фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью
Классы МПК: | C12N15/58 активаторы плазминогена, например урокиназа, ТПА C07K14/745 факторы коагуляции или фибринолиза крови C12N9/88 лиаза (4) A61K38/48 действующие на пептидные связи (34) |
Автор(ы): | Анне Штерн[DE], Ульрих Конерт[DE], Райнер Рудольф[DE], Штефан Фишер[DE], Ульрих Мартин[DE] |
Патентообладатель(и): | Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1990-02-06 публикация патента:
20.03.1998 |
Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: получен полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена путем трансформации бактериального штамма рекомбинантной плазмидной ДНК рА27.3, включающей фрагмент ДНК, кодирующий указанный полипептид и имеющий следующие свойства: фибринолитическая активность 550000
200000 Ед/мг; молекулярный вес 38500
2000 Да; увеличенный период полураспада по сравнению с природным аналогом; фибринзависимая стимуляция; тромболитическая активность; растворимость в растворе аргинина в концентрации 10 - 1000 ммоль/л при чистоте продукта 95%; получена также фармакологическая композиция, содержащая указанный полипептид в эффективном количестве и фармакологически приемлемой носитель. 4 с.п. ф-лы, 7 ил., 10 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
Формула изобретения
1. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную на стp. xxx, содержащий АТС стартовый кодон. 2. Полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена, полученный путем трансформации бактериального штамма рекомбинантным вектором, включающим фрагмент ДНК с последовательностью, приведенной в п.1 или аналогичной последовательностью, определяемой вырожденностью кода со следующими свойствами: фибринолитическая активность 550000-200000Ед/мг; молекулярный вес 38500![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к новому производному тканевого активатора плазминогена t-PA, ДНК-последовательности, которая кодирует новое -t-PA-производное, плазмидам экспрессии, содержащим кодирующую t-PA-производное ДНК-последовательность, способу получения t-PA-производного и композиции с фибринолитической активностью, содержащей t-PA-производное. Свернувшаяся кровь содержит в качестве основной компоненты полимерного белкового матрикса фибрин. При физиологических условиях фибрин растворяется благодаря последовательности реакции с участием фибринолитической системы. Центральной реакцией при этом является активирование плазминогена в плазмин, которое вызывается, например, тканевым активатором плазминогена (t-PA). Плазмин, в свою очередь, растворяет фибрин. Ферментативная активность природного или полученного генноинженерным методом в клетках эукариот t-PA, а именно каталитическое активирование плазминогена в плазмин, в отсутствие фибрина или продуктов расщепления фибриногена очень незначительна, однако в присутствии этих продуктов может повышаться примерно на порядок. В крови t-PA под действием протеаз расщепляется на A- и B-цепь. Обе образовавшиеся цепи остаются связанными через цистеиновый мостик. Возможность простимулировать активность t-PA представляет собой решающее преимущество по сравнению с другими известными активаторами плазминогенов, например урокиназой или стрептокиназой (M.Hoylaerts и и др., J."Biol. Chem". 257(1982), 2912 - 2919; W.Nieuwenhuizen и др., Biochem Biophys.Acta, 755, (1983) 531 - 533). Механизм действия t-PA in vivo описан, например, в Korniger u Collen, Thromb. Hamostasis, 46 (1981), 561-565. Присущая t-PA активность позволяет использовать его как средство для борьбы с патологическими состояниями, связанными с образованием тромбов (EP-A 0302456, кл. C 12 N 9/54, 1989, прототип), что непосредственно подтверждено и клиническими испытаниями [Cokken и др., Circulation 70 (1984), 112; Circulation 73 (1986/511)]. Однако в качестве недостатка t-PA нужно рассматривать быстрое уменьшение его концентрации в плазме (клиренс). Следствием этого является то, что необходимо относительно большое количество t-PA, чтобы получить in vivo эффективное лизирование