фрагмент днк, соответствующий области начала репликации, выделенный из плазмиды микроорганизма bacillus thurinqiensis hd73, вектор экспрессии кристаллического белкового токсина b. thurinqiensis, способ получения экзогенного кристаллического белкового токсина b. thurinqiensis в клетках b. thurinqiensis и инсектицидное средство, содержащее бактерии b. thurinqiensis

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК, соответствующий области начала репликации, выделенный из плазмиды микроорганизма Bacillus thurinqiensis HD 73, имеющий последовательность нуклеотидов, приведенную на с. 431

2. Вектор экспрессии кристаллического белкового токсина Bacillus thurinqiensis, содержащий следующие конструктивные элементы: фрагмент ДНК, соответствующий области начала репликации, охарактеризованный в п.1; селективный маркер; сайт клонирования; фрагмент ДНК, обеспечивающий экспрессию гена в выбранном хозяине; фрагмент ДНК, кодирующий кристаллический белковый токсин Bacillus thurinqiensis, обычно интегрированный в сайт клонирования.

3. Способ получения экзогенного кристаллического белкового токсина B. thurinqiensis в клетках B. thurinqiensis, предусматривающий трансформацию клеток указанного микроорганизма генетической конструкцией, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий кристаллический белковый токсин B.thurinqiensis, с последующим выращиванием клеток в условиях, обеспечивающих экспрессию токсина, отличающийся тем, что в качестве генетической конструкции используют вектор, охарактеризованный в п.2.

4. Инсектицидное средство, содержащее бактерии B.thurinqiensis, отличающееся тем, что оно содержит бактерии B.thurinqiensis, трансформированные вектором экспрессии, охарактеризованным в п.2.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к фрагменту ДНК, соответствующему области начала репликации, полученному из плазмиды Bacillus thurinqiensis HD 73, вектору экспрессии, содержащему указанный фрагмент ДНК, способу получения экзогенного кристаллического белкового токсина B.thurinqiensis при использовании данного вектора, и инсектицидному средству.

Биологические инсектициды и основанные на Bacillus thurinqiensis инсектицидные средства в последнее время нашли широкое применение в борьбе с вредителями благодаря их высокой специфичности по отношению к хозяину.

Известны различные способы получения биологических инсектицидов. Например, они предполагают выделение штаммов, содержащих мутации в генах токсина, причем мутация может быть самопроизвольной или наведенной (см. заявку на патент Великобритании 2216127А), или конъюгирование природных или мутантных штаммов для получения гибридных штаммов, содержащих плазмиды от обоих родительских штаммов (см. патент США 4797279). Каждый из этих способов имеет определенные недостатки и ограничения, такие как непредсказуемость мутаций или неспособность всех штаммов служить донорами плазмид.

Это привело к возрастающему применению технологии рекомбинантных ДНК для введения генов, кодирующих токсины кристаллических белков или других нужных белков, в клетки-хозяева. Например, трансформация штаммов B. t. с использованием такой технологии, как электропорация или электротрансформация, находит широкое применение (см. Bore and Ellan, FEMS, Microbioloqy Letters 58 (1989) 171-178; заявка на патент Великобритании 2219806А; заявка на Европейский патент 433945A; Baum et al. Appl. Environ. Microbiol. v 56 (II) 3420-28, ноябрь 1990 г.).

Как подробно описано в вышеуказанных источниках информации, основным условием успешной работы со штаммами В.t. при использовании технологии рекомбинантных ДНК является наличие подходящих векторов клонирования для переноса требуемого генетического материала в штамм хозяина.

Однако до настоящего времени успешная трансформация штаммов В. t. с целью введения гетерологичного генетического материала была основана на использовании векторных плазмид, содержащих в дополнение к ДНК из В. t. значительные количества ДНК гетерологичных организмов, таких как E.coli (см. заявку на Европейский патент 433945A), Bacillus cereus (см. заявку на патент Великобритании 2219806А) и т.п. Присутствие ДНК из гетерологичных организмов может привести к дестабилизации плазмид внутри штамма хозяина, и, кроме того, ясно, что было бы более желательным иметь трансформированные организмы, содержащие в основном или только ДНК, свойственную этим видам.

Baum et al. (Appl.Environ.Microbiol.v 56 (II) 3420-28, ноябрь 1980 г.) описали клонирование в E.coli семи областей начала репликации из резидентных плазмид Bacillus thurinqiensis Kurstaki (B.t.k.) HD 263 и HD 73. Три из этих областей, полученные из плазмид 43, 44 и 60 МДа В.t.k. HD 263, использовались для построения набора челночных векторов. Однако каждая из клонированных областей начала репликации обладает несовместимостью с резидентной плазмидой В. t. , из которой она была получена (Baum and Gilbert (1991), J.Bacteriol 173(17) 5280-5289).

