способ получения трансгенного растения кукурузы
Классы МПК: | C12N15/82 для клеток растений C12N15/87 введение чужеродного генетического материала с использованием процессов, не предусмотренных в других рубриках, например совместной трансформации |
Автор(ы): | Ландквист Роналд С. (US), Уолтерс Дэвид А. (US), Кирихара Джули А. (US) |
Патентообладатель(и): | ДИКЭЛБ Дженетикс Корпорейшн (US) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1991-01-14 публикация патента:
10.07.1998 |
Способ предназначен для получения фертильных трансгенных растений кукурузы и может быть использован для введения в хромосому рекомбинантной ДНК. Реципиентные клетки, полученные из способной к регенерации рыхлой эмбриогенной каллусной культуры, обстреливают микрочастицами, покрытыми ДНК. Используется каллусная культура незрелых зародышей в виде комочков 30 - 80 мг, которая культивируется на твердой питательной среде. Вводимая ДНК может содержать ген, кодирующий белок семян, в результате чего содержание аминокислот увеличивается. 3 з.п.ф-лы. 8 ил., 9 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23
Формула изобретения
1. Способ получения трансгенного растения Zea mays, содержащего стабильно интегрированную в хромосому рекомбинантную ДНК, включающий получение реципиентных клеток, их трансформацию путем введения в них экзогенной ДНК, отбор трансформированных клеток и последующую регенерацию из них растений, отличающийся тем, что реципиентные клетки получают из способной к регенерации рыхлой эмбриогенной каллусной культуры, а трансформацию осуществляют путем обстрела реципиентных клеток микрочастицами, покрытыми рекомбинантной ДНК. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что каллусную культуру получают из незрелых зародышей. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обстрела микрочастицами используют каллусную культуру, имеющую вид комочков, масса каждого из которых составляет 30 - 80 мг. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что каллусную культуру культивируют на твердой питательной среде.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к получению трансгенных растений, в частности трансгенных растений кукурузы, и может быть использовано в сельском хозяйстве. Генетическая инженерия растений, которая предполагает изоляцию и обработку генетического материала (обычно в форме ДНК или РНК) с последующим введением этого генетического материала в растение или растительные клетки, открывает значительные перспективы для современного сельского хозяйства и селекции растений. Методами генетической инженерии можно увеличивать пищевую ценность сельскохозяйственных культур, повышать урожай, снижать затраты на производство продукции, обеспечивать устойчивость к вредителям, стрессу и засухе, осуществлять производство фармацевтического сырья, химических соединений и биологических молекул, а также получать другие полезные результаты. После идентификации, клонирования и переконструирования гена его необходимо также внедрить в нужное растение таким образом, чтобы полученное растение было одновременно фертильно и способно передавать данный ген своему потомству. В настоящее время разработано и доступно множество методов трансформации различных растений и растительных клеток при помощи ДНК. В основном это относится к двудольным растениям, но имеются также сообщения и об определенных достижениях в трансформации некоторых однодольных злаков. Однако некоторые виды злаков до сих пор было невозможно трансформировать каким-либо методом. Так, до настоящего изобретения не были известны технологии, которые позволяли бы получать устойчиво трансформированные растения Zea mays, в которых внесенная рекомбинантная ДНК передавалась бы в течение по крайней мере одного полового цикла. Отсутствие достижений в данной области подтверждается литературой и обсуждалось в ряде последних обзоров [40, 50, 5]. Некоторые испытанные или предложенные способы введения ДНК в клетки кукурузы предполагают использование электропорации, микроинъекции, обстрела микроскопическими частицами, слияния с липосомами, переноса, опосредованного Agrobacterium, макроинъекции или обработки раствором очищенной ДНК. Так например, в [14 и 37] сообщается о введении ДНК в кукурузу путем смешивания пыльцевых зерен с растворами ДНК и последующего нанесения этой пыльцы на пестики кукурузы. В упомянутых работах отсутствуют молекулярные данные, подтверждающие введение экзогенной ДНК в клетки кукурузы. В [54] описывается инкубация ДНК с пыльцой кукурузы с последующим опылением початков кукурузы и образованием семян. Сообщается, что растения, выращенные из этих семян, содержат внесенную ДНК, но отсутствует указание