тромбов. Высокие же лечебные дозы оказывают часто побочные действия, в частности вызывают кровотечение. В европейском патенте N 019620 описан природный продукт распада t-PA, который содержит только домены протеазы и крингель-11 и N-конец которого начинается с аланина 160 (в указанной Pennica и др. в Nature 301 (1983), 214 - 221, последовательности аминокислот). Скорость клиренса этого продукта распада t-PA, однако, несущественно отличается от таковой природного t-PA. Лишь благодаря химической модификации каталитической области за счет введения блокирующей группы этот показатель можно улучшить. Задача изобретения - изменение t-PA таким образом, чтобы образовавшееся производное обладало сильно сниженной скоростью клиренса (более длительным временем полураспада в плазме крови), при этом должны сохраняться лизирующее тромбы действие, а также стимулируемость фибрином. Предметом изобретения поэтому является измененный тканевой активатор плазминогена t-PA-производное), который отличается тем, что он не гликозилирован и представлен последовательностью аминокислот (см. табл. 1). которая на амино-конце может также иметь дополнительный Met. Как выяснилось, делеция части имеющихся в нативном t-PA областей не оказывает никакого влияния на тромболитическую эффективность протеина и зависящую от фибрина стимуляцию мутеина, которая сравнима с таковой нативного t-PA. Правда, установлено, что в предлагаемом согласно изобретению t-PA-производном отсутствует свойство связывать фибрин, но несмотря на это, фибринолитическая активность in vivo не только не снижена, но даже существенно улучшена по сравнению с таковой нативного t-PA. Неожиданным также является тот факт, что при введении тромболитически эффективной дозы производного почти не наблюдается влияния на системный фибронолиз. Таким образом, оказалось, что предлагаемое согласно изобретению t-PA-производное обладает типичной для нативного t-PA специфичностью к фибрину при физиологических условиях. Эти результаты получены при фармакологических исследованиях предлагаемого согласно изобретению t-PA-производного (примеры 6 и 7). Кроме того, предлагаемый протеин обладает очень высокой удельной (специфической) активностью. При применении описанного далее способа ренатурирования получены формы в активностью 500-800 и KU/мг. Следующим предметом изобретения является ДНК-последовательность, которая кодирует предлагаемое согласно изобретению t-PA-производстное и имеет нуклеотидную последовательность (см. табл. 2). Предлагаемая в изобретении ДНК-последовательность используется в составе рекомбинантного вектора для экспрессии нового t-PA производного. Рекомбинантная плазмида для t-PA экспрессии составляет следующий предмет изобретения. Такая плазмида экспрессии может также включать ДНК-последовательность, которая колируя предлагаемое в изобретении t-PA-производное, может отклоняться от указанной ДНК-последовательности в рамках вырожденности кода. Плазмида экспрессии содержит, наряду с кодирующей t-PA-производное последовательностью регулируемый промотор (например, tac), эффективный терминатор (например, td), селективный маркер (например, ген-![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107058/946.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107022/955.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
фиг. 3 и 4 - диаграммы фармакокинетики t-PA-активности предлагаемого согласно изобретению t-PA-производного и выпускаемого в продажу t-PA-препарата (ActilyseR); кривая 1: K2P, доза 200 000 ед/кг = 0,25 мг/кг; внутривенное вливание через 30 мин; число исследованных животных (кролики) = 4; кривая 2: ActilyseR доза 200 000 ед/кг; внутривенное вливание через 30 мин; число исследованных животных (кролики) = 6;
фиг. 5 - сравнительные кривые действия доз (для кроликов) на тромболиз t-PA-производных (показано среднее значение +SEM: 1kU = 1000 1uU; кривая 1: K2P; кривая 2: ActilyseR);
фиг. 6 - временная зависимость Simplate времени кровотечения (ВТ) до и после разовой внутривенной инъекции плацебо или повышающихся доз ActilyseR находящимся под наркозом собакам;