Baum et al. (там же) описывают клонирование фрагментов ДНК плазмиды, содержащих сайты начала репликации из В.t.k. HD 73-26-10, трансконъюгативного штамма, который содержит резидентную плазмиду 44 МДа HD 263 и плазмиду 4,9 МДа из не описанного источника. Новые плазмиды pEG588-2, pEG588-18 и pEG588-21 гибридизуются при использовании саузерн-блоттинга с зондом, содержащим плазмиду 4,9 МДа штамма HD 73-26. Однако в трансформантах HD 73-26, полученных при использовании указанных плазмид, обнаруживается уменьшенное количество или полное отсутствие резидентной плазмиды 4,9 МДа HD 73-26, что свидетельствует об их некоторой несовместимости с плазмидой 4,9 МДа.

Авторами изобретения обнаружено, что можно сконструировать ДНК-векторы, которые стабильны в хозяйских клетках В. t. и содержат главным образом ДНК В. t. Кроме того, при соответствующем выборе плазмиды-источника для области начала репликации и путем необходимых манипуляций авторы получили вектор экспрессии, который совместим с природными резидентными плазмидами, из которых получена область начала репликации. Данный вектор используется для получения экзогенного кристаллического белкового токсина B.thurinqiensis и соответствующего инсектицидного средства. Данное средство обладает большей эффективностью и стабильностью по сравнению с известным (заявка на Европейский патент 0382990).

Изобретение относится к получению вектора экспрессии для трансформации клеток Bacillus thurinqiensis, содержащего область начала репликации Bacillus thuriqiensis Kurstaki HD73, практически свободную от ДНК, с которой она обычно связана и которая необходима для репликации.

Область начала репликации может быть получена из любой плазмиды HD 73 В. t. k. Предпочтительно, область начала репликации получают из плазмид 5,2 МДа, 5,6 МДа или, более предпочтительно, из плазмиды 50 МДа, HD 73. Последовательность фрагмента ДНК, соответствующего области начала репликации плазмиды 50 MDa, приведена ниже (см.SEQ ID NO:6 в перечне последовательностей).

Особое преимущество использования области начала репликации от одной из плазмид HD 73 заключается в том, что удаление ДНК, ответственной за иные функции, чем репликация, позволяет получить векторные плазмиды, которые могут стабильно вводиться в штаммы, содержащие резидентные плазмиды с подобными областями начала репликации, без исключения этих резидентных плазмид из трансформированного штамма.

Заявленный вектор экспрессии помимо фрагмента ДНК, соответствующего области начала репликации, полученной из плазмиды B.thurinqiensis HD 73, содержит следующие конструктивные элементы: селективный маркер, сайт клонирования, фрагмент ДНК, обеспечивающий экспрессию гена в выбранном хозяине, фрагмент ДНК, кодирующий кристаллический белковый токсин B.thurinqiensis, обычно интегрированный в сайт клонирования. Вектор может быть получен традиционными способами (см. , например, Hardy, Plasmids: A Practical Approach, Washinqton, O. C. IRL Press, 1987).

В соответствии с этим, изобретение относится к способу получения в клетках Bacillus thurinqiensis заданного экзогенного токсина, включающего трансформацию клеток Bacillus thurinqiensis заявленным ДНК-вектором. Трансформированные клетки выращивают в условиях, обеспечивающих экспрессию кристаллического белкового токсина. Изобретение также относится к инсектицидному средству, которое содержит бактерии В.thurinqiensis, трансформированные заявленным вектором экспрессии.

Еще одним объектом изобретения является фрагмент ДНК, соответствующий области начала репликации, полученный из плазмиды HD 73 50 МДа Bacillus thurinqiensis, имеющий последовательность нуклеотидов, которая приведена ниже (см.SEQ ID NO:6 в перечне последовательностей).

Краткое описание рисунков.

На фиг. 1 показана плазмида pSB901, содержащая ген устойчивости к эритромицину (ermC).

На фиг. 2 показана плазмида pSB904.1, которая содержит фрагмент Bgl II 9,6 kb из плазмиды 50 МДа HD 7З и ген (ermC).

На фиг. 3 показана плазмида pSB904.2, которая является производной от pSB904.1 с удаленными несущественными участками фрагмента Bql II 9,6 kb.

На фиг. 4 показана плазмида pSB904.3, которая включает нуклеотиды 123-1843 репликона В.t. 2,4 kb, содержащегося в pSB904.2.

На фиг. 5 показана плазмида pSB909, которая содержит маркерный ген ermC и укороченный фрагмент плазмиды 50 МДа.

На фиг. 6 показана плазмида pSB909.3, содержащая участок 2,4 kb фрагмента Bgl. II 50 МДа с 9,6 kb c геном ermC.

На фиг. 7 показаны фрагменты делеции, используемые при определении минимального репликона плазмиды 50 МДа HD 73, расположенного на участке 2,4 kb, обнаруженном в pSB904.1 и pSB909.3.

На фиг. 8 показана плазмида pSB909.4, содержащая минимальный репликон плазмиды 50 МДа HD 73 вместе с геном ermC.

На фиг.9 показана плазмида pSB909.5, содержащая указанный выше минимальный репликон и множественный сайт клонирования.

