способ получения тилозина

Формула изобретения

1. Способ получения тилозина, предусматривающий выращивание культуры-продуцента в оптимальных условиях, отделение мицелия, сорбцию целевого продукта из фильтрата, его элюацию и высушивание, отличающийся тем, что перед сорбцией проводят предварительное обессоливание фильтрата, а сорбцию проводят на кислотном катионите.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание фильтрата проводят путем его последовательного контакта с анионитом типа ЭДЕ-10п или АВ-17 в гидроксильной форме и с катионитом типа Ку 2 20 в водородной форме.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве кислотного катионита используют слабокислотный карбоксильный катионит типа КБ-2Э в натрий-водородной форме.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюацию проводят раствором двузамещенного фосфата натрия с pH 8,0 - 9,5.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что высушиванию подвергают непосредственно элюат.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения тилозина - макролидного антибиотика широкого спектра действия, применяющегося в сельском хозяйстве.

Для профилактики заболеваний и лечения сельскохозяйственных животных и птицы тилозин может быть использован перорально ( в виде кормовых препаратов, содержащих тилозин-сырец низкой степени очистки) или парэнтерально (в виде препаратов тилозина-основания и его водорастворимых солей, содержащих не менее 80% тилозина).

В зависимости от характера использования полученного препарата тилозина различаются и его способы получения - от сравнительно простого способа получения тилозина-сырца до многостадийных способов получения высокоочищенных препаратов тилозина.

Простейший способ производства тилозина состоит в выращивании культуры-продуцента на подходящей питательной среде в оптимальных условиях и в последующем высушивании культуральной жидкости, в результате чего получают кормовой продукт, содержащий 2-5% антибиотика-сырца, остатки питательной среды и мицелий продуцента [1].

Способ позволяет получить препарат тилозина, называемый "Фрадизином", с низким содержанием активного начала и обладающий высокой гигроскопичностью. В процессе сушки препарата создаются пожароопасные условия, поскольку высушиваемый препарат склонен к возгоранию.

В большинстве случаев на практике используются методы получения очищенного тилозина, и долгое время для этих целей применялся экстракционный метод.

Описан, например, способ получения тилозина, предусматривающий выращивание культуры-продуцента, отделение мицелия, экстракцию целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости бутилацетатом, реэкстракцию антибиотика из органической фазы подкисленной водой, повторную экстракцию водной системы бутилацетатом в щелочной среде, обработку экстракта активированным углем и осаждение целевого продукта в виде основания [2].

Этот способ хотя и позволяет получить тилозин высокой степени чистоты (до 90%), но характеризуется многостадийностью, значительными потерями целевого продукта (до 50%) и образованием значительных объемов производственных отходов.

Некоторые варианты экстракционных методов предусматривают дополнительный этап сорбционной очистки антибиотика.

Так, в частности, запатентован способ получения тилозина, заключающийся в том, что культуру-продуцент выращивают в питательной среде, отделяют мицелий, фильтрат культуральной жидкости экстрагируют органическим растворителем (хлороформом, ацетоном, бензолом), из органического экстракта тилозин сорбируют на таких сорбентах, как активированный уголь, гель гидроксида алюминия, или на таких ионообменных смолах, как XE 64, IRC 50 (слабокислые катионообменные смолы), Дауэкс 50 (сильнокислая катионообменная смола), или на смолах на основе карбоксиметилцеллюлозы. Целевой продукт в виде тилиозина-основания элюируют низшими спиртами или низшими спиртами, содержащими до 50% низшего кетона, и получают тилозин 70-80%-ной степени чистоты [3].

Несмотря на сокращение объемов используемых органических растворителей, сохраняются проблемы их регенерации и другие недостатки экстракционных способов.

Дальнейшее совершенствование способов получения тилозина состояло в отказе от этапа экстракции и в сорбционном выделении этого антибиотика из водной фазы.

Известен, например, способ получения тилозина, состоящий из этапов выращивания культуры-продуцента в подходящих условиях, отделения мицелия, доведения pH фильтрата культуральной жидкости до значений 7,5-10,0 сорбции целевого продукта на неионогенной полимерной смоле типа ER-180, амберлит, дуолит и его элюации водно-спиртовым или водно-ацетоновым раствором. Раствор тилозина-основания затем обесцвечивают на макропористой смоле и осаждают высаливанием хлоридом натрия.

Для получения водорастворимых тартрата или фосфата тилозина к раствору тилозина-основания добавляют эквимолярное количество соответствующей кислоты и раствор высушивают [4].

Относительным недостатком этого способа является многостадийность и необходимость использования органических растворителей как элюентов, что вновь порождает проблему регенерации растворителей.

