рекомбинантный интерлейкин 2 человека
Классы МПК: | C07K14/55 ИЛ-2 C07K1/14 экстракция; разделение; очистка C07K1/20 распределительная, обратнофазная или гидрофобновзаимодействующая хроматография C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона |
Автор(ы): | Даниель Ландо[FR], Филипп Риберон[FR], Пьер Ив Абекассис[FR] |
Патентообладатель(и): | Руссель-Юклаф (FR) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1992-01-08 публикация патента:
20.02.1998 |
Использование: медицина, научно-исследовательская практика. Сущность изобретения: из "тел включения", образующихся в результате экспрессии в бактериальных клетках рекомбинантного вектора, содержащего нативный ген ИЛ2 человека, путем солюбилизации в восстанавливающей среде с хаотропным агентом и последующей очистки при помощи осаждения, высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (ОФ-ВЭЖХ) и использованием кислого элюанта, разведения ИЛ2-содержащей фракции кислой средой и повторной ОФ-ВЭЖХ в кислой среде получен рекомбинатный ИЛ2 человека с аминокислотной последовательностью природной формы, но содержащий в положениях 58, 105 и 125 восстановленные цистеиновые остатки и обладающий при этом удельной активностью по меньшей мере 0,5
107 E/мг. 1 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
Формула изобретения
1. Рекомбинантный интерлейкин 2 (ИЛ 2) человека, полученный из гранул продукта экспрессии бактериальных клеток после трансформации их вектором, содержащим нативный ген ИЛ 2 человека, путем солюбилизации в восстанавливающей среде с хаотропным агентом и последующей очистки при помощи осаждения, высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (ОФ-ВЭЖХ) и использованием кислого элюанта, разведения ИЛ 2-содержащей фракции кислой средой и повторной ОФ-ВЭЖХ в кислой среде, включающий цистеины в положениях 58, 103 и 125 в восстановленной форме, имеющей мол. м. около 15 кД и аминокислотную последовательность Х-Ала-Про-Тре-Сер-Сер Сер-Тре-Лиз-Лиз-Тре-Глн -Лей-Гли-Лей-Глу-Гис-Лей-Лей-Лей-Асп-Лей-Глн-Мет-Иле-Мет-Лей -Тре-Фен-Лиз-Фен-Тир-Мет-Про-Лиз-Лиз-Ала-Тре-Глу-Лей-Лиз-Гис -Лей-Глн-Гис-Лей-Глу-Глу-Глу-Лей-Лиз-Про-Лей-Глу-Глу-Вал -Лей-Асн-Лей-Ала-Глн-Сер-Лиз-Асн-Фен-Гис-Лей Арг-Про-Арг-Асп -Лей-Иле-Сер-Асн-Иле-Асн-Вал-Иле-Вал-Лей-Глу-Лей-Лиз-Глу-Сер-Глу-Тре -Тре-Фен-Мет-Цис-Глу-Тир-Ала-Асп-Глу-Тре-Ала-Тре-Иле-Вал -Глу-Фен-Лей-Асн-Арг-Трп-Глн-Сер-Иле-Иле-Сер-Тре-Лей-Тре или аналогичную последовательность, которая содержит в положениях, отличных от 58, 105 и 125, аминокислотные замены делеции или вставки, не влияющие на биологическую активность, где Х является метионином или водородом, и обладающий митогенной, пролиферативной, макрофагстимулирующей и индуцирующей цитотоксичность моноядерных клеток активностями нативного ИЛ-2 человека. 2. Интерлейкин 2 по п. 1, отличающийся тем, что проявляет специфическую активность по крайней мере 0,5![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
Описание изобретения к патенту
Данное изобретение касается биологически активного негликозилированного рекомбинантного человеческого интерлецкина-2 (называемого р-чИЛ2) в восстановленном виде. Натуральный человеческий ИЛ2, которым является лимфокин, стимулирующий размножение активированных клеток Т, имеет три цистеина, находящихся в положениях 58, 105 и 125 последовательности аминокислот протеина. Цистеины в положениях 58 и 105 соединены между собой дисульфидным мостиком, а цистеин в положении 125 имеет свободную сульфгидрильную группировку (Robb, R.J и сотр. Proc. Natl. Acad. Sci USA. (1984) 81-6486-6490). Способы получения человеческого ИЛ2 или его производных путем технологии рекомбинантного ДНК уже описаны. Например, Taniguchi, T и сотр. Nature (1983) 302 305-310 и Devos, R и сотр. Nucleic Acids Research (1983) 11 4307-4323, описывают клонирование гена человеческого ИЛ2 и его экспрессию в микроорганизмах, а Ju, C и сотр. J. Brol. Chem (1987) 262 5723-5731 получили экспрессию рекомбинантных производных ИЛ2. С другой стороны, известно, что когда ИЛ2 накапливается в микроорганизме в виде нерастворимых гранул, то он находится в восстановленной форме, содержащей 3 тиольных группы, и лишен активности (заявка на японский патент Я6 1257931). Поэтому считалось, что для того, чтобы получить активный ИЛ2, надо