способ выделения и очистки эпидермального фактора роста человека (ч-эфр)

Формула изобретения

Способ выделения и очистки эпидермального фактора роста человека (Ч-ЭФР), предусматривающий культивирование рекомбинантного штамма, несущего ген Ч-ЭФР, хроматографическое разделение на сорбенте и элюцию целевого продукта, отличающийся тем, что Ч-ЭФР выделяют из культуральной жидкости, в качестве сорбента используют CNBr-активированную сефарозу, связанную с поликлональными антителами в Ч-ЭФР, а элюцию проводят 1 М уксусной кислотой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для выделения и очистки ЭФР из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов.

Цель изобретения - повышение выхода и степени чистоты конечного продукта, упрощение и сокращение многостадийного хроматографического процесса выделения и очистки.

В настоящее время коммерческий препарат ЭФР, выпускаемый такими фирмами, как Sigma (США) и Serva (Германия), получают по методике C. Savage . & C. Cohen [1] , которая предусматривает двухступенчатый хроматографический процесс выделения и очистки сначала на Bio-Gel P 10, затем ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе и наконец ВЭЖХ в обращенной фазе по методике [2]. При этом выход конечного продукта составляет 70%, а степень чистоты не более 93-95%.

В литературе имеются данные о выделении ЭФР из рекомбинантных штаммов E. coli путем двухстадийного хроматографического разделения на DavisiI C₁₈ и Bondopack C₁₈ с выходом около 70% и степенью чистоты 97% [3].

Известен одностадийный метод выделения и очистки Ч-ЭФР с помощью иммуносорбента на основе моноклональных антител, используемый, в частности, при получении урогастрона из мочи [4]. Указанный метод имеет низкую продуктивность и высокую трудоемкость в связи со сложностью получения чистых моноклональных антител.

Целью изобретения является повышение выхода готового продукта и упрощение процесса его выделения и очистки.

Указанная цель достигается использованием в качестве источника Ч-ЭФР культуральной жидкости рекомбинантных штаммов, несущих ген Ч-ЭФР, и поликлональных антител для выделения и очистки конечного продукта. Культурная жидкость, полученная в результате выращивания рекомбинантных штаммов и разведения в соотношении 1:10 фосфатным буфером pH 7,5, содержащим 0,15 М хлорид натрия (буфер 1), наносится на заполненную ранее синтезированным иммуносорбентом колонку. Сорбент промывают буфером 1, 1 М уксусной кислотой и снова буфером 1. Элюцию несорбированного примесного материала, не содержащего ЭФР, проводят буфером 1, контролируя оптическую плотность раствора при 274 нм с помощью проточного денситометра Uvicord II. Связавшийся с иммуносорбентом материал, содержащий ЭФР, элюируют 1 М уксусной кислотой, высушивают лиофилизацией. Положительный эффект заключается в возможности получения в одностадийном процессе ростового фактора с выходом 1 мг/л культуральной жидкости (95% выход) и степенью чистоты не менее 99%.

Пример. 50 мл супернатанта получили после отделения биомассы от культуральной жидкости, содержащей 1,2 мг Ч-ЭФР в 1 л. Количественное определение Ч-ЭФР проводили с помощью иммуноферментного анализа (Elisa) [5].

Иммунизацию кроликов осуществляли по методу Кравцова Э. Г. и Карманова М.И. [1].

На фиг. 1-4 изображены графики, показывающие: на фиг. 1 - аффинную хроматографию культуральной жидкости: 1 - нанесение препарата, 2 - 1 М уксусная кислота; на фиг. 2 - анализ полученного аффинной хроматографией материала диск-электрофорезом. Стрелками указаны положения маркерных белков и пептидов : 1 - 16,95, 2-14,40, 3-8,16, 4-6,21, 5-2,51 кДа; на фиг. 3 - ВЭЖХ материала, полученного методом иммуносорбции; на фиг. 4 - влияние препарата ЭФР на стимуляцию включения C¹⁴ - тимидина.

Выделение иммуноглобулинов из сыворотки иммунизированных животных производили разбавлением иммунной сыворотки равным объемом 0,15 М хлорида натрия, затем помещали на магнитную мешалку и добавляли насыщенный раствор сульфата аммония в количестве 1/2 от общего объема, оставляли в течение 30 мин для образования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, растворяли в том же объеме 0,15 М раствора хлорида натрия, добавляя 1/2 часть от первоначального объема насыщенного раствора сульфата аммония и оставляли на 30 мин в ледяной бане на магнитной мешалке. Процедуру повторяли дважды.

Полученный осадок растворяли в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,5 и диализовали против того же буфера. По окончании диализа проводили очистку иммуноглобулинов аффинной хроматографией на протеин-А-сефарозе (Pharmacia) [7].

Полученные иммуноглобулины высушивали лиофилизацией на лиофильной сушилке Edvards и использовали для получения иммуносорбента путем связывания с CNBr-активированной сефарозой по обычной схеме [8].

