способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием
Классы МПК: | A61K49/00 Препараты для исследований на живом организме B01J13/04 физическими способами, например сушкой, распылением |
Автор(ы): | Эндрю Дерек Саттон[GB], Ричард Алан Джонсон[GB], Питер Джеймс Синиор[GB], Дэвид Хит[GB] |
Патентообладатель(и): | Андарис Лимитед (GB) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1992-04-10 публикация патента:
27.04.1998 |
Способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, включает стадию распыления в нагретой газовой среде раствора или дисперсии материала, способного к образованию стенок микрокапсул, в жидком носителе. Затем жидкий носитель испаряется. Раствор или дисперсию используют в концентрации от 0,1 до 50 мас.%/объем. Подают на стадию распылительной сушки под давлением (1 - 10)
105Па. Газ нагревают до достижения температуры на входе в камеру распылительной сушки 100 - 250oС, а на выходе - 40 - 150oС. Полученные полые микрокапсулы можно дополнительно обрабатывать для уменьшения их водорастворимости по меньшей мере с внешней стороны капсул путем нагревания или облучения или химической сшивки. В качестве материала, способного к образованию стенок микрокапсул, используют белок, например коллаген или желатин или сывороточный альбумин. Полученные полые микрокапсулы используют для визуализации при ультразвуковой диагностике. 6 с. и 10 з.п.ф-лы, 3 ил., 2 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
Формула изобретения
1. Способ получения диагностического средства, содержащего микрокапсулы, включающий стадию распыления в нагретой газовой среде раствора или дисперсии материала, способного к образованию стенок микрокапсул, в жидком носителе, с последующим испарением жидкого носителя, отличающийся тем, что раствор или дисперсию материала, способного к образованию стенок микрокапсул, используют в концентрации 0,1 - 50 мас.%/объем и подают на стадию распылительной сушки под давлением (1 - 10) х 105Па, а газ нагревают до достижения температуры на входе в камеру распылительной сушки 100 - 250oС, а на выходе 40 - 150oС, причем полученные микрокапсулы являются полыми. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученные полые микрокапсулы дополнительно обрабатывают для уменьшения их водорастворимости по меньшей мере с внешней стороны капсул путем нагревания, или облучения, или химической сшивки. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве материала, способного к образованию стенок микрокапсул, используют белок. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве белка используют коллаген, или желатин, или сывороточный альбумин. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве сывороточного альбумина используют альбумин сыворотки человека, или его аналог, или его фрагмент, полученный с использованием методик рекомбинантных ДНК. 6. Способ по любому из пп.3 - 5, отличающийся тем, что раствор или дисперсию белка используют в концентрации 10 - 30 мас.%/объем. 7. Способ по любому из пп.3 - 6, отличающийся тем, что раствор или дисперсию белка распыляют при условиях, изложенных в п.1, с получением дискретных микрокапсул диаметром 0,01 - 50,0 мкм. 8. Способ по любому из пп.3 - 7, отличающийся тем, что получают микрокапсулы, содержащие 96 - 98% мономерного белка. 9. Способ по любому из пп.3 - 6, отличающийся тем, что получают микрокапсулы при условиях, изложенных в п.2, с содержанием не более 5% мономерного белка. 10. Способ по любому из пп.2 - 7, отличающийся тем, что стадию дополнительной обработки микрокапсул проводят одновременно со стадией распылительной сушки согласно п.1. 