было прибегнуть к окислению восстановленного протеина, находящегося в гранулах. Для этого после растворения протеина в денатурирующей среде образование дисульфидного мостика 58-105, которое требуется для ренатурации, осуществляли в контролируемой окисляющей среде. Описаны различные способы окисления, такие как окисление только кислородом (самоокисление воздухом) или в присутствии ионов двухвалентной меди, или окисление слабым окислителем, таким как тиол, или же окисление смесью тиол - дисульфид (Tsuji, T. и сотр. Biochemistry (1987) 26 3129-3134). После окислительной ренатурации необходимо проводить очистку хроматографией для удаления продуктов окисления, соответствующих образованию изомерных внутримолекулярных мостиков 58-125 и 105-125, а также межмолекулярных мостиков, неактивность которых была доказана экспериментом и которые могут быть разделены хроматографией с обратной фазой согласно Wang. A и сотр. Science (1984) 224 1431-1433 или Browing J.L и сотр. Anal Biochem (1986) 155 123-128. Получение окисленного гомогенного рекомбинатного ИЛ2, имеющего подходящую биологическую активность, исходя из протеина, накопленного в виде гранул, выдвигает технические проблемы в независимости от употребляемого способа, так как оно требует нескольких стадий очистки, что проводит к понижению выхода целевого продукта. Заявителем разработан новый интерлейкин-2 человека, для получения которого не требуется стадии повторного окисления. Таким образом, изобретение касается получения негликозилированного рекомбинантного человеческого интерлейкина 2, имеющего, с одной стороны, следующую последовательность аминокислот:![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-2t.gif)
а также аллели и производные этой последовательности, где X - метионин или атом водорода и где три цистеина в положении 58, 105 и 125 находятся в восстановленном виде, а с другой стороны, проявляющего биологическую активность, сравнимую с активностью окисленного ИЛ2 с той же последовательностью и содержащего дисульфидный мостик в положении 58-105. Аллели и производные включают последовательности, модифицированные заменой, делецией или вставкой одной или нескольких аминокислот, других чем цистеины 58, 105, 125, таким образом, эти продукты сохраняют биологическую активность, характерную для восстановленного ИЛ2. Осуществление таких модификаций хорошо известно в технологии рекомбинантной ДНК, например, методами направленного мутагенеза, которые перечислены Lather, R.F и Lecog, J.P в журнале Genetic Engineering Acad Press (1983) 31-50 или Smith, M и G.Mam.S Genetic Engineering Principles and Methods Plenum Press (1981) 31-32. Под восстановленной формой подразумевают, что остатки цистеинов, которые принадлежат ИЛ2, содержат свободную сульфгидрильную группировку, наличие которой определяется, например, спектрофотометрически с дитиодипиридином в качестве тиольного реактива. Биологическая активность восстановленной формы, полученной по изобретению, определяется сравнительно с соответствующей окисленной формой, содержащей дисульфидный мостик 58-105, путем измерения размножения лейкемических клеточных линий СТЛЛ-2 мышей, зависимых от ИЛ2, при помощи колориметрического теста с солью тетразолия (Mossmann. T.J.Immunol Meth. (1983) 65 55-63). Изобретение относится к способу получения негликозилированного рекомбинантного ИЛ2 человека, имеющего, с одной стороны, следующую последовательность аминокислот:
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-3t.gif)
а также аллели или производные этой последовательности, где X - метионин или атом водорода и три цистеина которой в положении 58, 105 и 125 находятся в восстановленной форме, а с другой стороны, проявляющего биологическую активность по меньшей мере 0,5
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-4t.gif)
где X - метионин или атом водорода и три цистеина которой в положении 58, 105 и 125 находятся в восстановленной форме, и проявляющего биологическую активность, сравнимую с активностью природного ИЛ2 человека. Под сравнимой активностью подразумевают такую же специфическую активность, что у природного ИЛ2, выделенного из лейкемических клеток Jurkat, т.е. 1,3