на то, что внесенная ДНК передается в течение полного полового цикла. В [19] сообщается о трансформации проростков Zea mays, опосредованной Agrobacterium. Доказательства были основаны на экспериментах, которые иногда могут быть ненадежными. К настоящему времени не сообщалось о дальнейших успехах в области трансформации с использованием пыльцы или переноса, опосредованного Agrobacterium. Сообщалось также, что в результате обстрела микрочастицами получались трансформированные клетки кукурузы. Данный метод описан в [45], а также в [55] . В [29] описывается получение трансформированных клеток кукурузы с помощью бомбардировки микрочастицами. Использованные клетки, однако, не были способны образовывать растения путем регенерации. Таким образом, не существует опубликованных протоколов, описывающих введение ДНК путем бомбардировки в способные к регенерации культуры кукурузных клеток любого типа. Не сообщалось также о стабильном введении гена в результате бомбардировки кукурузного каллуса с последующей регенерацией фертильных растений и передачей введенного гена в течение хотя бы одного полового цикла. В [53] описывается бомбардировка ДНК кукурузной пыльцы, нанесение ее на рыльца и образование семян, которые, по сообщению авторов, содержат экзогенную ДНК. Однако при этом отсутствуют доказательства того, что эта ДНК передавалась в течение полного полового цикла, и данная группа исследователей не сообщала о получении ими дальнейших результатов. Согласно [16] электропорация кукурузных протопластов приводила к образованию трансформированных клеток, хотя эти клетки не образовывали регенерированных растений. Следующая серьезная проблема, мешающая успешному получению фертильных растений кукурузы, заключается в отборе этих немногих трансформантов таким образом, чтобы ни регенерационная способность (в случае использования протопластов или клеточных культур), ни фертильность трансформантов не были нарушены. В связи с общей низкой частотой трансформантов, полученных при трансформации, та или иная процедура отбора часто оказывается необходимой. Такой отбор, однако, обычно предполагает использование какого-либо токсичного агента, например гербицида или антибиотика, который может отрицательно влиять на регенерационную способность или фертильность получаемых растений. С другой стороны, известно, что нетрансформированные протопласты, культивируемые клетки и каллусы кукурузы по меньшей мере могут регенерировать с образованием зрелых растений и что получаемые растения часто фертильны. Так, например, в [46] и [41] обсуждаются методы получения протопластов из клеточных культур и восстановления фертильных растений из этих протопластов. В [42] описываются попытки регенерации растений кукурузы из протопластов, изолированных из культур эмбриогенных клеток кукурузы. Однако до сих пор исследователям не удавалось определить, какие ткани или культуры кукурузы являются подходящими реципиентами экзогенной ДНК, в частности содержат полезное число клеток, которые рецептивны к экзогенной ДНК и будут стабильно ее интегрировать, и, в то же время, являются частью зародышевой линии, т.е. частью клеточной линии, ведущей к следующему поколению растений. Таким образом, исследования сталкиваются с дилеммой. В то время как некоторые способы трансформации приводили, по данным исследований, к получению трансформированных клеток кукурузы и определенные клетки и ткани были предложены в качестве потенциальных реципиентов в связи с их способностью образовывать растения путем регенерации, исследователям не удалось найти комбинацию приемов, которые обеспечили бы успешное получение трансформированных растений кукурузы, способных передавать введенную ДНК в течение одного полного полового цикла. Известен [43] способ получения трансгенного растения кукурузы (Zea mays), включающий в себя получение из растения реципиентных клеток, их трансформацию, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них растения, причем реципиентные клетки представляют собой протопласты, а трансформацию осуществляют путем электропорации. Однако полученные растения являются стерильными, кроме того, использованные методы получения клеточной линии были невоспроизводимы. Таким образом, задачей данного изобретения является создание способа получения трансгенных растений Zea mays, который бы позволил получить фертильные растения, которые бы передавали введенный ген потомству, а метод получения клеточной линии был бы воспроизводимым. Данная задача решается тем, что предложен способ получения трансгенного растения Zea mays, содержащего стабильно интегрированную в хромосому рекомбинантную ДНК, включающий получение реципиентных клеток, их