11. Полые микрокапсулы, отличающиеся тем, что они получены при осуществлении способа по любому из пп.1 - 10, более 30% микрокапсул имеют диаметр в пределах 2 мкм и по меньшей мере 90% микрокапсул имеют диаметр в пределах 1 - 8 мкм. 12. Полые микрокапсулы, отличающиеся тем, что они получены при осуществлении способа по любому из пп.1 - 10, среднеквадратичный интервал диаметров составляет 2 мкм и менее, а среднее значение диаметра находится в пределах 2 - 8 мкм. 13. Полые микрокапсулы с белковыми стенками, отличающиеся тем, что они получены при осуществлении способа по любому из пп.2 - 10, по меньшей мере 90% микрокапсул имеют диаметр в пределах 1,0 - 8,0 мкм, по меньшей мере 90% микрокапсул имеют толщину стенок в пределах 40 - 500 нм и по меньшей мере 50% белка в стенках микрокапсул подвергнуто сшиванию и не экстрагируется при действии 1%-ной соляной кислоты в течение 2 мин. 14. Микрокапсулы по п.13, отличающиеся тем, что по меньшей мере 95% белка в стенках микрокапсул подвергнуто сшиванию и не экстрагируется при действии 1%-ной соляной кислоты в течение 2 мин. 15. Полые микрокапсулы, отличающиеся тем, что они получены при осуществлении способа по любому из пп.1 - 10, имеют диаметр 1 - 10 мкм и по меньшей мере 10% микрокапсул при суспендировании в воде способны выдерживать в течение 0,25 с давлении 2,66 х 104 Па без разрыва, разрушения или заполнения их водой. 16. Способ ультразвуковой диагностики с получением изображения для последующего изучения, включающий введение в тело млекопитающего путем парентеральной инъекции суспензии микрокапсул в водном жидком носителе, облучение млекопитающего или его части ультразвуковым излучением и детектирование отраженного, или проходящего, или резонансного, или модулированного по частоте микрокапсулами ультразвукового излучения, отличающийся тем, что вводят суспензию микрокапсул с характеристиками, изложенными в любом из пп.11 - 15, при концентрации микрокапсул 1,0 х 105 - 1,0 х 1012 частиц/мл водного жидкого носителя.Описание изобретения к патенту
Настоящее изобретение относится к способу получения диагностических средств, содержащих полые (в частности, белковые) микрокапсулы и предназначенных для улучшения визуализации при помощи ультразвука. Тот факт, что пузырьки воздуха в теле человека могут использоваться в электрокардиографии, известен уже достаточно давно. Для этой цели можно вводить в поток крови жидкости, содержащие пузырьки (см. статью Офира с сотр. в "UItrasonic Imaging" 2, 67 - 77 (1980)), авторы которой стабилизировали пузырьки в коллагеновой мембране, патент США N 4446442 ( на имя Шеринга) и Европейскую патентную заявку EP-131540 (также на имя Шеринга) и Европейские патентные заявки EP-224934 и EP-324938, в которых описано использование пузырьков, полученных обработкой ультразвуком раствора альбумина. Однако распределение пузырьков по размерам явно не поддается контролю и пузырьки исчезают в случае, когда они подвергаются давлению, имеющемуся в левом желудочке сердца (см. Шапиро с сотр. J. Am. CoII. Cardiology 16(7), 1603 - 1607 (1990)). В Европейской патентной заявке EP-52575 описано применение для этой же цели твердых частиц, которые содержат захваченный ими газ, причем указанный газ выделяется из частиц в потоке крови. В Европейской патентной заявке EP-458745 описан способ получения наполненных газом или воздухом микрошариков посредством межфазной полимеризации синтетических полимеров, например полилактидов и полигликолидов. В патентной заявке WO-0-61/12823 (на имя фирмы "Дельта") описан аналогичный способ с использованием альбумина. Уитли с сотр. (Biomaterials 11.713-717 (1990)) описан способ ионотропного гелеобразования альгината с получением микропузырьков диаметром свыше 30 мкм. В патентной заявке WO-91/09629 описано использование липосом в качестве контрастного агента при ультразвуковой диагностике. Авторами данного изобретения обнаружено, что способ распыления раствора агента, способствующего образованию микрокапсул с последующим переводом получаемых микрокапсул в нерастворимое состояние, приводит к получению продукта с улучшенными свойствами. Пжиборовский с сотр. (Eur. J. NucI. Med, 7,71-72 (1982)) описали способ получения микрошариков из альбумина из сыворотки человека (АСЧ) посредством сушки при распылении для введения радиоактивной метки и последующего использования при сцинтиграфической визуализации состояния легких. При этом не указано, что микрошарики полые, а при воспроизведении данного способа авторами настоящего изобретения были получены только твердые микрошарики. Однако если шарики не являются полыми, то они не могут использоваться при эхокардиографии. Кроме того, микрошарики получают