На фиг.10 показана плазмида pSB922, которая содержит указанный выше минимальный репликон и ген cryIIIA из В.t. tenebrionis.

Плазмиды, содержащие фрагмент плазмиды 50 МДа из В.t. kurstaki HD 73 вместе с селективным маркерным геном, используют для трансформирования клеток В. t. Трансформанты, демонстрирующие экспрессию маркера, содержат область начала репликации и отбираются для дальнейшего исследования. Отобранные плазмиды гидролизуют с помощью подходящих ферментов для удаления нежелательных последовательностей ДНК и лигируют с получением дополнительной плазмиды, содержащей нужный фрагмент вместе с маркерным геном, который еще раз может быть использован для трансформации клеток В.t. Избирательную делецию участков различных плазмид, содержащих фрагмент, идентифицированный как включающий область начала репликации, проводят с использованием соответствующих ферментов и векторов, полученных лигированием фрагментов с рециркуляризацией. Эти новые конструкты используют для повторной трансформации В. t.; при этом с помощью конструкта, содержащего нужную область начала репликации, будут получены идентифицируемые трансформанты. Нужный участок вновь удаляют из плазмиды и подвергают секвенированию обычным образом. Для определения минимального репликона осуществляют делеции с каждого конца нужного участка путем использования подходящих ферментов, при необходимости с введением соответствующих сайтов рестрикции, также осуществляемого обычным образом.

Необходимо обратить внимание на то, что область начала репликации может содержать делеции, замещения и добавления (например, инсерции), которые не влияют на ее способность функционировать должным образом.

Затем конструируют плазмиду, содержащую минимальный репликон, маркерный ген и множественный сайт клонирования, необходимый для функционирования плазмиды в качестве вектора для введения выбранных генов в клетки B.t. Сконструированный таким образом плазмидный вектор затем используют в качестве носителя нужного субклонированного гена и для трансформации клеток B.t. Трансформанты тестируют с использованием полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными для отдельных генов кристаллических белков, и далее подвергают биоанализу. Трансформация клеток B.t. вектором, полученным согласно изобретению, приводит к получению стабильных трансформантов, которые сохраняют все свои нативные плазмиды, содержащие ген кристаллического белка.

Трансформированные клетки B.t. используют для борьбы с насекомыми путем нанесения их в инсектицидно эффективном количестве на насекомых или введения в их среду обитания. Подходящие рецептуры составов и их получение осуществляют обычным образом, например как описано в патенте США 4797279.

Пример 1.

Идентификация минимального репликона плазмиды HD 73 50 МДа.

а) Выделение плазмидной ДНК.

Штамм HD 73 (см. Lereclus et al. Mol.Gen. Genet.191: 307 - 313, полученный из Института Пастера, Париж, Франция, или NRRL, Пеория, Иллинойс, 51604 NRRL В-4488) выращивают в подходящей культуральной среде и плазмидную ДНК очищают с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl. Электрофорез в агарозном геле плазмидной ДНК, выявляет плазмиды мол.м. 50, 7,8, 5,6 и 5,2 МДа.

Плазмиду 50 МДа отделяют от остальных плазмид ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы. После выделения ее гидролизуют с помощью BglII, фрагменты рестрикции разделяют препаративным электрофорезом в агарозном геле и выделяют из геля электроэлюцией.

б) Получение гена устойчивости к эритромицину

Плазмиду plM13 Bacillus subtilis используют в качестве источника гена устойчивости к эритромицину, ermC (Monod et al. 1986, J.Bacteriol. 167: 138-147). Фрагмент гена ermC вырезают из плазмиды plM13 путем двойного гидролиза HindIII/ClaI и отделяют от остальных участков плазмиды с помощью электрофореза в агарозном геле. После выделения фрагмент ermC HindIII/ClaI субклонируют в pUC18, гидролизованной HindIII/AccI, и встраивают E.coli DH5-альфа. Полученный конструкт обозначают pSB901 (см.фиг. 1). Из pSB901 ген ermC высвобождают путем двойного гидролиза HindIII/EcoR или HindIII/BamHI. Он включает также сайты из MCS pUC18. Клетки E.coli DH5-альфа, содержащие pSB901, обнаруживают устойчивость к эритромицину, но должны быть пассированы на планшетах LB, содержащих 100 мкг/мл эритромицина для предотвращения фонового роста нетрансформированных клеток, который имеет место при выращивании клеток на планшетах LB при 50 мкг/мл.

в) Получение субклонов плазмиды 50 MDa

Клетки E. coli DH5-альфа служат в качестве клеток-хозяев, для субклонирования BglII - фрагментов плазмиды 50 МДа, так что могут быть получены значительные количества плазмидной ДНК в целях возможной трансформации В. t. для выделения фрагмента BglII, содержащего область начала репликации плазмиды 50 МДа.