трансформацию путем введения в них экзогенной ДНК, отбор трансформированных клеток и последующую регенерацию из них растений, в котором, согласно изобретению, реципиентные клетки получают из способной к регенерации рыхлой эмбриогенной каллусной культуры, а трансформацию осуществляют путем обстрела реципиентных клеток микрочастицами, покрытыми рекомбинантной ДНК. Целесообразно получать каллусную культуру из незрелых зародышей. Целесообразно для обстрела микрочастицами использовать каллусную культуру, имеющую вид комочков, масса каждого из которых составляет 30 - 80 мг. Целесообразно каллусную культуру культивировать на твердой питательной среде. На фиг. 1,а показана карта плазмидного вектора pHYGI1, использованного в примере 1. На фиг. 1,б показана соответствующая часть линеаризированного плазмидного вектора pHYGI1, включающая кодирующую последовательность НРТ и ассоциированные регуляторные элементы. Номера пар оснований начинаются с 5"-нуклеотида в последовательности, распознающейся указанными рестрикционными ферментами, начиная с сайта EcоRI на 5"-конце промотора 35S ВТМ. На фиг. 2,а показана карта плазмидного вектора pBII221, использованного в примере 1. На фиг. 2,б показан линеаризованный вектор pBII221, в частности участок от сайта расщепления Hind III до сайта EcoRI. На фиг. 3 показаны Саузерн-блот ДНК изолированной из каллусной линии РН1 и из контрольной нетрансформированной каллусной линии, а также схематическое изображение зондов pHYGIl, использованных в эксперименте. На фиг. 4 показаны Саузерн-блот ДНК листьев, изолированной из растений R0, регенерированных из линии РН1 и из нетрансформированного каллуса, а также схематическое изображение зондов PHYGI1, использованных в эксперименте. На фиг. 5 показаны Саузерн-блот ДНК листьев, изолированной из потомства R1 растений R0 PH1 и нетрансформированных растений R0, а также схематическое изображение зондов pHYGI1, использованных в эксперименте. На фиг. 6 показаны Саузерн-блот ДНК, изолированной из каллусной линии PH2 и из нетрансформированной контрольной каллусной линии, а также схематическое изображение зондов pHYGI1, использованных в эксперименте. На фиг. 7,а показана карта плазмидного вектора pZ27Z10, использованного в примере 2. На фиг. 7,б показана линеаризованная плазмида pZ27Z10, включающая кодирующую последовательность Z10 и ассоциированные регуляторные элементы. На фиг. 8 схематически показано положение ПЦР-праймеров в пределах химерного гена Z27 - Z10. Изобретение направлено на получение фертильных трансгенных растений и семян вида Zea mays, преимущественно имеющих повышенную пищевую ценность, растений, растительных тканей и семян, получаемых из этих трансгенных растений, а также их потомства и получаемых из них продуктов. Описанным способом могут быть получены любые растения данного вида, включая полевую, сладкую, кормовую кукурузу, а также другие разновидности кукурузы. "Трансгенными" в данном случае считаются любые клетки, клеточные линии, каллусы, ткани, части растений или растения, генотипы которых были изменены присутствием рекомбинантной ДНК (называемой в генной инженерии также гетерологичной, экзогенной или чужеродной ДНК), которая была введена в генотип растения в процессе генной инженерии или же была первоначально введена в генотип родительского растения в ходе такого процесса и затем передана последующим поколениям путем полового процесса или бесполого размножения. Генотипом в данном случае считается совокупность всего генетического материала клетки как хромосомного, так и внехромосомного. Таким образом, используемый в данном случае термин "трансгенный" не включает растения, генотипы которых изменены обычными методами скрещивания растений или в результате имеющих место в природе процессов случайного оплодотворения, вирусной инфекции или спонтанного мутирования. "Наследуемой" считается ДНК, способная передаваться в течение по меньшей мере одного полового цикла растения, то есть от растения через его гаметы к растению-потомку. В соответствии с данным изобретением трансгенные растения могут быть получены путем (1) основания способной к регенерации клеточной культуры, предпочтительно рыхлого эмбриогенного каллуса, (2) трансформации упомянутой клеточной культуры методом обстрела микрочастицами, (3) идентификации или отбора трансформированных клеток и (4) регенерации фертильных трансгенных растений из трансформированных клеток. Некоторые из растений, описываемых в данном изобретении, могут быть получены из трансгенных семян, полученных от фертильных трансгенных растений с использованием обычных методов скрещивания с целью получения трансгенных элитных линий и сортов или коммерческих гибридных