согласно одностадийному способу, который авторы настоящего изобретения нашли непригодным для получения микрокапсул, пригодных для эхокардиографии, при использовании указанного способа согласно имеющемуся уровню техники необходимо удалять из микрокапсул несденатурированный альбумин (чего не нужно делать при использовании способа согласно настоящему изобретению) и при этом получают микрошарики с широким диапазоном размеров, в результате чего необходима дополнительная стадия просеивания. Однако способ Пжиборовского с сотр. не только не является очевидным в случае выбора способа для получения микрокапсул, пригодных для визуализации при ультразвуковой диагностике, но и частицы, получаемые в соответствии с ним, не пригодны для этой цели. Авторами данного изобретения предложены значительные улучшения по сравнению с этим способом согласно имеющемуся уровню техники. В статье Пжиборовского с сотр. приведено описание двух более ранних способов получения частиц альбумина для сцинтиграфии легких. Олдричем и Джонстоном (Inf. J. AppI. Pad. Isof. 25, 15 - 18, (1974)) описано использование вращающегося диска для получения частиц диаметром 3 - 70 мкм, которые денатурируют в горячем масле. Затем масло удаляют и частицы метят радиоизотопами. Раджу с сотр. (Isotopenpraxis 14(2), 57 - 61 (1978)) использовали тот же способ, однако денатурирование альбумина осуществляли посредством простого нагревания частиц. Ни в одном из указанных случаев не содержится упоминания о полых микрокапсулах, и получаемые согласно имеющемуся уровню техники частицы не пригодны для эхокардиографии. Один из аспектов настоящего изобретения предусматривает способ, включающий первую стадию распыления раствора или дисперсии материала, способного образовывать стенки капсул, с целью получения микрокапсул. Предпочтительно полученный таким способом продукт подвергают на второй стадии обработке с уменьшением его растворимости в воде по крайней мере извне по отношению к указанным микрокапсулам. Указанные две стадии могут осуществляться в виде единого процесса, или же промежуточный продукт после первой стадии можно собрать и отдельно обработать на второй стадии. Эти две возможности ниже упоминаются как одностадийный или двухстадийный способ. Материал, способный к образованию стенок, и условия осуществления способа должны быть подобраны таким образом, чтобы продукт был практически нетоксичным и неиммуногенным при условиях его использования, что совершенно очевидно зависит от вводимой дозы и продолжительности обработки. Материал, способный к образованию стенок, может представлять собой производное крахмала, синтетический полимер, например трет-бутилоксикарбонилметилполиглютамат (согласно патенту США N 4883398), или полисахарид, например полидекстрозу. Обычно материал, способный к образованию стенок, можно выбирать из числа наиболее гидрофильных, биоразлагаемых, физиологически совместимых полимеров. В число подобных полимеров входят полисахариды с низкой растворимостью в воде, полилактиды и полигликолиды и их сополимеры, сополимеры лактидов и лактонов, например![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109125/949.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109010/948.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109010/948.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109008/947.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109007/946.gif)
-(NH-CHA-CO)x(NH-CHX-CO)y
в которой X представляет собой боковую цепь аминокислотного остатка, а A представляет собой группу формулы -(CH2)nCOOR1R2COCOR (II), в которой R1 и R2 представляют собой атом водорода или низшие алкилы, а R представляет собой алкильный или ароматический радикал, или R и R1 могут быть связаны между собой посредством замещенного или незамещенного связующего фрагмента с образованием 5- или 6-членного кольца. A может также представлять собой группу общей формулы:
-(CH2)nCOO-CHR1COOR (I) и
-(CH2)nCO(NH-CHX-CO)mNH-CH-(COOH)- (CH2)pCOOH (III)