В результате гидролиза при использовании BglII получают фрагменты рестрикции размером примерно 35, 13,8, 10,2, 9,6, 4,2 и 3,3 kb, как и ожидалось. Как известно, фрагмент BglII 13,8 kb содержит ген cry 1А(с). Электроэлюция из гелевых пластинок обеспечивает хорошее извлечение всех фрагментов размером 13,8 kb и менее. Все выделенные фрагменты лигируют по отдельности в pUC18, гидролизованную BamHI, и E.coli DH5-альфа трансформируют клетки обычным способом смесями лигированных фрагментов. Рестрикционные "карты" гидролиза плазмидной ДНК сравнивают с ожидаемой "картой" (см. работу Kronstad и Whiteley"s: J.Bacteriol. 160: 95-102). Субклоны, содержащие фрагменты BglII размером 3,3, 4,2, 9,6 и 13,8 kb, идентифицируют на основе рестрикционной карты. Субклон 13,8 kb проверяют с помощью полимеразной цепной реакции при использовании cryIA (с)-специфических праймеров.

Плазмида - Описание

pSB902 - фрагмент BglII 3,3 kb в pUC18

pSB903 - фрагмент BglII 4,2 kb в pUC18

pSB904 - фрагмент BglII 9,6 kb в pUC18

pSB905 - фрагмент BglII 13,8 kb в pUC18

Ген ermC вводят в указанные различные плазмиды с целью обеспечения селективного маркера для трансформации В.t.

Ген ermC субклонируют из pSB901 в pSB902 посредством pSB905. Например, фрагмент гена ermC BamHI/HindIII из pSB901 встраивают и затем лигируют в pSB904 по сайту MCS PstI pUC18, концы которого затупляют с помощью полимеразы ДНК Т4 и обрабатывают с помощью ClAP. Клетки E.coli DH5-альфа трансформируют обычным образом полученными смесями лигированных фрагментов, рестрикционный анализ подтверждает наличие гена ermC. Плазмиды обозначают следующим образом:

Плазмида - Описание

pSB902.1 - фрагмент BglII 3,3 kb + ermC в pUC18

pSB903.1 - фрагмент BglII 4,2 kb + ermC в pUC18

pSB904.1 - фрагмент BglII 9,6 kb + ermC в pUC18

pSB905.1 - фрагмент BglII 13,8 kb + ermC в pUC18

Фрагмент BglII 10,2 kb субклонируют непосредственно в pSB901, которую гидролизуют с помощью BamHl. Клетки E.coli DH5-альфа трансформируют обычным образом смесью лигированных фрагментов. Плазмидную ДНК трансформантов анализируют рестрикционным гидролизом. Карты рестрикции подтверждают наличие фрагмента BglII 10,2 kb в плазмидах.

Плазмида - Описание

pSB906 - фрагмент BglII 10,2 kb в pSB901

г) Идентификация фрагмента BglII содержащего область начала репликации плазмиды 50 МДа.

B. t. HDI cry B(Stahly et al. Biochem. Biophys Res Comm 1984, 3: 581-588), далее cry В, по отдельности трансформируют с помощью pSB902.1, 903.1, 904.1, 905.1 и 906 электропорацией.

Только плазмида pSB904.1 (см. фиг. 2) обеспечивает получение устойчивых к эритромицину трансформантов, свидетельствуя о том, что фрагмент BglII 9,6 kb содержит область начала репликации плазмиды 50 МДа, способствуя ее размножению в cry В. Рестрикционный анализ подтверждает, что конструкт правильного размера содержит фрагмент BglII 9,6 kb плазмиды 50 МДа.

д) Рестрикционный ферментный анализ pSB904.1

Осуществляют рестрикционный анализ с различными ферментами с получением следующих результатов:

- pSB904.1

Accl - 4^x

BamHI - отсутствует

EcoR - 2^x

HincII - 4^x

HindIII - 2^{x x}=один сайт находится внутри MCS, который получен из pUC18

KpnI - 1^x

Narl - 1

Ncol - отсутствует

PstI - отсутствует

SacI - 2^x

SalI - 1^x

SmaI - 1^x

SphI - 1^x

XbaI - 5^x

XhoII - много

XmaI - 1^x

e) Удаление последовательностей pUC18 из pSB904.1.

Для удаления последовательностей pUC18, ДНК pSB904.1 гидролизуют с помощью SphI и SmaI, которые отрезают любые концы вектора pUC18 и оставляют только последовательности MCS. Фрагмент рестрикции, содержащий только фрагмент BglII 9,6 kb c геном ermC, удаляют из вектора pUC18 путем препаративного электрофореза в агарозном геле с последующей электроэлюцией. Конец SphI - фрагмента обрабатывают полимеразой ДНК Т4 для получения тупого конца. Оба тупых конца лигируют с помощью ДНК лигазы Т4, и cry В трансформируют электропорацией полученной смесью лигированных фрагментов.

Трансформанты анализируют скринингом на содержание плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле. Конструкт, содержащий фрагмент BglII, 9,6 kb плазмиды 50 МДа вместе с геном ermC, обозначают pSB909 (см.фиг. 5).