семян, содержащих рекомбинантную ДНК. Линии растений и культуры тканейОсобенно полезными для получения фертильных трансгенных растений кукурузы оказались клетки каллусов, способные к регенерации как до, так и после селекционных процедур, детально описанных ниже. Такие клетки получают в основном из меристемной ткани, содержащей клетки, не прошедшие терминальную дифференцировку. Эта ткань у злаков вообще и у кукурузы в частности включает ткани, находящиеся в основаниях молодых листьев, молодых кистей, незрелых зародышах и узлах стеблей. Использовались преимущественно незрелые зародыши. Методы получения и поддержания каллуса из таких растений и таких тканей хорошо известны и подробно описаны в литературе, например в [39]. Конкретный используемый каллус должен быть способен образовывать путем регенерации фертильное растение. Специфическая регенерационная способность определенного каллуса важна для успеха используемого в данном случае процесса обстрела/отбора, поскольку в ходе селекции регенерационная способность существенно снижается. Поэтому важно работать с самого начала с культурами, имеющими максимально возможную регенерационную способность. Было установлено, что каллус в возрасте от 3 до 36 месяцев имеет достаточно высокую способность к регенерации и поэтому предпочтителен. Регенерационная способность конкретной культуры легко может быть определена путем перенесения проб этой культуры на регенерационную питательную среду и отслеживания роста побегов, корней и проростков. Относительное число проростков на чашку Петри или на грамм живого веса ткани может быть использовано для грубой количественной оценки регенерационной способности. В целом предпочтительна культура, производящая по меньшей мере одно растение на грамм ткани каллуса. Хотя каллусные культуры кукурузы могут быть основаны от различных тканей растения, использованные в данном случае культуры получаются предпочтительно из незрелых зародышей кукурузы, которые извлекаются из зерновок, находящихся в початке кукурузы, при достижении зародышами длины 1 - 3 мм. Такого размера они достигают обычно через 9 - 14 дн после опыления. Зародыши в стерильных условиях помещаются на обычную твердую среду таким образом, чтобы эмбриональная ось была направлена вниз (скутеллюмом вверх). Каллусная ткань появляется на скутеллюме через несколько дней или недель. После значительного подрастания каллуса пролиферация клеток скутеллюма может быть оценена на рыхлость и на присутствие сформированных зародышей. Под "рыхлостью" понимается способность ткани легко диспергироваться без повреждения клеток. Ткань такой морфологии переносится затем на свежую среду и пассируется обычными методами через каждые 2 недели. Просеивание с целью уменьшения образования комков и или для увеличения поверхности клеток также может использоваться при пассировании. Для инициации каллуса используются предпочтительно твердые среды. В предпочтительном варианте среда для основания и поддержания каллуса принципиально основана на солевой среде N 6 по [9], как описано в [3], или на солевой среде MS [34]. К минимальной среде добавляется сахароза и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). Было установлено, что добавки типа L-пролина и гидролизата казеина увеличивают частоту образования каллусных культур, а также улучшают их рост и морфологию. Обычно культуры поддерживаются в темноте, хотя возможно также использование низкой освещенности. Содержание синтетического гормона 2,4-Д, необходимого для поддержания и наращивания каллуса, обычно должно составлять от 0,3 до 3,0 мг л. Хотя в данном случае успешная трансформация и регенерация была достигнута с использованием рыхлого эмбриогенного каллуса, это не обязательно означает, что для получения фертильных трансгенных растений, предлагаемых в данном изобретении, не могут быть использованы другие способные к трансформации и регенерации клетки, ткани и органы. Единственное обязательное требование к трансформируемым клеткам заключается в том, что после трансформации они должны быть способны образовывать путем регенерации растения, несущие рекомбинантные ДНК, после использования каких-либо процедур отбора или скрининга. Например, могут быть использованы клетки, выращенные в жидкой суспензионной культуре. Для основания таких культур каллус второго типа в возрасте 4 - 6 месяцев переносится в жидкую ростовую среду. Методы получения способных к регенерации суспензионных клеточных культур и соответствующие ссылки приводятся в [21, 39 и 48]. Обычно жидкие ростовые среды для суспензионных культур сходны по составу с твердыми средами для индукции каллусов. Для повышения регенерационной способности и жизнеспособности культуры в жидкие ростовые среды может добавляться абсцизиновая кислота (АВА) в концентрации 10-7 М. Предпочтительно не просеивать каллус перед внесением в жидкую среду. Жидкие культуры пассируются так, как это необходимо для поддержания их активного роста и регенерационных свойств. В предпочтительном варианте применения культуры пассируются один раз в неделю путем разбавления свежей ростовой средой в отношении 1:8 - 1:9. ДНК, использованная для трансформации