Цель изобретения - упрощение технологии получения тилозина и получение в результате кормового препарата - фосфата тилозина повышенного качества.

Поставленная цель была достигнута в результате того, что элюат с ионообменной смолы без какой-либо дополнительной обработки высушивают, получая целевой продукт.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Культуру-продуцент выращивают в оптимальных условиях, отделяют мицелий, фильтрат культуральной жидкости обессоливают, сорбируют из обессоленного фильтрата тилозин на кислом катионите, элюируют тилозин фосфорнокислой солью и полученный элюат высушивают.

В качестве продуцента могут быть использованы любые культуры, биосинтезирующие тилозин, преимущественно активные штаммы Str.fradiae.

Предпочтительно использовать селекционированные в Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов высокопродуктивные штаммы Str. fradiae ВНИИгенетика-29А и Str. fradiae ВНИИгенетика-29С, депонированные в Коллекции культур Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных организмов под регистрационными номерами ВКПМ-S-851 и ВКПМ-S-1112 соответственно. Эти штаммы обеспечивают в настоящее время устойчивый биосинтез тилозина на уровне 7000-12 500 ед/мл в лабораторных условиях и на уровне 5000-7500 ед/мл в промышленных условиях при использовании питательных сред сравнительно простого состава.

Продуцент выращивают на подходящей питательной среде в оптимальных для данной культуры условиях.

После завершения этапа ферментации отделяют известными приемами мицелий и фильтрат культуральной жидкости обессоливают.

Обессоливание может быть осуществлено, например, электродиализом.

Предпочтительно обессоливать фильтрат культуральной жидкости ионообменным способом, для чего фильтрат сначала пропускают через колонку анионита типа ЭДЕ-10п, АВ-17 или подобного в гидроксильной форме, а затем через колонку катионита типа Ку 2 х 20 в водородной среде.

Сорбцию антибиотика осуществляют на среднекислотном катионите типа КРФ-2 (фосфорилированный полистирол со сшивкой 2% дивинилбензола) в натрий-водородной форме, на слабокислотном карбоксильном катионите типа КБ-2Э в натрий-водородной форме или на подобных смолах.

Для приготовления смешанной натрий-водородной формы катионита смолу в водородной форме обрабатывают двумя объемами буферного раствора, представляющего собой 1 н. раствор гидроксида натрия, нейтрализованный фосфорной кислотой до pH 3,5.

Элюацию тилозина с катионита можно проводить различными фосфорнокислыми солями - фосфатным буфером, фосфорнокислыми солями калия и натрия различной степени замещения, но наиболее пригоден раствор двузамещенного фосфата натрия. Во всех этих случаях в элюат выходит фосфат тилозина.

Значение pH элюирующего раствора не имеет решающего значения и может находиться в пределах 8,5-10,5.

Высушивать элюат можно различными методами, но наиболее подходящий метод распылительного высушивания.

Подвергаться высушиванию может весь элюат или отдельные его фракции.

Выход с ионообменной колонки фосфата тилозина и неорганических фосфатов имеет различную динамику, что показано на чертеже.

На чертеже показана динамика элюации тилозина и неорганических фосфатов с катионита КБ-2Э 1 н. раствором двузамещенного фосфата натрия.

Как хорошо видно, сначала в элюате с колонки находится только фосфат тилозина и лишь затем появляются неорганические фосфаты. По графику легко рассчитать, что при пропускании элюента в объеме, равном объему смолы, соотношение концентраций в элюате фосфата тилозина и неорганических фосфатов составляет примерно 4:1. Такое соотношение очень благоприятно для извлечения и дальнейшей очистки фосфата тилозина, однако в этом случае десорбируется только половина тилозина.

При пропускании 1,5 объема элюента соотношение фосфата тилозина и неорганических фосфатов в элюате понижается до 1:1 и этим количеством элюента десорбируется уже 80% тилозина.

В случае дальнейшего увеличения объема используемого элюента тилозин десорбируется полностью, но соотношение в элюате фосфата тилозина и неорганических фосфатов снижается до 1:3,5.

Первую фракцию элюата, обогащенную тилозином, можно подвергать высушиванию, а вторую фракцию элюата, обогащенную неорганическими фосфатами, можно использовать в качестве элюента на следующих циклах производства. Это является особо целесообразным, если полученный фосфат тилозина рассматривается как исходный продукт для дальнейшего получения высокоочищенного тилозина.

Однако в равной мере можно подвергать высушиванию весь элюат, особенно если предполагается получаемый продукт в дальнейшем использовать как кормовую добавку.

Сухой продукт, полученный в результате высушивания всего элюата, содержит 35-40% фосфорнокислой соли тилозина, 50-60% фосфорнокислых неорганических солей, 1,5-2,5% воды и 6,0-10,0% органических соединений.