Плазмида - Описание

PSB909 - Делетированные последовательности pUC18 из pSB904.1 (фрагмент BglII 9,6 kb c геном ermC сохранен)

ж) Определение локализации области начала репликации на pSB909

Для локализации участка плазмиды pSB909, который содержит область начала репликации, получают несколько конструктов с делетированными различными участками плазмиды.

1. Проводят гидролиз HindIII плазмиды pSB904.1 с получением двух фрагментов.

Фрагмент, содержащий участок В. t. около 6 кв с геном ermC, отделяют от фрагмента, содержащего pUC18 и 3,4 kb ДНК В.t. с помощью препаративного электрофореза в агарозном геле. Фрагмент, содержащий ermC, выделяют из гелевой пластинки с помощью электроэлюции, и он аутолигируется с получением рециркуляризованной формы.

2. Осуществляют двойной гидролиз HindIII/EcoRI pSB909, в результате которого образуются два фрагмента. Больший фрагмент, содержащий ген ermC, отделяют от малого фрагмента ДНК В. t. размером 3,5 kb с помощью препаративного электрофореза в агарозном геле. После электроэлюции больший фрагмент обрабатывают фрагментом Кленова для образования тупых концов. Эти тупые концы аутолигируются с получением закрытой формы вектора.

3. Проводят двойной гидролиз EcoRI/SalI pSB909, что приводит к образованию двух фрагментов. Больший фрагмент, содержащий ген ermC, отделяют от малого фрагмента ДНК В.t. размером 2,4 kb с помощью препаративного электрофореза в агарозном геле. После электроэлюции больший фрагмент обрабатывают фрагментом Кленова для образования тупых концов, которые аутолигируются с получением рециркуляризованной формы. Таким образом осуществляют делецию каждого участка pSB909 по отдельности.

Для определения, какой конструкт сохраняет область начала репликации, используют различные лигационные смеси для трансформации cry В. Трансформанты не выявляются, когда происходит делеция фрагмента 2,4 kb EcoRI /SalI, свидетельствуя о том, что область начала репликации локализуется на этом участке ДНК. Сделанный вывод подтверждают получением трансформантов с остальными двумя конструктами, содержащими делеции.

Плазмида - Описание

pSB909.1 - удаляется участок 3,5kb EcoRI/ HindIII из pSB909

pSB902.2 - не содержит участка HindIII размером 3,4 kb в pSB909

з) Конструирование 909.3

Для подтверждения того, что участок размером 2,4 kb содержит область начала репликации, как показано в исследованиях с получением делеций, конструируют новую плазмиду, которая содержит только участок размером 2,4 kb pSB909 вместе с геном ermC. Плазмидную ДНК pSB904.1 гидролизуют как EcoRI, так и HindIII для получения фрагментом рестрикции размером около 3,6, 3,5, 3,4 и 2,7 kb (участок pUC18). Эту смесь рестрикционных фрагментов обрабатывают фрагментом Кленова с образованием тупых концов, а затем лигируют вместе для получения рециркуляризованной формы. Лигационную смесь используют для трансформации cry В электропорацией. Полученные трансформанты подвергают скринингу на содержание плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле. Фрагмент размером 3,6 kb, который получен из участка 2,4 kb В. t. вместе с геном ermC, способен к репликации, свидетельствуя о том, что он содержит область начала репликации плазмиды 50 МДа. Этот конструкт обозначают pSB909,3 (см.фиг. 6).

Плазмида - Описание

pSB909.3 - Содержит участок размером 2,4 kb из 9,6, к фрагмента BglII 50 МДа вместе с геном ermC

и) Секвенирование 909.3

С целью секвенирования участка 2,4 kb, содержащего область начала репликации из плазмиды 50 МДа, этот участок удаляют из pSB904.1 с помощью гидролиза EcoRI и SalI. Фрагмент EcoRI/SalI субклонируют в плазмидный вектор pS port E. coli.

Секвенирование проводят согласно дидезокси-методу в соответствии с рекомендациями изготовителя (набор для секвенирования ДНК-полимеразы Т7, Фармация ЛКБ Байотекнолоджи, Аламеда, Калифорния). Результаты секвенирования показывают, что область репликации имеет размер 2392 пар оснований (п.о.).

к) Определение минимального репликона

Для осуществления делеции различных участков конца EcoRI, определенного под нуклеотидным номером 2392, фрагмента репликона В. t., субклонированного в pSport, используют ExoIII согласно рекомендациям изготовителя. С помощью анализа последовательности определяют конечный нуклеотид каждой делеции. Полученные результаты приведены ниже в табл. 1 и иллюстрируются на фиг. 5. Плазмидную ДНК каждого делетированного ExoIII субклона гидролизуют как HindIII, так и XbaI. Фрагмент HindIII/XbaI, включающий ген ermC, лигируют с каждым субклоном ExoIII. Штамм E.coli DH5-альфа трансформируют обычным образом отдельными лигационными смесями. Плазмидную ДНК трансформантов анализируют с помощью рестрикционного гидролиза HindIII и XbaI для подтверждения наличия гена ermC в составе конкретного субклона, делетированного ExoIII. В. t. cry трансформируют плазмидной ДНК каждого субклона ExoIII для выявления того, который все еще способен к репликации.