фиг. 7 - временная зависимость Simplate времени кровотечения (ВТ) до и после разовой внутривенной инъекции плацебо или повышающихся доз K2P находящимся под наркозом собакам. Пример 1. Конструкция плазмиды pA27.3. Исходная плазмида pREM7685, описанная в европейском патенте А-О 242 836, содержит следующие элементы: tac-промотор, область lac-оператора с ATG-стартовым кодоном, участок кодирования t-PA-производного FK2P, терминатор транскрипции из pKK223-3, ген Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
5 TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3"
Для образования гетеродуплекса фрагмента A, фрагмент B (по 450 f моль) и олигонуклеотид (75 p моль) смешивают и в присутствии 50 ммоль/л NaCl 10 ммоль/л Трис/HCl, pH 7,5 и 10 ммоль/л MgSO4 инкубируют 3 мин при 100oC и переносят на лед. Ренатурация ДНК происходит за 30 мин при 60oC. Для репаративного синтеза к гетеродуплексу добавляют дезоксинуклеотидтрифосфаты (0,25 ммоль/л, ATP (1 ммоль/л), NaCl (100 ммоль/л), Трис-HCl, pH 7,5 (6,5 ммоль/л), MgCl2 (8 ммоль/л) Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
а) Лизис клеток и получение внутриклеточных телец IB"S
1,6 кг влажной клеточной массы E.coli DSM 3689, трансформированная с помощью плазмиды pA27.3 суспендируют в 10 л 0,1 моль/л Трис-HCl, 20 ммоль/л ЭДТА, pH 6,5, при 4oC. К этой смеси добавляют 2,5 г лизоцима и инкубируют 30 мин при 4oC; затем клетки переводят в удобную для переработки форму путем диспергирования при высоком давлении. К полученному раствору примешивают 5 л 0,1 ммоль/л Трис-HCl, 20 ммоль/л ЭДТА, 6% Тритона Х100 и 1,5 ммоль/л NaCl, pH= 6,5, и инкубируют 30 мин при 4oC. Затем осуществляют отделение нерастворимых составных частей (IB"s) путем центрифугирования с помощью центрифуги Padberg. Осадок после центрифугирования суспендируют в 10 л 0,1 ммоль/л Трис-HCl, 20 ммоль/л ЭДТА, pH 6,5, инкубируют 30 мин при 4oC и IB-пррепарат отделяют путем последующего центрифугирования. б) Солюбилизация 1B
100 г 1B (мокрый вес) суспендируют в 450 мл 0,1 ммоль/л Трис-HCl, 6 ммоль/л гуанидин-гидрохлорида, 0,2 ммоль/л ДТЕ, 1 ммоль/л ЭДТА, pH 8,6 и перемешивают при 25oC 2,5 ч. После установления pH 3 с помощью HCl (25%) осуществляют диализ против 10 ммоль/л HCl (3
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107010/183.gif)
Вводят гуанидин-гидрохлорид (твердый) так, чтобы в последнем разбавлении вышеуказанного диализа 10 ммоль/л HCl концентрация гуанидин-гидрохлорида составляла 6 ммоль/л. Реакционную смесь инкубируют при 25oC в течение 1,5 ч, затем вводят окисленный глютатион GSSG до 0,1 моль/л и Трис-HCl до 0,05 ммоль/л, а pH-значение доводят по титру до pH 9,3 с помощью 5 ммоль/л NaOH. Смесь перемешивают в течение 3,5 ч при 25oC. После установления pH 3 с помощью HCl (25%) осуществляют диализ против 10 ммоль/л HCl (3
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107010/183.gif)
Реакционный сосуд емкостью 10 л заполняют смесью 0,1 ммоль/л Трис-HCl, 0:8 ммоль/л L-аргинина, 2 ммоль/л GSH (восстановленная форма), 1 ммоль/л ЭДТА, pH 8,5. В зависимости от условий ренатурирование проводят при 20oC путем трехкратной добавки 100 мл указанного выше смешанного дисульфида в отрезок времени 24 ч. После ренатурирования получают материал с удельной активностью 1500 - 10000 1U (мг) определение (пример 46). Единица 1U - единица активности по определению WHO, Национального Института по биологическим стандартам и контролю. д) Концентрирование ренатурированной реакционной смеси
Ренатурированную смесь при необходимости можно концентрировать через гемодиализатор. Пример 3. Очистка К2Р из E.coli. 1. Очистка К2Р из E.cjli путем афинной хроматографии на ET1 - сефарозе после предварительного концентрирования
а) Элюирование с помощью лимонной кислоты