Продукт, полученный при высушивании обогащенной тилозином фракции, содержит 45-55% фосфорнокислой соли тилозина, 45-50% фосфорнокислых неорганических солей, 1,5-2,5% воды и 3-5% органических соединений.

Получаемый в любом случае продукт негигроскопичен, негорюч и водорастворим.

Дополнительным достоинством полученного предложенным способом препарата тилозина является наличие значительных количеств неорганических фосфатов - необходимых компонентов кормов для сельскохозяйственных животных и птицы.

Таким образом, при упрощении способа получения водорастворимого препарата тилозина за счет исключения самостоятельной стадии переведения основания тилозина в растворимую соль получают тилозин в виде кормового препарата повышенного качества.

Не известны кормовые препараты тилозина, обогащенные фосфатами, равно как и способы производства водорастворимого фосфата тилозина, приводящие к получению готового кормового продукта повышенного качества.

По сравнению со способом-прототипом, позволяющим получить основание тилозина высокой степени очистки, предложенный способ направлен на приготовление фосфата тилозина умеренной степени частоты, имеющего самостоятельное потребительское значение.

Степень чистоты полученного фосфата тилозина (т.е. содержание активного начала в препарате тилозина) такова, что значительно превышает таковую у известных кормовых препаратов тилозина и позволяет значительно упростить методику его дальнейшем очистки, если возникает желание получить кристаллический фосфат тилозина более высокой степени очистки.

Фактически было установлено, что известный ранее как промежуточный продукт элюат с ионообменной колонки может быть использован после высушивания как конечный целевой продукт с оригинальными свойствами. Вопреки устоявшимся представлениям о том, что для получения качественного сухого препарата тилозина предварительно следует удалить избыток неорганических солей, намеренно сохранен в высушиваемом растворе избыток фосфатов и получен целевой продукт с новыми свойствами. Разработанное техническое решение не представляется очевидным, а предложенный способ соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.

По сравнению с известными способами получения тилозина предложенный способ обладает следующими преимуществами:

является более простым и технологичным, поскольку не предусматривает отдельного (самостоятельного) этапа переведения основания тилозина в солевую форму;

исключает возможность возгорания, пригорания и налипания продукта в процессе сушки, так как высушиваемый продукт негорюч из-за высокого содержания неорганических фосфатов;

снижает вероятность инактивации тилозина в процессе высушивания и хранения, поскольку неорганические фосфаты оказывают на антибиотик стабилизирующее влияние;

приводит к получению хорошо сыпучего и неслеживающегося продукта, что обусловлено высоким содержанием неорганических фосфатов.

Кроме возможности непосредственного использования полученного предложенным способом тилозина в качестве кормовой добавки целевой продукт может служить источником получения кристаллического тилозина, предназначенного для парэнтерального применения.

Пример 1. Культуру штамма Str.fradiae ВНИИгенетика-25А высевают в ферментер объемом 100 л на среду, содержащую (мас.%) муку рыбную (2,0), мелассу (2,0), крахмал картофельный (1,5), однозамещенный фосфат аммония (0,02), хлористый натрий (0,2), сернокислый магний (0,2), мел (0,3), соевое масло (1,0), воду водопроводную (до 100,0). Процесс ферментации проводят при температуре 20^o и при непрерывном перемешивании при скоростью мешалки 220 об/мин. Подача воздуха составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту. Пеногашение проводят путем непрерывного добавления соевого масла. Общий расход соевого масла в процессе пеногашения составил 2% от объема среды. Длительность ферментации составила 7 сут.

Было получено 70 л культуральной жидкости с концентрацией тилозина 7 г/л. Культуральную жидкость подают в реактор емкостью 100 л и вносят туда 350 мл раствора фосфорной кислоты. Смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 50^o, вносят в нее 8,4 л 20%-ной суспензии однозамещенного фосфата кальция и нагревают при той же температуре и при перемешивании еще 1 ч. Суспензию фильтруют через бельтинг-ткань под вакуумом. Получают 8,6 кг осадка с влажностью 55% и 73,6 л фильтрата с концентрацией тилозина 6,2 г/л.

Фильтрат подщелачивают до значения pH 9,5 и со скоростью 30 л/ч пропускают через замкнутую систему с электродиализатором, состоящим из 5 параллельно соединенных стандартных ячеек, при напряжении 10-20 В и силе тока 2 А. Через 5,5 ч содержание катионов в циркулирующем растворе снизилось с 0,15 до 0,01 моль/л.

75 л обессоленного раствора с содержанием тилозина 5,7 г/л и pH 6,5 со скоростью 15 л/ч пропускают через ионообменную колонку объемом 5 л, диаметром 8 см и высотой 1 м, загруженную слабокислотным катионитом КБ-2Э в смешанной натрий-водородной форме.