Плазмиды, способные к репликации в cry В, анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле. Таким образом, 479 оснований могут быть удалены с конца EcoRI-фрагмента репликона без нарушения способности к репликации. В соответствии с этим один конец требуемой для репликации ДНК минимального размера локализован между парами оснований 1626 и 1912.

Для определения того, какое количество ДНК может быть удалено из конца BglII фрагмента репликона, обозначенного под нуклеотидным номером 1, без потери функций репликации, делеции вводят путем замещения участков фрагмента. Плазмиду pSB904.1 гидролизуют с помощью EcoRI для получения двух фрагментов, один из которых включает pUC18 +ermC + фрагмент репликона размером 2,4 kb.

Смесь лигируют с циркуляризацией фрагментов и клетки E.coli ДН5- альфа трансформируют путем реакции лигирования согласно стандартной методике. Наличие плазмид в трансформантах анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле после гидролиза EcoRI. Конструкт, который содержит ген ermC и фрагмент области начала репликации размером 2,4kb в pUC18, обозначают pSB904.2 (см. фиг. 3). Так как не существует подходящего сайта рестрикции в пределах первых 200 оснований фрагмента репликона, праймер для полимеразной цепной реакции, обозначенный ВТ113 (см. SEQ ID NO :1 перечне последовательности), конструируют для ввода сайта AvrII в положении нуклеотида 123 с помощью простого изменения одиночного основания, как подчеркнуто ниже. Второй праймер, обозначенный ВТ898, rev (см..SEQ ID NO: 2 в перечне последовательности), предназначен для обеспечения амплификации участка фрагмента репликона размером 2,4 kb от нуклеотида 113 до нуклеотида 898. Последовательности праймеров приведены в табл. 2.

Эта пара праймеров используется в полимеразной цепной реакции с плазмидной ДНК pSB904.2, служащей в качестве матрицы для получения фрагмента в 786 пар оснований. Фрагмент, полученный с помощью полимеразной цепной реакции, гидролизуют AvrII и AccI с получением фрагмента, соответствующего нуклеотидам 123-823, который очищают в геле. Плазмиду pSB904.2 гидролизуют XbaI и AccI и после очистки в геле лигируют с фрагментом полимеразной цепной реакции AvrII/AccI. AvrII и XbaI образуют совместимые липкие концы, обеспечивающие введение фрагмента полимеразной цепной реакции (PCR) в вектор XbaI/AccI pSB904.2. Эта вставка создает новый конец 5" фрагмента репликона, который утратил 122 основания исходного фрагмента. В качестве альтернативы фрагмент полимеразной цепной реакции гидролизуют DraI и AccI, получая фрагмент, соответствующий нуклеотидам 291-823. После экстрагирования фенолом/хлороформом и осаждения в этаноле указанный PCR-фрагмент DraI/Accl лигируют непосредственно в pSB904.2, которую гидролизуют с помощью XbaI и обрабатывают фрагментом Кленова для образования тупых концов с последующим гидролизом Accl, экстрагированием фенолом/хлороформом и осаждением в этаноле. Тупой конец DraI лигируют с тупым концом Xba для облегчения встраивания PCR- фрагмента DraI/AccI в вектор pSB904.2, что приводит к делеции 290 пары оснований от исходного конца " BglII".

Обе лигационные смеси используют по отдельности для трансформации E.coli DH5-aльфa согласно традиционной методике. Трансформанты подвергают скринингу путем полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, которые "окружают" точки делеции, и выявляют трансформанты с помощью рестрикционного гидролиза. Плазмидную ДНК каждого конструкта с делецией используют для трансформации cry В методом электропорации для выявления того, способны ли еще конструкты с делецией к репликации.

Делетированный участок - Репликация cry В

1-122 - Да

1-291 - Нет

Конструкт с делецией, еще способный к репликации, в cry В, анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле и идентифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Эту плазмиду обозначают pSB904.2бА3. Таким образом, указанный конец минимального репликона локализован между основаниями 122-291.

Для проверки того, могут ли дополнительные нуклеотиды делетированы с конца EcoRI-репликона, pSB904.2бА3 гидролизуют с помощью HindIII и AflIII для удаления участка pUC18 и сохранения оснований 123-1843 репликона В.t., так же, как и гена ermC. Этот фрагмент HindIII/AflIII субклонируют в pUC18 в DH5-альфа и после верификации используют для трансформации cry B с целью определения того, способен ли к репликации конструкт с этой делецией. Полученные трансформанты анализируют на наличие плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле. Плазмиду обозначают pSB904.3 (см. фиг. 4).