Смесь после ренатурирования концентрируют через Memo, диализатор (Asahi AM 300) 1: 23 и дополняют с помощью 0,5 ммоль/л. Уравновешенную смесью 0,1 ммоль/л Трис-HCl, pH 7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л NaCl колонку с ET1 (эритрин-трипсин-ингибитор)-сефарозой (объем = 50 мл) загружают 550 мл концентрата подвергнутой повторному окислению смеси (10 колоночных объектов/ч, 10 SV/ч) и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока абсорбция при 280 нм не достигнет значения буфера. Элюирование связанного материала осуществляют с помощью 20 ммоль/л лимонной кислоты, pH 3,2 (см. табл. 3). б) Элюирование с помощью 0,3 ммоль/л аргинина, pH 4,5
Ренатурированную реакционную смесь концентрируют, как описано в примере 3.1. а). Уравновешенную с помощью смеси 0,1 ммоль/л Трис-HCl, pH 7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л NaCl колонку с ET1-сефарозой (25 мл) нагружают 800 мл концентрат (12 BV/ч) и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока экстинкция элюата при 280 нм не достигает значения экстинкции буфера. Связанный материал элюируют с помощью 0,3 ммоль/л аргинина, pH 4,5, (см. табл. 4). 2. Очистка К2Р из E.coli путем афинной хроматографии на ET1-сефарозе без предварительного концентрирования. Уравновешенную с помощью смеси 0,1 ммоль/л Трис-HCl, pH 7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л NaCl колонку с ET1-сефарозой (объем = 10 мл) загружают 12 л повторно окисленной смеси и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока экстинкция элюата при 280 нм не достигнет значения экстинкции буфера. Элюирование связанного материала осуществляют с помощью 0,8 ммоль/л аргинина, pH 5 (см табл. 5). Пример 4. Экспрессия К2Р-гена при использовании других векторов. Последовательность, колирующую К2Р, клонируют в космиде pHC79. Космиду, как описано Коллинзом, Дж., и др. в PNAS USA 75 (1978) 424, упаковывают в Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
а) Протеин-химическая характеристика - SDS - PAGE и жидкостная хроматография высокого давления с обращенной фазой. Гомогенность очищенного с помощью афинной хроматографии с ETI-сефарозой материала показана при помощи SDS - PAGE и жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (R P-HPLC). Из относительной длины пробега для K2P из прокариотов рассчитан молекулярный вес 38,550 + 2,000 Да. Денситометрическая оценка дает чистоту препарата выше 95%. RP-HPLC основана на различном взаимодействии протеинов с гидрофобной матрицей. Это семейство используется в качестве аналитического метода для квалификации степени чистоты. Анализ очищенного K2P из E.cjli осуществляют через разделительную колонку с Нуклеозилом 300 (Kаduer) с помощью градиента трифторуксусная кислота - ацетонитрил (буфер А: 1,2 мл трифторуксусной кислоты в 1000 мл воды; буфер B: 300 мл воды, 700 мл ацетонитрила, 1 мл трифторуксусной кислоты; 0-100%). Интегрирование хроматографического анализа дает чистоту выше 95%. -N-терминальная последовательность аминокислот
N-терминальная последовательность аминокислот определяется с помощью AB1 470 - секвенатора со стандартной программой и линейным PTH-детектированием. Найденная последовательность ST-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9 совпадает с ожидаемой, происходящей из ДНК-последовательности. б) определение активности
"Ин витро" активность K2P из E.coli определяется в соответствии с тестом, описанном в "Zeitschrift f Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
"Ин витро"-связывание K2P из E.coli с фибрином определяют как описано (Higgins, D.L. und Vehar, G.A. (1987), Biochem, 26, 7786-7791). На фиг. 2 показано, что K2P из E.coli в противоположность полному t-PA на CHO или
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107058/946.gif)
BamHI/PvuI фрагмент величиной 3,4 т.п.о. и PvuI/XmaI-фрагмент, размером примерно 1,3 т.п.о. Оба указанных фрагмента лигируют с 1,3 т.п.о. BamHI/XmaI фрагментом из плазмиды pA27.3 и трансформируют E.coli вместе с плазмидой pVBS 500. Результирующая плазмида название pA 27 fd. Пример 7. Приготовление фармацевтической композиции. Получаемое из E.coli t-PA- производное K2P после описанной выше очистки может быть использовано для тромболитической терапии, предпочтительно в виде фармацевтической композиции. Соответствующие фармацевтические препараты в частности могут иметь следующий состав:
