмал гликолят НФ 18,0

Стеарат магния НФ 1,5

Всего 600,0

Таблетки получают, как описано в (а).