Конструкт с делецией - Репликация cry В

123-1843 - Да

Чтобы убедиться в том, что последовательности pUC18 не являются необходимыми для репликации конструктов с делециями, конструкт, не содержащий участка pUC18, получают заполнением концов описанного выше фрагмента HindIII/AflIII из pSB904.2бАЗ с помощью фрагмента Кленова и лигированием для циркуляризации. Лигационную смесь используют для трансформации cry В электропорацией. Трансформанты анализируют на наличие плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле и идентифицируют с помощью полимеразной цепной реакции и рестрикционного гидролиза. Плазмиду, которая состоит из нуклеотидов 123-1843 репликона B.t. и гена ermC, обозначают pSB909.4 (см.фиг. 8), и она ограничивает минимальный репликон. Последовательностью минимального репликона В. t. является последовательность SEQ ID NO:6 в приведенном ниже перечне последовательностей.

Пример 2.

Трансформация B.t. с помощью плазмидного вектора, содержащего минимальный репликон

а) Встраивание сайта множественного клонирования (MCS)

Для того, чтобы этот минимальный репликон мог быть использован в качестве вектора клонирования, в него вводят сайт множественного клонирования. Сайт множественного клонирования получают при использовании двух олигонуклеотидов (их последовательность указана ниже), которые после гибридизации образуют липкий конец AflIII и HindIII.

Олигонуклеотид - Последовательность

MCS1 - 5"CATGTGAATTCCGCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGA CCTGCAGA3"

MCS2 - 5"AGCTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGCGG AATTCA3".

Олигонуклеотиды MCS1 и MCS 2 охарактеризованы как SEQ ID NO3 и SEQ 10, NO4 в приведенном ниже перечне последовательностей. Эти олигонуклеотиды обрабатывают по отдельности полинуклеотидкиназой Т4, смешивают и нагревают до кипения, затем дают постепенно остыть до комнатной температуры и лигируют в 1000-кратном молярном избытке с фрагментом HindIII/ AflIII из pSB904.2бА3, используя ДНК-лигазу Т4. Лигационную смесь используют для трансформации cry В электропорацией. Трансформанты анализируют методом рестрикционного гидролиза на наличие сайта множественного клонирования в плазмиде. Полученный конструкт обозначают pSB909.5 (см.фиг. 9).

б) Выделение гена cry IIIA

Ген дельта-эндотоксина cryIIIA выделяют и клонируют из B.t.tenebrionis. Этот ген локализован на плазмиде 90 МДа. Общую фракцию ДНК В.t. выделяют путем лизиса клеток в додецилсульфате натрия и осаждения примесей NaCl с последующим диализом и осаждением ДНК в этаноле. Конечные препараты ДНК содержат плазмиду 90 МДа, несущую ген cryIIIA. Пробу из 42 оснований, Tenebr 1 (SEQ, ID N0: 5 в приведенном ниже перечне последовательностей) синтезируют для использования в Саузерн-блоттинге с гена для выявления cryIIIA. Проба гомологична последовательности, расположенной вблизи инициирующего кодона ATG. Последовательность пробы является производной опубликованной последовательности cryIIIA (Sekar et al. 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. 84:7036-7040).

Олигонуклеотид - Последовательность

Tenebr 1 - 5" ACT ACT GAA AAT GAG GTG CCA ACT AAC CAT GTT CAA TAT 3".

Общую ДНК гидролизуют c помощью HindIII, разделяют путем электрофореза в геле 0,6%-ной агарозы в lxTBE буфере. Саузерн-блоттинг гидролизованной ДНК, перенесенной на нейлоновые фильтры с пробой Tenebr 1 после авторадиографии, выявляет гибридизирующийся фрагмент HindIII размером 3,0 kb. Общую ДНК гидролизуют полностью с помощью HindIII. Полученные фрагменты разделяют методом гель-электрофореза. Участок ДНК, соответствующий по размеру 2,5 - 3,5 kb, выделяют на мембране из диэтиламиноэтила, элюируют и вновь ресуспендируют в 100 мкл ТЕ. Затем получают частичную библиотеку лигированием изолированных фрагментов HindIII в pTZl8R, расщепленную HindIII (фармация ЛКБ Байотекнолоджи), которую затем обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой. Компетентные клетки E.coli альфа-ДН5, компетентные клетки трансформируют, используя 1 мкл лигационной смеси на 25 мкл компетентных клеток, и рекомбинанты отбирают на планшетах LВ, содержащих ампициллин в концентрации 75 мкг/мл, X-qal в концентрации 100 мкг/мл и изопропилтиогалактозид в концентрации 1 мМ. Полученные колонии анализируют путем гибридизации ДНК колоний с пробой Теnebr1. Положительные колонии выращивают, и плазмиды выделяют и анализируют с помощью рестрикционного анализа. Плазмидный клон, обнаруживающий "правильные" рестрикционные фрагменты и содержащий вставку соответствующего размера, обозначают pSB100. Дальнейшее подтверждение того факта, что pSB100 содержит ген cryIII, получают методом Саузерн- блоттинга при использовании пробы Tenebr1.