Синтезированным иммунносорбентом заполняли колонку размером 12x150 мм, затем промывали ее последовательно 0,01 М фосфатным буфером pH 7,5, содержащим 0,25 М хлорид натрия, 1 М уксусной кислотой и вновь фосфатным буфером. 50 мл супернатанта, полученного центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин после культивирования рекомбинантных штаммов и содержащего 1,2 мг ЭФР в 1 л, разводили в 10 раз буфером 1 и наносили на колонку. Элюцию примесного материала, не содержащего ЭФР, проводили тем же буфером до полного исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Контроль оптической плотности осуществляли при помощи проточного денситометра Uvicord II при длине волны 274 нм. Сорбированный материал элюировали 1 М уксусной кислотой (фиг. 1), полученный раствор высушивали лиофилизацией и анализировали диск-электрофорезом в ПААГ [9] (фиг. 2) и с помощью ВЭЖХ (фиг. 3) на жидкостном хроматографе Varian Model 8500. Материал растворяли в 26% ацетонитриле, специально очищенном для ВЭЖХ, аликвоты по 200 мкл наносили на фирменную колонку Micropac CH-10 18x25 мм, заполненную C₁₈ силикагелем с размером гранул 10 мкм и размером пор 60 . Водная фаза содержала 0,05 М уксусную кислоту, pH которой доводили до 5,6 триэтиламином. Хроматографические процедуры проводили в изократическом режиме с мобильной фазой, содержащей 26% ацетонитрила (объем/объем). Скорость элюции составляла 0,5 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны 280 нм. Кроме того, определяли аминокислотный состав с помощью аминокислотного анализатора фирмы "LKB" в градиенте цитрата натрия по общепринятой схеме [10]. Рассчитывали содержание аминокислотных остатков на моль Ч-ЭФР и содержание белка [11] в препарате. Также определяли биологическую активность Ч-ЭФР in vitro (фиг. 4). Фибробласты человека помещали в культуральные чашки, содержащие 5 мл фосфатно-солевого буфера в модификации Дульбекко, следующего состава: 2,68 мМ хлорида калия, 1,47 мМ дигидрофосфата натрия, содержащего 10% сыворотку. По достижении клетками конфлюетности их осаждали центрифугированием, среду удаляли, клетки промывали дважды сбалансированным солевым раствором Хенкса следующего состава: 1,26 мМ хлорид кальция, 5,36 мМ хлорида калия, 0,44 мМ дигидрофосфат калия, 0,49 мМ хлорид магния, 0,41 мМ сульфат магния, 0,137 М хлорид натрия, 0,34 мМ гидрофосфата натрия. Затем к промытым клеткам прибавляли 5 мл вышеуказанного буфера в модификации Дульбекко, содержащего 1% сыворотку, после клетки инкубировали в течение 48 ч. К клеткам, помещенным в чашках, добавляли разные количества Ч-ЭФР (0 - 10 нг/мл), а через 20 ч вносили 1 мкКи/мл C¹⁴ - тимидина. Через 4 ч прибавляли 10% трихлоруксусную кислоту. Полученную суспензию фильтровали через фильтры "Сынпор" размером 0,32 мкм и осадок на фильтре промывали 5 мл ТХУ с 0,1% немеченым тимидином. Отмывку повторяли трижды. Фильтры высушивали при комнатной температуре. Радиоактивность измеряли в жидкостном сцинтилляционном счетчике ABAC SL-40 с использованием сцинтилляционной жидкости следующего состава: 4 г PPO, 0,2 г POPOP и толуола до 1 л.

Анализ полученного препарата диск-электрофорезом в ПААГ показал, что молекулярная масса его составляла 6 кДа. При ВЖЭХ в обращенной фазе выявляли один гомогенный пик ультрафиолетпоглощающего материала, примесный материал практически отсутствовал, степень чистоты полученного препарата составляла не менее 99%. Аминокислотный состав пептида соответствовал аминокислотному составу Ч-ЭФР. Полученный препарат стимулировал синтез ДНК в культуре клеток фибробластов человека.

Таким образом, выделенный методом иммуносорбции из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов препарат по всем исследованным параметрам соответствовал характеристикам, описываемым для высокоочищенного препарата Ч-ЭФР. Выход ростового фактора составлял около 1,14 мг из 1 л культуральной жидкости или 95%.

Ниже приведен аминокислотный состав полученного препарата.

Аминокислота - Остаток/моль

Лизин - 2,2

Гистидин - 1,8

Аргинин - 2,5

Аспарагиновая кислота - 6,9

Треонин - 0

Серин - 2,7

Глутаминовая кислота - 5,1

Пролин - 1,1

Глицин - 4,2

Аланин - 2,0

Цистеин - 5,4

Валин - 2,7

Метионин - 0,9

Изолейцин - 2,1

Лейцин - 5,1

Тирозин - 4,8

Фениланин - 0

Триптофан - 1,7

Источники информации

1. Savage S., Cohen C. // J.Biol.Chem. 247. N 23, p. 7609-7611.

2. Matrisian M et all // Anal. Biochem.. 1982. v. 125, p. 339-345.

3. Батчикова Н.В. и др. // Биоорг. химия, 1992, т. 18, с. 766-776.

4. Hissey P. H. et all // J. Immunol Meth. 1985. v 78. p. 211-216.

5. Boch A.M.G.. Van Hell H.. Schuurs A.H. // Enzyme Labeled Immunoassay of Hormones and Drugs / Ed. S.B. Pal: Mater de Gruyter. 1979, p. 175-187.

6. Кравцов Э.Г., Карманов М.И. // Авт. св. N 1018643, кл. A 61 K 39/395, 1981.

7. Hjeim H. et all // FEBS Letters. 1972. v. 23, p. 73-77.

8. Axen R et all // Nature 1967. v. 214. p. 1302-1304.

9. Swank R. T.. Mukres K. D. // Anal. Biochem. 1971. v. 39, p. 462-477.

10. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, с. 515-527.

11. Brodford M. M. // Analit Biochem. 1976. v. 72. p. 248-253.