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-5t.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-6t.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-7t.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-8t.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/2105011-9t.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/177.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/177.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105011/177.gif)
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
Электрофорез SDS PAGE ведется на геле с двумя фазами /гель концентрации и гель миграции, соответственно с 5% и 15% акриламида/, содержащем 10% SDS. Образец предварительно нагревается в течение 2 мин при 100oC в буферном растворе, содержащим 3% SDS и 5% меркаптоэтанола. Миграция с буферным раствором, содержащим 1% SDS, дает окраску серебром, которая проявляет одну полосу, соответствующую чистоте выше 99% на осадок в 2 мкг (фиг. 6). 2) Молекулярный вес, определяемый электрофорезом
В восстановительной среде определяют кажущийся МВ, составляющий около 15 кДа, который соответствует вычисленному МВ 15420 (фиг. 5). 3) Аминокислотный состав
Образец, содержащий 25 мкг восстановленного p-ИЛ2 человека согласно изобретению в 0,5 мл воды, вводят в стеклянную трубку для гидролиза, в которую прибавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты, содержащей 31,7% ТФУ и 4,8% тиогликолевой кислоты. Трубку запаивают в вакууме, а затем ведут гидролиз при 155oC в течение 40 мин. Продукт гидролиза затем упаривается досуха под уменьшенным давлением. Остаток растворяют в 0,7 мл цитратного буферного раствора с pH = 3, а затем анализируют аминокислоты на колонке Interaction AA 511 (0,46 x 15 см) при помощи градиента pH (от 3 до 5) и хлорида натрия (от 0 до 70 г/л) в буферном растворе цитрата, при 60oC, с расходом 0,5 мл/мин и с детекцией путем флуоресценции после отвода с ортофталальгидом на выходе из колонки. Результаты даны в табл. 1. Значения являются средними числами, полученными для 2 гидролизов (повторенных) и 2 хроматограмм, соответственно повторенных. Состав соответствует составу нативного ИЛ2, содержащего дополнительный N-концевой метионин. 4) N-концевая аминокислотная последовательность
N-концевая последовательность идентифицирована методом микропоследовательностей, используя автоматический способ деградации Эдмана. Анализ 15 мкг восстановленного биологически активного p-ИЛ2 человека согласно изобретению на микропоследователе с газовой фазой Applied Biosystems 470А, спаренном с ВЭЖХ 120А, позволил идентифицировать следующие аминокислоты ФТГ (фенилтиогидантоины), приведенные в табл. 2. Последовательно 20 N-концевых остатков находится в соответствии с теоретическим порядком последовательностей нативного ИЛ2. Обнаружено около 10% ИЛ2 без метионина. 5) Пептидная карта, полученная с бромистым цианидом
700 мг восстановленного ИЛ2 согласно изобретению (около 53 нмоль) растворяют в 4 мл 70%-ной муравьиной кислоты и прибавляют 5,6 мг бромистого цианида. Раствор перемешивается одну ночь при комнатной температуре, разбавляют водой, а затем подвергают лиофилизации. Реакционную смесь анализируют при помощи ОФ-ВЭЖХ на колонке Bondapack С18 ОФ (0,46 x 20 см) посредством градиента концентрации ацетонитрила, изменяющегося от 0 до 70%, содержащего 0,1% ТФУ, при скорости 1 мл/мин, при комнатной температуре и со спектрофотометрической детекцией при 220 нм. Пептидная карта восстановленного p-ИЛ2 человека (фиг. 6а) показывает фрагментацию, отличающуюся от фрагментации окисленного ИЛ2 эталона (фиг. 6б). 6) Круговой дихроизм
Спектры кругового дихроизма (КД) определяют при комнатной температуре на сектрографе Jobin Yvon Mark V. Пробу восстановленного p-ИЛ2 человека, лиофилизированного после ОФ-ВЭЖХ, проведенного с линейным градиентом изопропанола, в котором заменили 0,5% лимонной кислоты по примеру 1 на 0,1% муравьиной кислоты, и последующего удаления отгонкой изопропанола и лиофилизации, поглощают уксусной кислотой с концентрацией 1 мг/мл. Используемые емкости составляют 0,01 см и 0,5 см соответственно для пептидной области (185-250 нм) и для ароматической области (260-320 нм). Спектр растворителя вычисляется из спектра ИЛ2 для каждой пробы. Результаты даны в эллиптичности 0 (средний вес на остаток ИЛ2=116). Фиг. 7а показывает спектр КД в удаленном УФ: биологически активный, восстановленный p-ТЛ2 человека согласно изобретению имеет спектр, который указывает на присутствие упорядоченной вторичной структуры. Определение % спирали альфа показывает на малозначимую разницу с окисленным этанолом ИЛ2 (% спирали альфа 50%). Фиг. 7б показывает спектр КД в ближнем УФ: окисленный ИЛ2 эталона имеет показательный КД, который указывает на асимметрическую окружающую среду для ароматических остатков, тогда как восстановленный p-ИЛ2 человека согласно изобретению имеет КД мало показательный, но различный. Пример 4. Биологическая активность