и соответствующие ангидриды. Во всех указанных формулах n, m и p представляют собой небольшие целые числа (не превышающие 5), а x и y также представляют собой целые числа, соответствующие молекулярным весам не менее 5000. Отмеченные выше полимеры пригодны для получения микрошариков согласно настоящему изобретению, причем в зависимости от природы заместителей R, R1, R2 и X свойства стенок могут регулироваться по таким параметрам, как, например, прочность, эластичность и способность к биоразложению. Так, например, X может представлять собой метил (аланин), изопропил (валин), изобутил (лейцин и изолейцин) и бензил (фенилаланин). Предпочтительно способный к образованию стенок материал имеет белковую природу. Так, например, он может представлять собой коллаген, желатин и (сывороточный) альбумин, причем в каждом из случаев предпочтительно человеческого происхождения (т. е. полученные у человека или соответствующие по структуре человеческому белку). Наиболее предпочтительно он представляет собой альбумин сыворотки человека (АСЧ), полученный из донорской крови, или, в идеальном случае, в результате ферментации микроорганизмов (включая линии клеток), которые предварительно трансформируют или трансфецируют для экспрессии альбумина человека. Способы экспрессии альбумина человека (термин, который включает также аналоги и фрагмента альбумина человека, например описанные в Европейской патентной заявке EP-322094, и полимеры мономерного альбумина) описаны, например, в Европейской патентной заявке EP-201239 и Европейской патентной заявке EP-286424, которые включены в данное описание в качестве справочного материала. "Аналоги и фрагменты" альбумина сыворотки человека включают все полипептиды (I), которые способны к образованию микрокапсул согласно настоящему изобретению и (II), у которых непрерывная область аминокислотной последовательности (составляющая по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 90% и 96%) является по меньшей мере на 80% гомологичной (предварительно по меньшей мере на 90%, 95% или 99% гомологичной) с непрерывной областью альбумина сыворотки человека (составляющей по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 90% или 95%). Особенно предпочтительным является альбумин сыворотки человека, полученный способом рекомбинантных ДНК. Таким образом альбумин сыворотки человека может быть получен в результате экспрессии кодирующей альбумин сыворотки человека нуклеотидной последовательности в дрожжах или другом микроорганизме, с последующей очисткой продукта в соответствии с известными способами. Подобный материал не содержит жирных кислот, содержащихся в материалах, полученных из сыворотки. Предпочтительно альбумин сыворотки человека должен практически не содержать жирных кислот, т.е. содержать их в количестве менее 1% от уровня содержания жирных кислот в материалах, полученных из сыворотки. Предпочтительным является случай, при котором жирные кислоты в альбумине сыворотки человека не могут быть обнаружены. При последующем описании предпочтительных вариантов используется термин "белок", поскольку белок является предпочтительным согласно настоящему изобретению, однако следует понимать, что можно использовать и прочие описанные выше биосовместимые материалы, способные к образованию стенок. Раствор или суспензия белка предпочтительно имеет концентрацию от 0,1 до 50% (мас/объем), более предпочтительно - содержит от примерно 5,0 до 25,0% белка, в особенности в тех случаях, когда белок представляет собой альбумин. Концентрация около 20% является оптимальной. Можно использовать также смеси материалов, способных к образованию стенок, в этом случае проценты в последних двух предложениях относятся к общему содержанию материалов, способных к образованию стенок. Композиция для распыления может содержать вещества, отличные от материалов, способных к образованию стенок, и растворителя или жидкого носителя. Так водная фаза может содержать 1 - 20 мас.% водорастворимых гидрофильных соединений, например сахаров и полимеров в качестве стабилизаторов, включая, например, поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), полиэтиленгликоль (ПЭГ), желатин, полиглютаминовую кислоту и полисахариды, например крахмал, декстран, агар-агар, ксентан и им подобные агенты. Аналогичные водные фазы можно использовать в качестве жидкого носителя, в котором конечный продукт в виде микрошариков суспендируют перед использованием. Можно применять эмульгаторы (в количестве 0,1 - 5 мас.