в) Субклонирование гена CryIIIA в pSB909.5

Плазмидную ДНК выделяют в больших количествах из штамма cry В, содержащего pSB909.5, с помощью щелочного лизиса, который осуществляют инкубированием клеток при 37^oC в течение З0 - 60 мин в растворе, содержащем 25 мМ Трис, pH 8,0, 25% сахарозы, 25 мМ ЭДТА, с последующим осаждением хромосомной ДНК. Супернатант наносят непосредственно на колонку Qiaqen tip-100 для очистки плазмидной ДНК. Затем плазмидную векторную ДНК полностью гидролизуют HindIII с последующей обработкой CIAP. HindIII и CIAP удаляют экстрагированием смолой Strataclean. Ген cryIIIA выделяют из pSB100 путем гидролиза рестриктазой HindIII, которая высвобождает интактный ген из вектора pTZ18R. Фрагмент HindIII, содержащий ген cryIIIA, изолируют препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией из агарозы препаратом Qiaex. Выделенный HindIII-фрагмент cryIIIA лигируют с гидролизованной HindIII pSB909.5, используя ДНК-лигазу Т4 и соотношение вектор: вставка 1:5. Лигационную смесь используют для трансформации cry В электропорацией. Трансформанты отбирают на планшетах LB, содержащих 50 мкг/мл ампициллина при З0^oC. Колонии анализируют на наличие плазмид. Плазмиды правильного размера анализируют с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к гену cryIIIA. Конструкт, полученный на основе HindIII-фрагмента гена cryIIIA, субклонированного в сайт HindIII плазмиды pSB909.5, обозначают pSB922 (см. фиг. 10).

г) Трансформация B.t. Kurstaki

ДНК плазмиды выделяют в больших количествах из бактерий В.t. cry В, несущих pSB922, как указано выше. Очищенную плазмидную ДНК используют для трансформации электропорацией бактерий B.t.kurstaki, которые содержат гены Cry1A(a), Cry1A(b), Cry1A(c) и Cry11A. Трансформанты отбирают, как указано выше. Изолированные колонии анализируют на наличие плазмид. Трансформанты скринируют на содержание гена cry с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными для каждого гена кристаллического токсина. Введение pSB909.5, содержащей cryIIIA, в указанные бактерии B.t.kurstaki, не приводит к вытеснению какой-либо нативной плазмиды, включающей ген кристаллического белка.

Проводят биоанализ с трансформированными бактериями, которым обеспечена возможность спорулирования в подходящей среде. Ожидается активность данного инсектицидного средства как против жесткокрылых, так и против чешуекрылых. Насекомые, с которыми проводится биоанализ, включают Leptinotarsa texana, Thichoplusia ni, Heliothis zea. и Spodoptera exiqua.

После более чем десяти поколений вегетативного роста в отсутствие селекции с помощью антибиотиков, плазмидный вектор, несущий ген кристаллического токсина, стабильно удерживается внутри трансформированной клетки. Таким образом, данный плазмидный вектор полезен для стабильного субклонирования различных генов в различных штаммах В. t.

Перечень последовательностей

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO:1:

(i) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 24 пары оснований

(B) Тип: нуклеиновая кислота

(C) Количество цепей: одна

(D) Топология: линейная

(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)

(iii) Гипотетическая: нет

(iV) Антисмысловая: нет

(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO:1:

GAATCAAGCC TAGGCACTAG GTTG - 24

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO:2:

(i) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 24 пары оснований

(B) Тип: нуклеиновая кислота

(C) Количество цепей: одна

(D) Топология: линейная

(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)

(iii) Гипотетическая: нет

(iV) Антисмысловая: нет

(Xi) Описание последовательности: SEQ ID NO:2:

CTCAATTGCT AGATGCCATT TGTG - 24

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO:3

(i) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 48 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Количество цепей: одна

(D) Топология: линейная

(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)

(iii) Гипотетическая: нет

(iV) Антисмысловая: нет

(Xi) Описание последовательности: SEQ ID NO:3:

CATGTGAATT CCGCGGTACC CGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGA - 48

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO:4:

(i) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 48 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Количество цепей: одна

(D) Топология: линейная

(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)

(iii) Гипотетическая: нет

(iV) Антисмысловая: нет

(Xi) Описание последовательности: SEQ ID NO:4:

AGCTTCTGCA GGTCGACTCT AGAGGATCCC CGGGTACCGC GGAATTCA - 48

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO:5:

(i) Характеристика последовательности:

(A) Длина: 39 пар оснований

(В) Тип: нуклеиновая кислота

(С) Количество цепей: одна

(D) Топология: линейная

(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)

(iii) Гипотетическая: нет

(iV) Антисмысловая: нет

(Xi) Описание последовательности: SEQ ID NO:5:

ACTACTGAAA ATGAGGTGCC AACTAACCAT GTTCAATAT - 39

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO:6:

(A) Длина: 1721 пар оснований

(B) Тип: нуклеиновая кислота

(C) Количество цепей: две

(D) Топология: линейная

(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная)

(iii) Гипотетическая: нет

(iV) Антисмысловая: нет

(Xi) Описание последовательности: SEQ ID NO:6 см. на фиг. 11.