способ удаления туморнекротизирующего фактора из жидкой среды

Формула изобретения

Способ удаления туморнекротизирующего фактора из жидкой среды путем ее фильтрации на сорбенте, представляющем протеин, иммобилизованный на твердом носителе и его модификации, отличающийся тем, что в качестве протеина используют - макроглобулин, а его модификацию проводят обработкой модификаторами тиол-эфирной петли, выбранными из группы первичных аминов, или протеолитических ферментов, способных связываться с - макроглобулином.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может найти применение в иммунологии, молекулярной биологии, а также при разработке новых подходов к лечению септического шока и других заболеваний, вызванных массивным поступлением цитокинов в кровь.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению, является способ удаления туморнекротизирующего фактора (TNF) из жидкости методом сорбции.

При этом способе в качестве сорбента используют носитель, на который иммобилизованы моноклональные антитела к TNF. Он очищает жидкую среду от TNF. Однако моноклональные антитела представляют собой белок, чужеродный для организма человека. Эффект "подтекания" моноклональных антител с носителя в ходе процедуры удаления TNF может приводить к сенсибилизации организма и ряду других нежелательных эффектов при лечебных процедурах. Кроме того, высокая стоимость и сложность получения моноклональных антител к TNF делает практически невозможным использование указанных сорбентов в клинических условиях.

Туморнекротизирующий фактор является одним из эндогенных пирогенов, может вызвать гипотензию, существенные метаболические сдвиги (повышение углеводного обмена, истощение энергетических запасов, потерю адипоцитами липидов). Механизмами непосредственного действия TNF является также повышение экспрессии адгезивных молекул на поверхности эндотелия для лейкоцитов крови, в частности для гранулоцитов, с чем может быть связано развитие гранулоцитопении. Кроме того, TNF опосредует синдромы "дырявых" капилляров и диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

Изобретение направлено на создание способа удаления TNF из жидкой среды, при этом исключено влияние попадания чужеродного для организма человека белка в кровь, что делает возможным клиническое применение сорбента.

Предложенный способ позволяет удалять TNF из биологических жидкостей, например из крови, плазмы крови, сыворотки крови или растворов, содержащих TNF, методом сорбции. Как известно, метод сорбции включает фильтрацию образца, содержащего удаляемое вещество, через слой сорбента и отмывание (регенерацию) сорбированных веществ для повторного использования сорбента.

В качестве сорбента предложено использовать иммобилизованный на твердой фазе ₂-макроглобулин человека, обработанный модификатором тиол-эфирной петли.

Модификатором тиол-эфирной петли может служить, например, химический агент, выбранный из группы первичных аминов, или протеолитический фермент, способный связываться с ₂-макроглобулином .

При обработке ₂-макроглобулина, сорбированного на носителе указанными агентами, происходит разрыв тиол-эфирной связи в молекуле ₂-макроглобулина, что приводит к его переходу в F-форму (fast-форму), и он приобретает способность к связыванию TNF.

Известно использование моноклональных мышиных антител к TNF для удаления пептида. Известна также возможность взаимодействия TNF с F-формой ₂-макроглобулина в растворах.

Авторами впервые показано, что взаимодействие ₂-макроглобулина и TNF осуществляется за счет нековалентных связей в количественном соотношении 2: 1. Таким образом, установленный факт дает теоретическую возможность осуществить удаление TNF из растворов при неоднократном использовании ₂-макроглобулина. В то же время удаление TNF- с помощью иммобилизованного ₂-макроглобулина представляется возможным при достаточной силе взаимодействия между ними.

Изобретение отличается от прототипа предложенным сорбентом и условиями модификации, что позволяет его использовать в клинической практике.

Пример 1. Сорбент получали путем активации сефарозы 4B CL бромцианом (BrCN) с последующей конъюгацией белка, находящегося в 0,15 M NaCl при pH 7,9. Конъюгацию проводили следующим образом.

После активации и отмывки ледяной дистиллированной водой на фильтре Шотта серофазу добавляли к раствору ₂-макроглобулина в объеме, равном объему раствору белка. Инкубацию смеси проводили в течение 2 ч при 18-20^oC, а затем 16 ч при 4^oC, постоянно перемешивая на роторной мешалке.

После ряда промывок сорбента на фильтре Шотта (диаметр 160 мкм) собирали промывочный буфер, определяли его объем и концентрацию белка микробиуретовым методом. Расчет баланса позволял судить о количестве ковалентно связавшегося ₂-макроглобулина. Далее проводили блокировку оставшихся активных групп 0,5 М глицином в 0,15 М фосфатном буфере с 0,5 M NaCl pH 7,9. Процедура занимала 2 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании на роторной мешалке. Окончательную отмывку сорбента осуществляли на фильтре Шотта, попеременно пропуская по 200 мл буферных растворов (0,1 глицин - HCl буфер pH 3,0 0,1 и 0,15 М фосфатный буфер с 0,5 M NaCl pH 7,9 0,1). Смену буферов проводили 5 раз. Готовый сорбент помещали в 0,15 М фосфатный буфер pH 7,2.

Колонку с иммобилизованным ₂-макроглобулином промывали 0,5 М раствором монометиламина гидрохлорида в течение 30 мин при 20^oC.

Готовили микроколонку объемом 2,0 мл геля (сорбента).

Промывали колонку ЗФР (pH 7,2) в течение 30 мин со скоростью 20 мл/ч при 20^oC, чтобы удалить с сорбента монометиламина гидрохлорид. Затем наносили образец, который содержал 10000 ЕД TNF- (0,6 мкг) в 1 мл ЗФР. После нанесения образца останавливали насос и через 15 мин инкубации продолжали элюцию ЗФР. Общая активность фракций элюата, содержащих TNF, составляла 800 ЕД. Таким образом, эффективность удаления TNF составила свыше 90%.

Пример 2. Удаление TNF- из сыворотки крови человека.

Готовили микроколонку объемом 2,0 мл геля, полученного по примеру 1. Затем наносили 3,0 мл донорской сыворотки крови, в которую предварительно внесли 10000 ЕД TNF- .

Хроматографию проводили с помощью перистальтического насоса P-1 (LKB, Швеция) со скоростью 20 мл в 1 ч. Сыворотка циркулировала по замкнутому контуру в течение 30 мин. Затем размыкали контур и вели элюцию ЗФР с указанной скоростью. Общая активность TNF- в элюате составляла 555 ЕД, т.е. менее 7% от исходной.

После отмывания этой колонки от сорбированного TNF- последовательно 0,9 M NaCl и ЗФР повторяли процедуру, описанную выше. Эффективность удаления TNF- в результате повторной процедуры составляла 91%, т.е. практически не ухудшилась.

Пример 3. В условиях примера 1 модификацию ₂-макроглобулина проводили обработкой раствором протеолитического препарата фибринолизина (плазмина), который брали в двукратном избытке по отношению к иммобилизованному ₂-макроглобулину (по молярности). Удаление TNF- из ЗФР проводили аналогично описанному в примере 1. Эффективность удаления TNF в данном эксперименте составила 92%.