1. 0,2-0,6 моль/л аргинин/HCl
0,01-0,06 моль/л фосфата натрия, pH 7,2 и
0,05-0,2 мас.% твин 80
2. 0,2-0,6 моль/л аргинин/H3P04, pH 7,2
0,05-02 моль/л твин 80
3. 0,1-0,2 моль/л фосфата натрия или калия, pH 6,0
10 моль/л транексамовой кислоты,
50 мг/мл сахарозы или трехалозы и
0,01-0,2 мас.% твин 80 или твин 20. Для K2P из примера 3 концентрация протеина во всех указанных выше составах 4 - 10 мг/мл (амидолитическая активность 2,4-4,9 М/мл). Пример 8. Фармакологические данные получаемого в прокариотах K2P. 1. Фармакокинетика K2P на кроликах
K2P на белых новозеландских кроликах сравнивают с Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107058/946.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107022/955.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107009/945.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107010/183.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107010/183.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
Для испытания тромболитической эффективности используют разработанную D. Collen и др. модель на кроликах по тромбозу яремной вены (J.Clin Invtst. 71,368, 1983). K2P и Actilyse Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107009/945.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
Для того, чтобы изучить тромболитические действия K2P из E.coli на артериальных тромбах экспериментальной моделью было выбрано животное с острым инфарктом миокарда. В качестве одного из таких животных исследовали собаку. Метод образования тромба коронарной артерии представляет собой модификацию способа Romson и др. (Thromb. Res. 17, 841 (1980). При открытой грудной клетке у находящихся под наркозом и при искусственном дыхании собак раздражают поверхность интимы окружающей ветви A.coronaria sinistra (=leftcirtum- flex coronary artery = LCX) электрическим импульсом (150
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107022/956.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107009/945.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107009/945.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
1. Фармаколинамика на собаке
K2P после внутривенной инъекции приводит к зависящей от дозы скорости реперфузии. Максимальный эффект (скорость = 100%) достигается после инъекции 200 кU/кг KG. Доза для 100%-ной реперфузии в случае Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
После внутривенной инъекции 200 кU/кг K2P или Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107009/945.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
Спустя 2 ч после инъекции K2P находят зависящее от дозы небольшое снижение остаточной концентрации фибриногена (до 81
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107094/2107094-2t.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107005/177.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107009/945.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
Внутривенная инъекция K2P не дает никакого статически значительного удлинения времени кровотечения по сравнению с контрольным значением перед инъекцией во всех четырех различных дозах. В противоположность этому Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
На описанной модели тромбоза коронарных артерий K2P проявляет себя как тромболитик, который после внутривенной инъекции порции может достигать 100-ной скорости восстановления кровотока не влияя сильно на концентрацию фибриногена и без заметного удлинения времени кровотечения. По сравнению с Actilyse
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
![фрагмент днк, кодирующий полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная днк ра27.3, кодирующая полипептид к2р со свойствами активатора плазминогена и фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, патент № 2107094](/images/patents/364/2107064/174.gif)
Класс C12N15/58 активаторы плазминогена, например урокиназа, ТПА
Класс C07K14/745 факторы коагуляции или фибринолиза крови
Класс A61K38/48 действующие на пептидные связи (34)