Используемый термин "рекомбинантная ДНК" означает в данном случае ДНК, произведенную или выделенную (изолированную) из любого источника, которая затем может быть химически изменена и введена в Zea mays. Примером рекомбинантной ДНК, "произведенной" из некоторого источника, может быть последовательность ДНК, идентифицированная как полезный фрагмент в геноме какого-либо организма и затем химически синтезированная в практически чистом виде. Примером рекомбинантной ДНК, "выделенной" из некоторого источника, может быть полезная последовательность ДНК, вырезанная или извлеченная из этого источника химическими методами, например с использованием рестрикционных эндонуклеаз, таким образом, что в дальнейшем она может быть подвергнута обработке, например амплификации, с целью ее введения в организм методами генетической инженерии. Таким образом, понятие "рекомбинантная ДНК" включает в себя полностью синтетическую ДНК, полусинтетическую ДНК, ДНК, выделенную из биологических источников, и ДНК, происходящую от введенной РНК. Обычно рекомбинантная ДНК не происходит из генотипа Zea mays, являющегося реципиентом этой ДНК, но данное изобретение предусматривает возможность выделения гена из некоторого генотипа Zea mays с последующим введением множественных копий этого гена в тот же самый генотип, например с целью увеличения выхода продукта данного гена, например запасного белка. Рекомбинантные ДНК включают в себя ДНК генов растений или нерастительные гены, такие как гены бактерий, дрожжей, животных или вирусов, модифицированные гены, участки генов, химерные гены, включающие гены из того же самого или другого генотипа Zea mays; этот перечень, однако, не является исчерпывающим. Используемые для трансформации рекомбинантные ДНК могут быть кольцевыми или линейными, одно- или двунитевыми. Обычно ДНК присутствует в форме химерной, например плазмидной ДНК, которая может также включать кодирующие участки, фланкированные регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию рекомбинантной ДНК в полученных растениях кукурузы. Например, рекомбинантная ДНК может сама включать или нести промотор, активный в Zea mays, или может использовать промотор, уже существующий в генотипе Zea mays и являющийся мишенью трансформации. Состав и методы конструирования рекомбинантной ДНК, способной трансформировать определенные растения, хорошо известны опытным специалистам, и эти методы и составы могут быть использованы для получения ДНК, применяемой в данном случае. Конкретный состав ДНК не является принципиальным для данного изобретения, и при осуществлении изобретения могут использоваться различные рекомбинантные ДНК. В [50] описаны подходящие компоненты ДНК, пригодные для отбора маркерные гены, энхансеры, интроны и т.д., а также приведены соответствующие ссылки на получаемые составы. В [44] предложены подходящие методы конструирования. Обычно рекомбинантная ДНК относительно невелика, т.е. не превышает по длине 30 kb (30 000 пар оснований), что необходимо для снижения чувствительности к физической, химической или ферментативной деградации, которая, как известно, возрастает с увеличением размера ДНК. В качестве рекомбинантных ДНК в данном случае приемлемы любые ДНК, обеспечивающие или усиливающие какое-либо полезное свойство получаемого в результате трансгенного растения кукурузы. Эти ДНК могут кодировать белки или антисмысловые РНК-транскрипты, способствующие повышению пищевой ценности, устойчивости к вредителям, болезням и гербицидам и т.п. Например, ДНК может кодировать DHDP-синтетазу, как это делает ген dap A, что повышает количество получаемого лизина, бактерии Bacillus thuringiensis (Bt),
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114004/948.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