Элюацию тилозина с колонки осуществляют пропусканием через нее со скоростью 2 л/ч 6 л 1 н. раствора однозамещенного фосфата натрия с pH 9,5. Появление в элюате тилозина определяют спектрофотометрически при длине волны 283 нм. Отбор активных фракций начинают при значении экстинции 2,0. В процессе элюации значение экстинции резко возрастает, достигая максимальной величины 2200, а затем снижается. Первая фракция элюата имеет объем 7,5 л и содержит 42,6 г/л фосфата тилозина и 39,4 г/л неорганических фосфатов.

Полученную фракцию обогащенного тилозином элюата высушивают распылительным методом и получают 634 г препарата фосфата тилозина с влажностью 3% и содержанием тилозина 50,3%. Выход тилозина составляет 65% содержания в культуральной жидкости.

Полученный продукт представляет собой светло-золотистый негигроскопичный порошок, полностью растворяющийся в воде.

После отделения обогащенной тилозином фракции элюата процесс элюации продолжают и заканчивают процесс при снижении экстинции до значения 3,0. Эта фракция элюата имеет объем 6,7 л и содержит 12 г/л фосфата тилозина и 83 г/л неорганических фосфатов.

Пример 2. Культуру штамма Str.fraliae ВНИИгенетика-25С высевают в ферментер емкостью 100 л, заполненный питательной средой, содержащей (мас.%) муку пшеничную (1,5), глутен кукурузный (1,0), мелассу свекловичную (2,5), дрожжи БВК (0,25), однозамещенный фосфат аммония (0,2), масло соевое (1,0), мел (0,2) и воду водопроводную (до 100,0). В процессе ферментации для пеногашения добавляют еще 2,0% соевого масла. Процесс ферментации ведут, как описано в примере 1.

После завершения процесса ферментации получают 61 л культуральной жидкости, содержащей 7,5 г/л тилозина. Культуральную жидкость подвергают коагуляции и фильтрации, как описано в примере 1. В результате отделения осадка получают 64 г фильтрата культуральной жидкости, содержащего 6,8 г/л тилозина. Фильтрат обессоливают путем его пропускания со скоростью 30 л/ч через систему из 10 ионообменных колонок, загруженных анионитом АВ-17 в гидроксильной форме и катионитом Ку 2 х 20 в водородной форме. Колонки с анионитом и катионитом расположены последовательно. Жидкость вытесняют с колонок дистиллированной водой.

Фракцию, содержащую тилозин, определяют спектрофотометрически при длине волны 283 нм. Собирают раствор, имеющий значения экстинции от 2,0 (в начале процесса) до 3,0 (после достижения максимального значения экстинции и ее снижения). Содержание неорганических солей контролируют по электропроводности раствора. Обессоленный раствор содержит 5,8 г/л тилозина и 0,005 моля/л неорганических фосфатов, что соответствует значению электропроводности 0,2 мС. 71 л обессоленного раствора пропускают со скоростью 20 л/ч через ионообменную колонку диаметром 8 см и высотой 100 см, заполненную слабокислотным катионитом КБ-2Э в смешанной натрий-водородной форме. Раствор вытесняют с колонки водой, и при этом весь тилозин сорбируется на катионите, элюацию тилозина проводят с помощью 6 л 1 М раствора двузамещенного фосфата натрия, который пропускают снизу со скоростью 3 л/ч. Содержание тилозина в элюате контролируют спектрофотометрически при длине волны 283 нм. Собирают элюат, характеризующийся экстинцией от 2,0 (в начале процесса) до 3,0 (после достижения максимума экстинции и ее снижения). Всего было собрано 14,2 л элюата, содержащего 27,5 г/л тилозина и 48,6 г/л неорганических фосфатов. Значение pH элюата составляло 6,8. Элюат высушивают досуха на распылительной сушилке.

Было получено 1026 г светло-золотистого негигроскопичного порошка с влажностью 4%, содержащего 34,7% фосфата тилозина и 60,5% неорганических фосфатов. Выход тилозина составляет 78,0% от содержания в культуральной жидкости.

Таким образом, наглядно показаны преимущества предложенного способа получения тилозина перед известными способами.

Источники информации

1. Гарбузов А.В., Грешных К.П., Эльбирт Г.М. и др. Препараты антибиотиков и витаминов для животноводства. - М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР. Вып.1 1991 - 52 с.

2. Авт. свид. НРБ N 20.697, кл. C 12 D 9/16, 1978.

3. Патент США N 3178341, кл. 424-120, 1965.

4. Патент США N 4568740, кл. C 07 H 17/08, 1986. - прототип.