%), включая наиболее пригодные с физиологической точки зрения эмульгаторы, например яичный лецитин или соевый лецитин, или синтетические лецитины, например насыщенные синтетические лецитины, в частности димиристоилфосфатидилхолин, дипальметоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин, или ненасыщенные синтетические лецитины, в частности диолеилфосфатидилхолин или дилинолеилфосфатидилхолин. В число эмульгаторов входят также поверхностно-активные средства, например свободные жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот и полиоксалкиленовых производных, например полиоксипропиленгликоля и полиоксиэтиленгликоля, простые эфиры жирных спиртов и полиоксиалкиленгликолей, сложные эфиры жирных кислот и полиоксиалкилированного сорбита, мыла, глицерин-полиалкиленстеарат, глицерин-полиоксиэтиленрицинолеат, гомополимеры и сополимеры полиалкиленгликолей, полиэтоксилированные соевое масло и касторовое масло, а также гидрогенизированные производные, простые и сложные эфиры сахарозы или других карбогидратов с жирными кислотами, жирными спиртами, которые могут быть дополнительно полиоксиалкилированными, моно-, ди- и триглицериды насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, глицериды соевого масла и сахарозы. Добавки можно вводить в состав стенок микрошариков с целью модификации таких физических свойств, как способность образовывать дисперсии, эластичность и водопроницаемость. В числе полезных добавок можно отметить соединения, которые могут "гидрофобизовать" стенки с целью уменьшения водопроницаемости, например жиры, воски и высокомолекулярные углеводороды. Добавки, которые улучшают дисперсионную способность микрошариков в предназначенном для инъекций жидком носителе, представляют собой амфифатические соединения, например фосфолипиды, они также увеличивают водопроницаемость и скорость биораспада. Добавки, которые увеличивают эластичность стенок, представляют собой пластификаторы, например изопропиилмиристат и ему подобные вещества. Другая группа также очень полезных добавок состоит из полимеров, родственных полимерному материалу стенок, но имеющих низкий молекулярный вес. Так, например, при использовании сополимеров производных полимолочной/полигликолевой кислот в качестве материала для образования стенок свойства указанных стенок могут быть улучшены (в отношении мягкости и биоразложимости) посредством введения в качестве добавок полигликолидов или полиактидов низкого молекулярного веса (от 1000 до 15000 Дальтонов). Полезной смягчающей добавкой является также полиэтиленгликоль среднего или низкого молекулярного веса (например, ПЭГ-2000). Количество добавок, вводимых в стенки, может меняться в широких пределах и зависит от конкретной необходимости. В некоторых случаях добавки не требуются вообще, в других случаях количества добавки могут достигать примерно 20 мас.% от веса стенок. Раствор или дисперсия (предпочтительно раствор) белка, который в дальнейшем в данном описании упоминается как "белковый препарат", распыляют и сушат при распылении с использованием любого подходящего способа, который приводит к получению отдельных микрокапсул диаметром 1,00 - 50,0 мкм. Этим значениям должны соответствовать по меньшей мере 90% всех микрокапсул, измерение диаметра осуществляют посредством устройства "Каултер" Мастер Сайзер 11". Термин "микрокапсулы" относится к полым частицам, окружающим определенное пространство, которое заполнено газом или паром, но не содержит каких-либо твердых материалов. Ячеистые частицы, напоминающие кондитерские изделия, производимые в Великобритании под фирменным названием "Мальтезерс", при этом не образуются. Необходимость в том, чтобы внутреннее пространство было полностью закрыто, отсутствует (хотя это и является предпочтительным), также не является необходимым, чтобы микрокапсулы имели точно сферическую форму, хотя обычно они являются шариками. В случае, если микрокапсулы не имеют сферической формы, указанные выше значения диаметров относятся к диаметру, соответствующему сферической микрокапсуле, имеющей ту же массу и окружающей тот же объем полости, что и несферическая микрокапсула. Распыление включает образование аэрозоли белкового препарата, например, в результате пропускания указанного препарата через по меньшей мере одну фильеру под давлением внутрь (или при использовании центробежного распылителя - непосредственно в) камеры с теплым воздухом или другим инертным газом. Указанная камера должна быть достаточно большой для того, чтобы самые большие из введенных в нее капель не ударялись о стенки до того, как они высохнут, газ или пар в камере должен быть чистым (предпочтительно стерильным и не содержащим пирогенных компонентов) и нетоксичным при введении в поток крови в количествах, соответствующих тем, в которых он вводится в микрокапсулах при эхокардиографии. Скорость испарения жидкости из белкового препарата должна быть достаточно высокой для того, чтобы образовывались полые микрокапсулы, но не настолько высокой, чтобы эти микрокапсулы разрывались. Скорость испарения можно контролировать посредством изменения скорости потока газа, концентрации белка в белковом препарате, изменения природы жидкого носителя скорости подачи раствора и, что наиболее важно, посредством изменения температуры газа, захватываемого аэрозолем. При концентрации альбумина в воде, равной 15 - 25%, входная температура газа, равная по меньшей мере примерно 100oC, предпочтительно по меньшей мере примерно 110oC, обычно достаточна для того, чтобы обеспечить образование полостей, причем температура может достигать 250oC без разрыва капсул. Оптимальным значением, по крайней мере для альбумина, является температура в пределах от 180 до 240oC, предпочтительно в пределах от 210 до 230oC, и наиболее предпочтительно - около 220oC. При одностадийном варианте способа согласно настоящему изобретению температура может быть достаточной для перевода в нерастворимое состояние по меньшей мере части (обычно с внешней части) материала для образования стенок, а часто и практически всего указанного материала без образования стенок. Поскольку температура газа, захваченного аэрозолем, зависит также от скорости, с которой происходит подача аэрозоля, и от содержания жидкости в белковом препарате, может быть необходимым контроль за температурой на выходе, чтобы обеспечить надлежащую температуру в камере. Выходная температура в 40 - 150oC является при этом подходящей. Если рассмотреть прочие факторы, то следует отметить, что регулирование скорости потока является не столь полезным, как контроль остальных параметров процесса. При осуществлении двухстадийного варианта способа получаемые на промежуточном этапе микрокапсулы обычно содержат 96 - 98% мономерного альбумина сыворотки человека и имеют ограниченное время жизни in vivo для цели визуализации при ультразвуковом тестировании. Однако их можно либо непосредственно использовать для визуализации при ультразвуковом тестировании, либо сохранять и транспортировать перед осуществлением второй стадии двухстадийного варианта способа согласно настоящему изобретению. Такой вариант также является одним из аспектов изобретения. На второй стадии способа получаемые на промежуточном этапе микрокапсулы закрепляют и делают их менее водорастворимыми, в результате чего они становятся пригодными более долгое время, поскольку они не столь хорошо растворимы в воде, и более инертными, поскольку они не обладают свойствами биоразлагаемости. На данной стадии происходит также упрочнение микрокапсул таким образом, что они приобретают способность противостоять внешним воздействиям при введении, а также сжатию в сосудистой системе и давлению крови в желудочке сердца. Если микрокапсулы разрываются, то они дают менее интенсивный сигнал. Шнайдер с сотр. Invest Radiol, 26, 134-139 (1992) показали, что микрошарики из альбумина согласно имеющемуся уровню техники, используемые для визуализации при ультразвуковом тестировании, не обладают должной прочностью и быстро теряют способность давать сигнал в случае, когда они подвергаются давлениям, типичным для левого желудочка сердца. Вторая стадия способа может протекать с использованием тепла (например, микроволнового излучения, обычного теплового излучения или горячего воздуха), ионизирующего излучения (например, при дозе гамма-излучения 10,0 - 100,0 кГрей), или химической сшивки с использованием, например, формальдегида, глютаральдегида, окиси этилена или прочих средств сшивки белка, ее осуществляют с использованием практически сухих микрокапсул, полученных на первой стадии, или суспензии указанных микрокапсул в жидкости, в которой они нерастворимы, например в подходящем растворителе. При одностадийном варианте способа согласно настоящему изобретению сшивающий агент, например глютаральдегид, можно распылять в камере для сушки распылителя или же можно вводить в белковый препарат непосредственно перед устройством для распыления. В альтернативном варианте температура в камере может быть достаточно высокой для того, чтобы сделать микрокапсулы нерастворимыми. Целевой продукт при его измерении тем же способом, что и в случае промежуточных микрокапсул, может при желании состоять из микрокапсул, имеющих диаметр в пределах от 0,05 до 50,0 мкм, однако при использовании способа согласно настоящему изобретению могут достигаться диапазоны размеров от 0,1 до 20,0 мкм и особенно предпочтительный с точки зрения использования для эхокардиографии диапазон от 1,0 до 8,0 мкм. Авторами найдено, что размер частиц в пределах от примерно 0,5 до 3,0 мкм может оказаться наиболее предпочтительным для получения малоконтрастного изображения и для использования при получении допплеровского цветного изображения, тогда как размер в пределах от примерно 4,0 до 6,0 мкм может дать лучшие результаты при получении контрастных изображений. Необходимо принимать во внимание тот факт, что вторая стадия обработки может изменять размер микрокапсул, полученных на первой стадии способа. Обнаружено, что способ согласно настоящему изобретению можно регулировать при его осуществлении с целью получения микрокапсул с желаемыми характеристиками. Так давление, при котором осуществляется подача раствора белка в фильеру распылителя, может меняться, например, в пределах 1,0 - 10,0
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
На второй стадии способа 5 г микрокапсул нагревают в стеклянном стакане с использованием сушильного шкафа "Галленкамп". Температура 175oC в течение 1 ч. является достаточной для получения микрокапсул со 100%-ной фракцией, о чем свидетельствуют данные ЖХВД. Эффект указанной фиксации состоит в увеличении in vitro времени половинного гашения отражательной способности (способности давать эхосигнал) с нескольких секунд до свыше 30 мин. При изменении температуры и продолжительности выдерживания можно изменять степень фиксации от примерно 5 до 100%. Примеры профилей термической фиксации при различных температурах приведены на фиг. 2. После термической фиксации микрокапсулы дезагломерируют и диспергируют в воде одним из двух способов. Способ 1 включает вначале смешивание зафиксированных термическим способом шариков с равным по весу количеством тонкоизмельченной лактозы (средний размер частиц 5 мкм). Полученную смесь затем пропускают через центробежную мельницу "фритч" с ситом 0,5 мм и 12-зубчатым ротором. Измельченные шарики собирают и пропускают через мельницу во второй раз для того, чтобы иметь уверенность в том, что смешивание закончено. Измельченный порошок затем вновь переводят в суспензию в воде, содержащей 1 мг/мл "Плюроник" F-86". Обычно 10 г микрокапсул и лактозы добавляют к 100 мл воды и "Плюроник F-86". Второй способ дезагломерации включает добавление 5 г зафиксированных термическим способом микрокапсул к 100 мл воды, содержащей 100 мг "Плюроник F-86". Микрокапсулы диспергируют с использованием гомогенизатора "Сильверсон" (модель L-4R с 2,54-см кольцевым гомогенизационным зондом и ситом с высокой срезающей способностью) и гомогенизируют в течение 60 с. Вновь переведенные в суспензию шарики разделяют на неповрежденные (содержащие газ) и разрушенные шарики с использованием способа флотации. Содержащие газ шарики всплывают на поверхность в течение 1 ч., их декантируют от нижней фазы, которая не содержит необходимого газа. Процесс разделения можно ускорить посредством центрифугирования. Центрифугирование в течение 30 с при 5000g достаточно для разделения двух фракций. После разделения целые микрокапсулы сушат при замораживании в присутствии лактозы и "Плюроник F-86". Оптимальные условия для сушки при замораживании включает перевод в суспензию 30 мг микрокапсул в 5 мл воды, содержащей 50 мг лактозы и 5 мг "Плюроник F-86". Высушенные при замораживании микрокапсулы можно вновь переводить в дисперсию в жидкости (например, воде, солевом растворе) с получением монодисперсного распределения. Пример 2. Повторяют процесс согласно примеру 1 с небольшими изменениями на первой стадии: вместо сопла для распыления в двух жидких средах используют центробежный распылитель, температура на входе составляет 150oC (при том, что температура воздуха на выходе все еще поддерживают на уровне 105oC), и сжатый воздух подают в сопло при давлении 1,0-6,0
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
При этом регистрируют высоты пиков, соответствующих мономерному альбумину сыворотки человека, и используют полученные данные для определения концентрации мономера с применением кривой для стандартов мономерного альбумина сыворотки человека в пределах концентрации от 1 до 10 мг/мл. Процент свободного мономерного альбумина сыворотки человека рассчитывают посредством измерения концентрации мономера в зафиксированных микрокапсулах и выражения полученного значения в виде процентной доли от концентрации мономера в незафиксированных микрокапсулах. Полученные результаты приведены на фиг. 2. Нагревание высушенных при распылении микрокапсул в печи (как это описано в примере 1) приводит к уменьшению детектируемого количества мономера (фиг. 2). Это уменьшение детектируемого количества мономерного альбумина сыворотки человека обусловлено денатурированием и сшивкой мономерного альбумина сыворотки человека с получением нерастворимых полимеров, которые не могут быть обнаружены посредством описанного выше метода ЖХВД. При использовании метода ЖХВД для наблюдения за уровнем содержания альбумина сыворотки человека из приведенных на фиг. 2 данных видно, что спустя 15 мин выдерживания в микрокапсулах из альбумина сыворотки человека более не содержится мономерного альбумина сыворотки человека. Однако остается возможность для образования дальнейших сшивок в микрокапсулах из альбумина сыворотки человека при дальнейшем нагревании. Подобное продолжительное нагревание приводит к увеличенному содержанию сшивок в микрокапсулах, которое, в свою очередь, приводит к увеличению их прочности, что делает микрокапсулы более устойчивыми к воздействию давления. При тщательном регулировании температуры и времени выдерживания можно получать микрокапсулы с регулируемой степенью сшивки (и соответственно способностью противостоять воздействию давления). Пример 9. Влияние времени выдерживания при 175oC на способность микрокапсул из альбумина сыворотки человека противостоять воздействию давления. Партию микрокапсул из альбумина сыворотки человека разделяют на аликвоты по 5 г и прогревают при 175oC на протяжении различных промежутков времени, получая зависимость, приведенную на фиг. 3. После термической фиксации определяют количество свободного мономера согласно описанному в примере 8 способу. Для каждого из времен обработки, приведенных на фиг. 3, не удается обнаружить детектируемое количество мономерного альбумина сыворотки человека. Зафиксированные термическим способом микрокапсулы подвергают дезагрегации с использованием центробежной мельницы "Фритч" (согласно описанному выше способу), целые микрокапсулы, содержащие воздух, отделяют описанным ранее методом флотации. Отделенные микрокапсулы переводят в суспензию в воде, содержащей "Плюроник F-86" (1 мг/мл) при концентрации 0,5
![способ получения диагностического средства, содержащего полые микрокапсулы, полые микрокапсулы (варианты) и способ диагностики с их использованием, патент № 2109521](/images/patents/362/2109012/183.gif)
Класс A61K49/00 Препараты для исследований на живом организме
Класс B01J13/04 физическими способами, например сушкой, распылением