1. Основание и поддержание культур клеток кукурузы, сохраняющих способность к регенерации растений. Были основаны рыхлые эмбриогенные каллусные культуры кукурузы из незрелых зародышей, полученных при опылении растений инбредной линии Al 88 (University of Minnesota, Crop Improvement Association) пыльцой растений инбредной линии В73 (Iowa State University). Початки были собраны по достижении зародышами длины 1,5 - 2 мм. Поверхность каждого початка была стерилизована разбавленным наполовину (по объему) промышленным отбеливателем (2,63%-ным (по массе к объему) гипохлоритом натрия), в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем початки были промыты стерильной дистиллированной деионизированной водой. Незрелые зародыши были изолированы в стерильных условиях и помещены в питательную среду для основания и поддержания культур так, чтобы стеблекорневая ось оказалась в среде. Среда для основания и поддержания культур (в дальнейшем обозначаемая как среда F) состояла из минимальной среды N6 [9] с добавлением 2% (масса к объему) сахарозы, 1,5 мг/л 2,4- дихлорфеноксиуксуоной кислоты (2,4-Д), 6 мМ пролина и 0,25% гельрита (Kelco, Inc., San Diego). Перед автоклавированием величина pH была доведена до 5,8. Все манипуляции с культурами ткани производились в стерильных условиях, если не оговорено иначе. Незрелые зародыши инкубировались при 26oC в темноте. Пролиферация клеток скутеллюма незрелых зародышей оценивалась на рыхлость и на наличие сформированных соматических зародышей. Ткань с такой морфологией переносилась на свежую среду через 10 - 14 дн после первоначального высевания незрелых зародышей. Затем ткань пассировалась стандартными методами каждые 14 - 21 дн. Из кусочков ткани, достигших приблизительно 1 г, отбиралось и переносилось на свежую среду 60 - 70 мг ткани. При пассировании всегда производилось тщательное визуальное наблюдение за тем, чтобы поддерживалась только ткань с правильной морфологией. Наличие соматических зародышей гарантировало, что в подходящих условиях культуры произведут растения. Примером такой культуры была использованная в Данном примере культура клеток, названная AB11, основанная за один год до обстрела. 2. Плазмиды. Плазмида pHYGI1 была создана на основе вектора pBS+ (Stratagene, Inc., San Diego, CA), представляющего собой кольцевую плазмиду размером 3,2 kb), с использованием стандартных методов работы с рекомбинантной ДНК. Фермент Bc1-BamHI размером 553 пары оснований (п.н.), содержащий первый интрон гена Adh-1 кукурузы [8], был вставлен между 35S-промотором ВТМ и гигромицин-кодирующей последовательностью pCHN1-I, представляющей собой плазмиду, сконструированную в соответствии с примером 5. Карта pHYGI1 приведена на фиг. 1. В соответствии с Будапештским договором образец pHYGI1 был депонирован 16.03.90 под номером 40744 в American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. Плазмида рВII221 содержит последовательность, кодирующую
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114056/946.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114003/945.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114031/183.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114101/956.gif)
![способ получения трансгенного растения кукурузы, патент № 2114911](/images/patents/357/2114055/947.gif)
Запасной белок zein размером 10 кДа продуцируется в эндосперме зерновок кукурузы и является представителем класса белков, обозначаемых как "запасные белки семян". Этот белок содержит исключительно большое количество метионина (22,5%) и кодируется геном Zps10/(22) [4]; этот ген ниже обозначается как z10. Таким образом, повышенная экспрессия гена z10 может быть использована для увеличения содержания метионина в кукурузе. Получение фертильной трансгенной кукурузы, не сущей химерный ген z10, было достигнуто методами, описанными в примере 1, с некоторыми незначительными модификациями. В примере 2 также демонстрируется введение рекомбинантной ДНК с использованием линии каллуса, отличной от линии, использованной в примере 1. 1. Линии и культуры ткани. Линия эмбриогенного каллуса кукурузы, названная AB63S, использованная в данном примере, была получена из незрелых зародышей, полученных от скрещивания элитных инбредных линий A188 и В73 с использованием методов основания и поддержания, описанных в примере 1. Линия каллуса была основана примерно за 7 мес до обстрела. За 11 нед до обстрела ткань была просеяна под давлением через сеть с ячейками 1,3 мм и высеяна на среду для поддержания N6. Из полученной ткани через 1 - 2 нед роста был отобран рыхлый эмбрионный каллус, который затем был перенесен на свежую среду и подрощен в течение 1,5 - 3 нед перед повторным просеиванием. Этот цикл просеивания и восстановления рыхлого каллуса был повторен 3 раза перед обстрелом ткани. 2. Плазмиды. В данном примере были использованы описанные в примере 1 плазмиды pHYGI1 и рВII221. Кроме того, в ДНК/вольфрамовые образцы добавлялась плазмида pZ27Z10. Плазмида pZ27Z10 была сконструирована на основе вектора pUC118 [49], представляющего собой кольцевую плазмиду длиной 3,2 kb с использованием стандартных методов работы с рекомбинантными ДНК. Плазмида pZ27Z10 содержит 5"-область регуляции транскрипции гена 27кДа-zein кукурузы [18], обозначаемого здесь как Z27, помещенную непосредственно рядом с кодирующей последовательностью и 3"-некодирующей последовательностью гена 10кДа-zein кукурузы [37], обозначаемого здесь как Z10. Комбинация регуляторной последовательности Z27 с кодирующей и 3"- последовательностями Z10 обозначается здесь как химерный ген Z27-Z10. С 3"-конца последовательностей гена Z10 в плазмиде pZ27Z10 располагается сигнал полиаденилирования из района генома ВТМ, прилежащего к 35S-промотору. Карта этой плазмиды представлена на фиг. 7. Образец плазмиды pZ27Z10 депонирован в American Type Culture Collection, Rockville, MD, в соответствии c Будапештским договором под номером АТСС 40938. 3. Процесс введения ДНК. Ткань линии эмбриогенного каллуса кукурузы AB63S субкультивировалась в течение трех недель обстрелом микрочастицами. Ткань была подготовлена для обстрела путем просеивания через сито с размером ячейки 1,9 мм. Просеянная ткань высаживалась на стерильные круглые фильтры Whatman No. l диаметром 5,5 см в виде тонкого газона (примерно 500 мг ткани на фильтр). Всего было приготовлено 6 фильтров с тканью. Перед обстрелом микрочастицами фильтры с тканью переносились в пустые чашки Петри. Ткань слегка высушивалась в открытых чашках в ламинарном потоке в течение 20 мин. Для предотвращения дальнейшего высыхания ткани чашки хранились в резервуаре с высокой влажностью до самого обстрела. Использованная для обстрела ДНК состояла из плазмид pHYGI1 pZ27Z10 и pBII221 в соотношении 1:1:1 (по массе). Осаждение ДНК на вольфрамовых частицах производилось, как описано в примере 1. Обстрел производился, как описано выше в примере 1, за исключением того что использовался прибор Biolistic PDS 1000 (DuPont) и над тканью не помещалось никакой сетки. Шесть фильтров с каллусной тканью были обработаны следующим образом: два фильтра были обстреляны ДНК/вольфрамовыми образцами по два раза каждый (потенциальная позитивная обработка 2Х); три фильтра были обстреляны по одному разу (потенциальная позитивная обработка IX) теми же ДНК/вольфрамовыми образцами; и один фильтр был обстрелян водно-вольфрамовой суспензией с тем же количеством вольфрама (по массе), что и в ДНК/вольфрамовых обработках (негативный контроль). 4. Отбор трансформированного каллуса. После обстрела фильтры с каллусной тканью из обработки 2X были перенесены на чашки первого цикла отбора, а именно на среду F, содержащую 15мг/мл гигромицина. Два фильтра из обработки 1X и фильтр из негативного контроля также были перенесены на среду первого цикла отбора. Третий фильтр обработки 1X был перенесен на среду F без гигромицина для использования в качестве неселектируемого контроля. Поскольку этот неселектируемый контрольный каллус был потенциально позитивным, он единственный поддерживался в течение первых двух циклов отбора в целях сравнения; впоследствии в качестве неселектируемого контрольного каллуса использовался необстрелянный каллус AB63S, поддерживаемый на среде F без гигромицина. Через 5 дн каллус был перенесен в виде маленьких комочков (приблизительно по 25 мг) с фильтров на свежую среду первого цикла отбора. Плотность посева составляла 10 комочков на чашку. К этому времени масса каллуса увеличилась приблизительно в два раза. Неселектируемый контрольный каллус был перенесен сходным образом на среду F без гигромицина. На девятнадцатый день после обстрела все образцы ткани были перенесены со среды первого цикла отбора на среду второго цикла отбора (на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина). Плотность посева составляла при этом переносе 14 комочков каллуса на чашку. За 14 дн после предыдущего пересева объем каллуса увеличился примерно втрое. Через 23 дн все каллусы были перенесены со среды второго цикла отбора на среду третьего цикла отбора, содержащую 60 мг/л гигромицина. Через 59 дн после обстрела среди отмирающих комочков каллуса было обнаружено пять живых пролиферирующих участков. Предполагается, что эти пять участков происходили из единственного комочка каллуса, прошедшего второй цикл отбора, поскольку они находились близко один к другому на последовательных чашках с предыдущего посева. Эти участки происходили из обработки 2Х и были обозначены как линия каллуса Met1. Линия каллуса Met1 была перенесена на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина, и на среду F без гигромицина. После 22 дн инкубации отсутствовали видимые различия в росте и внешнем виде ткани на этих двух типах среды. Линия каллуса Met1 росла быстро и, очевидно, не ингибировалась присутствием гигромицина в среде. Каллус Met1 оказался очень рыхлым и эмбриогенным на обеих средах и был визуально неотличим от контрольного каллуса AB63S, выращиваемого на среде F без гигромицина. 