фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii
Классы МПК: | C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев C12N15/19 интерфероны; лимфокины; цитокины |
Автор(ы): | Хагасио Кандзи (JP), Митсуда Синдзиро (JP), Сима Нобуюки (JP), Итагаки Ясухару (JP), Нагао Масая (JP) |
Патентообладатель(и): | Сноу Брэнд Милк Продактс Ко., Лтд. (JP) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1990-03-09 публикация патента:
20.06.1998 |
Изобретение относится к биотехнологии. Получение нуклеотидная последовательность фрагмента к ДНК, кодирующего новый гликопротеин ТСF-II человеческого происхождения, обладающий противоопухолевой активностью, активностью по индуцированию дифференциации клеток лейкемии, активностью по усилению клеточной иммунологии, активностью по стимулированию роста клеток эндотелия сосудов, а также активностью по стимулированию роста генатоцитов. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9
Формула изобретения
1. Фрагмент кДНК, кодирующий гликопротеин TCF-II и имеющий нуклеотидную последовательность I представленную на с. 2. Фрагмент кДНК по п.1, отличающийся тем, что кодирует последовательность аминокислот II, представленную на с.Описание изобретения к патенту
Изобретение касается последовательности ДНК, кодирующей гликопротеин человеческого происхождения. Гликопротеин проявляет цитотоксическую активность по отношению к различным линиям опухолевых клеток, но не по отношению к нормальным клеткам, выступает как новый противоопухолевый цитотоксический фактор, фактор, способствующий дифференциации лейкемических клеток, фактор, усиливающий клеточную иммунологию, фактор, обеспечивающий рост клеток эндотелия сосудов, фактор, обеспечивающий рост гепацитов. В выложенной патентной заявке Японии N 64-10998 описаны вся последовательность аминокислот, а также нуклеотидная последовательность в комплементарной ДНК (кДКН) кодирующая противоопухолевый цитотоксический фактор, получаемый из культуры фибробластов человеческого происхождения и имеющего характеристики: молекулярная масса 36000![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113004/177.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113037/955.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113037/955.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113037/955.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113005/947.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113480/2113480t.gif)
(ii) Скренинг рекомбинантного фага. 500 тыс. дисков фага получают лабораторной расфасовкой раствора рекомбинантного фага ДНК, приготовленного согласно параграфу (3), с использованием препарата Gigapack Gold (Stratagene) и с последующим заражением кишечной палочкой E.coli С600hf1. После адсорбирования дисков фага на фильтре марки Hybond-N (фирма Amersham) эти диски денатурируют щелочью, нейтрализуют и подвергают термообработке при 80oC в течение 2 ч. Гибридизацию по методике, которую разработали Белл и сотр., проводят с использованием смешанной пробы, полученной согласно параграфу (1). Один из клонов, который должен был содержать фрагмент TCF-II, был найден среди позитивных клонов, обнаруженных при первой сортировке. (5) Клонирование полной длины кДНК фактора TCF-II. Внутренние последовательности аминокислот (однобуквенные коды): (
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113004/945.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113005/946.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113004/945.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113005/946.gif)
праймер Sa1 - 77: 5"-GGTCGACTAGGGACTGACTCCGAACAGGATTC-3" Sa1 I
праймер Sph 2203: 5"-GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGGTGCTTCAG-3" Sph I
Клонирование методом PCR проводят по следующей методике. (i) Цепная реакция полимеразы (PCR), мкл:
Дополнительная ДНК (cDNA), синтезированная как описано в параграфе (2) и растворенная в 150 мкл буферного раствора хроматографической колонки - 1
20 мкМ праймер Sa1-77 - 2,5
20 мкМ праймер Sph 2203 - 2,5
10 порций реакционного раствора для проведения реакции PCR (буферный раствор на основе 100 мМ Tris HCl с величиной pH 8,3, содержащий 500 мМ KCl, 15 мМ MgCl и 0,1% (мас.ч./об.ч) желатина) - 10
Смесь 1,25 мМ dGTP, dATP, dTTP, dCTP - 16
Amp1i Tag (5 ед. на 1 мкл, производство фирмы TAKARA SHUZO) - 0,5
Дистиллированная вода - 67,5
Затем указанные выше растворы смешивают в пробирке микрофуги объемом 0,5 мл, причем поверхность жидкости закрывают минеральным маслом в количестве 100 мкл (производство фирмы Sigma Co., Ltd). Реакцию PCR проводят с использованием системы Quick Thermo (производство фирмы Japan Genetics Co., Ltd). После предварительной обработки при 94oC в течение 7 мин 35 раз повторяют трехстадийную реакцию, включающую: 1) термообработку при 55oC в течение 3 мин; 2) реакцию с участием полимеразы при 72oC в течение 2 мин, и 3) реакцию денатурирования при 94oC в течение 2 мин. Далее реакционную смесь нагревают при 55oC в течение 3 мин, а затем при 72oC в течение 11 мин, после чего охлаждают ее до комнатной температуры (в указанное время включают также время перехода с одного режима на другой). При анализе части реакционной смеси методом электрофореза с использованием геля агарозы получают фрагмент ДНК, состоящий из приблизительно 2,3 Kb оснований (Kirobases) и признанный в качестве искомой кДНК фактора TCF-II. Далее ДНК, полученную из четырех пробирок, содержащих вышеупомянутую реакционную смесь, осаждают этиловым спиртом и гидролизуют энзимами Sa1 I и Sph I. В результате электрофореза на геле агарозы с использованием бумажного фильтра DE81 (производство фирмы Watmen Co., Ltd) был получен фрагмент ДНК с приблизительно 2,3 Kb. (ii) Субклонирование. Фрагмент ДНК (2,3 Kb), содержащий Sa1 I и Sph I, сайты, полученный согласно параграфу (1), встраивают с использованием (ligation) буфера для лигирования (производство фирмы TАKARA SHUZO) в плазмидный вектор pUC18 (производство фирмы Japan gene Сo., Ltd), обработанный энзимами Sa1 I и Sph I. Рекомбинантной ДНК трансфецируют кишечные палочки Esherichia Co1i DH5 по методике фирмы BRL Co, Ltd. Удавалось получить более 20 субклонов. (iii) Определение последовательности оснований. Последовательности оснований в полученных субклонах определяют дидеокси-методом с использованием секвеназы (версия 2,0 производства фирмы TOYOBO). Ошибочно включенные нуклеотиды на препарате Ampi Tag (производство фирмы TAKARA SHUZO) были исправлены путем анализа нуклеотидной последовательности оснований в нескольких субклонах. На фиг. 1 и 2 представлены нуклеотидная последовательность кДНК фактора TCF-II, полученная по упомянутой выше методике, а также последовательность аминокислот, выведенная из этой нуклеотидной последовательности. Нуклеотидная последовательность содержит 2172 пары оснований (п.о.) от АТС запускающего кодона до кодона ТАС терминации транскрипции. После аминокислотного транслирования фактор TCF-II содержит 723 аминокислоты. Было сделано допущение о том, что последовательность аминокислот от первого, метионинового (Met) до 29-го аланинового (A1a) остатков представляет собой сигнальную последовательность. Как показано на фиг.1, фактор TCF-II - это полипептид, содержащий цепи
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113004/945.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113005/946.gif)
![фрагмент к днк, кодирующий гликопротеин tcf-ii, патент № 2113480](/images/patents/358/2113005/946.gif)
Класс C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев
Класс C12N15/19 интерфероны; лимфокины; цитокины