Биологическая активность восстановленного p-ИЛ2 человека согласно изобретению оценивается опытами в условиях in vitro или "ex vivo". 1) Активность in vitro на клетках человека
а. Опыт лимфобластического превращения
Кроме пролиферативной активности на клеточных поколениях мышей, таких как СТЛЛ-2, которая позволяет осуществить биологическую дозировку ИЛ2, восстановленный p-чИЛ2 согласно изобретению проявляет митогенный эффект, зависящий от дозы, сравнимый с эффектом, проявляемым окисленным ИЛ2 эталона на нормальные циркуляционные человеческие лимфоциты, который измеряется введением насыщенного тритием тимидина в ДНК (фиг. 8). б. Индукция цитотоксичности одноядерных клеток
Опыт ведется на инкубированных циркуляционных одноядерных клетках человека в присутствии ИЛ2, и цитотоксический эффект определяется по отношению к опухолевым целевым клеткам соответственно эритролейкемического поколения К 562 (чувствительного к клеткам NK ) и поколения DAUDI, произведенного от лимфомы B (резистентной к клеткам NK), путем измерения высаливания CR 51 за 4 ч. Результаты, выраженные в литических единицах на 106 клеток (ЛЕ/10н6), показывают, что восстановленный p-ИЛ2 человека согласно изобретению проявляет способность в зависимости от дозы соответственно увеличивать активность NK или наводить цитотоксичность лимфоцитов T по отношению к опухолевым целям, которая может быть сравнима с известной активностью природного ИЛ2 (фиг. 9). 2) Активность "ex vivo" на мышах (стимулирование брюшинных макрофагов)
У нормальной мыши Balb/c и MRL -+/+ внутрибрюшинная последовательная инъекция сначала рекомбинантного гамма интерферона крысы при субоптимальных дозах (100-300 Е), а затем спустя 24 ч восстановленного p-ИЛ2 человека согласно изобретению инициирует окислительные механизмы фагоцитарных клеток, определяемые измерением хемилюминесценции в присутствии сложного эфира форбола (РМА), клеток, взятых из брюшинной полости мышей, умерщвленных спустя 24 ч после инъекции ИЛ2. Эффект, зависящий от дозы, сравним с эффектом, наблюдаемым с окисленным ИЛ2 эталона. Результаты приведены в табл. 3. Пример 5. Фармацевтический состав для инъекции
Водный раствор восстановленного p-ИЛ2 человека, соответствующего фракции "59" согласно изобретению, из которой удаляли изопропанол азеотропной перегонкой в вакууме, разбавляют по мере необходимости при помощи дегазированного и насыщенного азотом водного раствора маннита из расчета 100 мг восстановленного ИЛ2/мл и 50 мг/мл маннита. После фильтрации на мембране толщиной 0,22 мкм, стерильного распределения 1 мл в склянки и лиофилизации склянки-дозы закупоривают в атмосфере азота и хранят при температуре в 4oC до употребления. Пример 6. Фармацевтический состав для непрерывной перфузии. Водный раствор восстановленного p-ИЛ2 человека, соответствующего фракции "59" изобретения, из которой удален изопропанол азеотропной перегонкой в вакууме, разбавляют по мере необходимости при помощи дегазированного и насыщенного азотом водного раствора маннита из расчета 500 мкг восстановленного ИЛ2/мл и 50 мг/мл маннита. После фильтрации на мембране толщиной 0,22 мкм, стерильного распределения 1 мл в склянки лиофилизации склянки-дозы закупоривают в атмосфере азота и хранят при температуре 4oC до употребления. Затем содержание каждой склянки растворяют введением 1 мл стерильной дистиллированной воды. Растворы, соответствующие 7 склянкам-дозам (около 35
![рекомбинантный интерлейкин 2 человека, патент № 2105011](/images/patents/366/2105010/183.gif)
Класс C07K1/14 экстракция; разделение; очистка
Класс C07K1/20 распределительная, обратнофазная или гидрофобновзаимодействующая хроматография
Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона