способ получения антигена для диагностики сапа в реакции агглютинации

Формула изобретения

1. Способ получения антигена для диагностики сапа в реакции агглютинации, включающий выращивание культуры возбудителя сапа на синтетической питательной среде, инактивацию, подготовку бактерийной массы для диагностикума, окрашивание бакмассы, отличающийся тем, что культуру возбудителя сапа выращивают на питательной среде Курской биофабрики, а подготовку бактерийной массы для диагностикума осуществляют диафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранах с размером пор 0,1 - 0,22 мкм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуру возбудителя выращивают в течение 10 - 14 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, в частности к способу получения диагностикума - антигена для обнаружения противосапных антител в сыворотке крови инфицированных животных.

Известны антигены для обнаружения сапных антител в сыворотке крови инфицированных животных в реакциях преципитации, агглютинации, реакции связывания комплемента (РСК). Все антигены представляют собой инактивированные бактерии возбудителя сапа или различные фракции, выделенные из бактериальных клеток (Дедюлин А.В. К серодиагнозу сапа. Архив вет. наук, 1890; Владимиров А. А. Об агглютинации бактериальными фильтрами сапных культур. Мед. обозрение, 1900; Инструкция по изготовлению и контролю сапного антигена. Утв. ГУВ МСХ СССР 17.08.84).

Применение вышеуказанных антигенов в известных методиках связано с длительностью постановки реакций, низкой эффективностью и сложностью в практическом использовании.

В настоящее время в ветеринарной практике для выявления противосапных антител используют методику постановки реакции связывания комплемента.

Антиген для РСК получают согласно "Инструкции по изготовлению и контролю антигена сапного для РСК", утвержденной ГУВ МСХ СССР от 17.08.84.

Указанный антиген представляет собой экстракт инактивированных бактерий P. mallei, выращенных в течение 3 - 4 сут. на мясо-пептонном глицериновом агаре (МПГА). Постановку реакции с использованием данного антигена ведут в течение 18 - 20 ч. Выполнение РСК требует специального лабораторного оборудования. Кроме того, по существующей технологии в антиген попадают белки МПГА, что сказывается на появлении неспецифических реакций при постановке РСК.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигнутому результату является способ изготовления антигена для диагностики сапа по патенту N 1837889.

Способ, изложенный в вышеуказанном патенте, предусматривает наращивание бактерийной массы на среде Сотона в течение 15 - 30 дней, инактивацию бактерий автоклавированием, удаление балластных растворимых антигенов центрифугированием и окрашивание клеток бактерий органическим красителем. Получаемый этим способом антиген используют в реакции пластинчатой агглютинации, которая представляет собой вариант экспресс-метода.

Питательная среда Сотона не является оптимальной синтетической питательной средой для наращивания бактериальной массы P.mallei и не обеспечивает активного ее накопления. Продолжительность наращивания бакмассы достаточно велика (15 - 30 дней), что приводит к старению культуры, аутолизу бактерий, значительным потерям клеток в осадке после автоклавирования, снижению диагностической ценности антигена. Кроме того при центрифугировании взвеси бактерий осадок бакмассы необходимо неоднократно ресуспендировать, что приводит к нарушению целостности бактериальных клеток и к снижению активности диагностикума.

Методика, описанная в патенте N 1837889, является лабораторной, нетехнологичной для изготовления промышленных серий антигена.

Целью настоящего изобретения является разработка промышленного способа изготовления антигена для диагностики сапа с более высокими качественными характеристиками.

Подставленная цель достигается использованием синтетической питательной среды Курской биофабрики, уменьшением длительности выращивания культуры бактерий, применением диафильтрации с целью освобождения от растворимых балластных антигенов и концентрирования бактерий.

Первым и наиболее важным этапом изготовления антигена является получение необходимого количества типичной по своим морфологическим и антигенным свойствам бактерийной массы.

Авторы предлагают использовать для культивирования бактерий синтетическую питательную среду Курской биофабрики следующего состава:

L-аспарагин - 5 г

Аммоний лимонно-кислый двузамещенный - 2 г

K₂HPO₄ - 5 г

MgSO₄7H₂O - 0,5 г

FeSO₄7H₂O - 0,05 г

Глицерин - 50 мл

Лимонная кислота - 4 г

Вода дистиллированная - До 1 л

Состав и соотношение компонентов в данной среде являются оптимальными (по сравнению со средой Сотона и другими известными синтетическими средами) для накопления бактерийной массы в более короткие сроки вследствие повышенного содержания в среде L-аспарагина, лимонной кислоты и введения в среду дополнительно сульфата цинка.

Использование среды Курской биофабрики позволяет получать необходимое количество бактерийных клеток за 10 - 14 дней. Тогда как при использовании среды Сотона необходимое накопление бакмассы требует культивирования в течение 15 - 30 дней. Именно молодая культура бактерий обладает наиболее типичными антигенными свойствами, что является очень важным для получения биологически активного и специфичного диагностикума. При этом удается избежать значительного старения культуры, накопления нетипичных форм бактерий, отрицательно влияющих на специфичность препарата, образования быстро оседающих бактериальных комплексов, снижающих диагностическую ценность антигена.

Использование культуры бактерий со сроком выращивания до 10 дней не оправдано из-за низкого накопления в питательной среде бактериальных клеток, увеличение сроков выращивания более 14 дней приводит к старению культуры.

Для концентрирования и очистки бактериальных клеток авторами предлагается метод диафильтрации в тангенциальном потоке. Суспензия бактерийной массы подвергается процессу диафильтрации на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,1 - 0,22 мкм. В качестве растворителя суспензии бактериальных клеток в начальной стадии используется дистиллированная вода, а на конечном этапе - физиологический раствор с 0,5% фенола. Таким образом, на одном аппарате, в одну стадию получается очищенная суспензия бакмассы с необходимой концентрацией бактерийных тел, не требующая дополнительной очистки и ресуспендирования. Этот способ очистки и концентрирования позволяет концентрировать без потерь наиболее ценную в диагностическом плане "легкую" фракцию бактерий, находящуюся во взвешенном состоянии, тогда как в прототипе эта фракция при центрифугировании в значительной степени теряется.

Целесообразность использования микрофильтрационных мембран с размерами пор 0,1 - 0,22 мкм обусловлена тем, что применение мембран с порами более 0,22 мкм может приводить к потерям бактерий при диафильтрации, а использование мембран с порами меньше чем 0,1 мкм снижает производительность процесса диафильтрации, что приводит к увеличению времени циркуляции бактериальной взвеси в системе и меньшей эффективности отмывки бактерий.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Для изготовления антигена культуру возбудителя P.mallei штамм N 5584 выращивают в течение 10 - 14 сут на питательной среде Курской биофабрики с аспарагином, культуру стерилизуют при температуре 100 - 105^oC в течение 2 ч. Надосадочную жидкость (взвесь "легкой" фракции бактерий) декантируют. Отделение и очистку взвеси бактерий декантата от культуральной жидкости осуществляют методом диафильтрации на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,1 - 0,22 мкм в тангенциальном потоке.

Концентрацию клеток во взвеси определяют в международных единицах мутности (МЕМ) по единому стеклянному стандарту мутности для бактериальных взвесей.

Для окрашивания клеток используют 1%-ный раствор органического красителя, количество которого определяют титрованием. После добавления красителя взвесь клеток P. mallei выдерживают при температуре 20 - 25^oC в течение 1 сут. Жидкость отделяют центрифугированием при 6 - 7 тыс.мин^-1 в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют в буферном разбавителе.

Концентрат антигена стабилизируют при температуре 4 - 6^oC в течение 7 сут. Устанавливают рабочее разведение антигена с целью обеспечения специфичности и активности препарата.

Предлагаемый способ характеризуется следующим примером.

Пример.

В синтетическую питательную среду Курской биофабрики вносили 2 см² матриксной расплодки культуры.

Выращивали культуру при температуре 37,5^oC в течение 10 дней. Стерилизовали культуру автоклавированием при 100^oC в течение 2 ч.

Надосадочную жидкость (взвесь "легкой" фракции бакмассы) декантировали.

Отделение и очистку взвеси бактерийных клеток от культуральной жидкости осуществляли методом диафильтрации на микрофильтрационных мембранах с размером пор 0,1 мкм в тангенциальном потоке. Определяли концентрацию полученной суспензии в международных единицах мутности (МЕМ) по единому стеклянному стандарту мутности для бактерийных взвесей.

Для окрашивания взвеси готовили 1%-ный водный раствор красителя (бенгальский розовый). Оптимальное количество раствора красителя, необходимого для окрашивания суспензии, определяли путем титрования.

Для окрашивания всей взвеси (концентрата антигена) брали такое количество красителя, с которым после центрифугирования осадок в пробирке окрашивался интенсивно, а надосадочная жидкость имела только следы краски.

Для окраски 2 см² суспензии оптимальную дозу определили 0,04 см², следовательно, на каждые 100 см³ взвеси при окрашивании добавляли 2 см³ раствора красителя.

Взвесь окрашивали при температуре 22^oC в течение 1 сут, после чего центрифугировали при 7 тыс.мин^-1 в течение 20 мин.

Полученный после центрифугирования осадок гомогенизировали, ресуспендируя его в буферном растворе с pH-3,7 до концентрации клеток 1000 МЕМ/мл.

Концентрат антигена стабилизировали при температуре 5^oC в течение 7 сут.

Для обеспечения специфичности и активности препарата устанавливали рабочее разведение антигена.

Данные титрации антигена приведены в таблице.

В качестве пояснения необходимо отметить следующее. Как видно из таблицы, предлагаемый препарат во всех разведениях проявляет большую активность по сравнению с прототипом. По мнению авторов это связано с применением синтетической питательной среды Курской биофабрики, возможностью получения значительных количеств "молодой" культуры и способом подготовки бактериальных клеток.

По сравнению с прототипом предложенный способ позволяет сократить длительность процесса изготовления, увеличить выход конечного продукта, повысить диагностическую ценность препарата.

Антиген, полученный предложенным способом, может быть использован в ветеринарной практике для экспресс-диагностики сапа в реакции агглютинации.