5. Подтверждение трансформации каллуса. Было изучено ингибирование каллуса Met1 и контрольного каллуса AB63S. До начала изучения ингибирования каллус Met1 подращивался на среде F без гигромицина в течение 21 дн. Каллус Met1 и контрольный каллус AB63S переносились на чашки со средой F, содержавшей 0, 15, 60, 100 и 200 мг/л гигромицина. Для каждой концентрации гигромицина было приготовлено по 3 чашки с каждой линией каллуса; на каждую чашку помещалось по 5 - 6 кусочков каллуса приблизительно по 50 мг (в общей сложности на каждую чашку приходилось по 300 мг каллуса). Через 28 дн инкубации была измерена масса каллуса на каждой чашке. Степень ингибирования роста (в %) определялась путем деления средней массы каллуса, полученного при каждой концентрации гигромицина. Результаты показали, что рост каллуса Met1 абсолютно не ингибировался при концентрации гигромицина 15, 60 и 100 мг л. На среде, содержащей 200 мг/л гигромицина, рост каллуса Met1 был подавлен примерно на 20%. В отличие от этого, рост каллуса AB63S был подавлен при любой концентрации гигромицина; при концентрации гигромицина 200 мг/л рост каллуса AB63S подавлялся на 90%. Эти результаты подтверждали, что линия каллуса Met1 проявляла устойчивость к гигромицину в ростовой среде. Для доказательства присутствия в ДНК каллуса Met1 гена устойчивости к гигромицину и для установления того, приобрел ли этот каллус также химерный ген Z27-Z10, был проведен Саузерен-блоттинг. Для обнаружения последовательности, кодирующей НРТ, образцы ДНК, выделенные из каллуса Met1 и из контрольного каллуса, расщеплялись рестриктазами BamHI, HindIII и BstEII. Образцы расщепленной ДНК разделялись элекрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле и переносились на фильтр Nytran, как описано в примере 1. Проведенный перед блоттингом визуальный анализ геля, окрашенного бромистым этидием, показал, что рестриктаза BamHI полностью расщепляла ДНК, тогда как ни HindIII, ни BstEII не расщепляли ДНК в значительной степени. Блоты гибридизировались с BamHI-фрагментами кодирующей последовательности НРТ размером 1,05 Kb, меченными биотином. Условия гибридизации, отмывки и проявления соответствовали указанным в наборе реактивов BRL Photone, использованном в этом эксперименте. После гибридизации на дорожках, содержащих ДНК Met1, расцепленную BamHI, были обнаружены меченые полосы в ожидаемой области 1,05 kb, а также в областях приблизительно 2,7, 4,5 и 6,5 kb. Эти результаты показали, что в ДНК из линии каллуса Met1 присутствовала последовательность, кодирующая НРТ. Дополнительные полосы в областях 2,7, 4,5 и 6,5 kb показывали, что или ферментативное расщепление было неполным, или в ДНК присутствовали множественные перестроенные копии последовательности НРТ. При неполном расщеплении рестриктазами HindIII и BstEII на обеих дорожках были видны сигналы гибридизации в области, соответствующей нерасщепленной ДНК. Этот результат показывал, что последовательность, кодирующая НРТ, в геноме Met1 была интегрирована в ДНК с большой молекулярной массой. На дорожках, содержащих расщепленную ДНК из контрольного каллуса, сигналы гибридизации отсутствовали. Образцы ДНК, выделенные из каллуса Met1 и из контрольного каллуса, были проанализированы Саузерн-блоттингом для обнаружения химерного гена Z27-Z10. Образцы ДНК расщеплялись рестриктазами BamHI и EcoRI. При расщеплении BamHI высвобождался фрагмент размером 2,76 кb, содержащий кодирующую последовательность Z10 и 3"-некодирующую последовательность конструкции pZ27Z10, использованной в данной трансформации. Плазмида pZ27Z10 размером 7,26 Kb содержит уникальный сайт EcoRI. Приготовленный блот гибридизовался с меченным биотином зондом, содержащим полную кодирующую последовательность Z10, в условиях, описанных в наборе реактивов Photogene. При расщеплении ДНК BamHI эндогенные последовательности Z10 давали сигналы гибридизации в областях 9 kb и около 15 kb как на дорожках, содержащих ДНК Met1, так и на дорожках с ДНК контрольного каллуса. В образце ДНК Met1, но не в ДНК контрольных образцов была отмечена также дополнительная полоса в области приблизительно 3,5 kb. В ожидаемой области 2,76 kb ДНК Met1 отсутствовали сильные сигналы гибридизации. Отсутствие маркированной полосы 2,7 kb при расщеплении ДНК Met1 BamHI свидетельствовало или о неполном расщеплении ДНК, или о перестройке введенной ДНК. При расщеплении ДНК Met1 и ДНК контрольного каллуса рестриктазой EcoRI эндогенные последовательности Z10 в обоих случаях давали гибридизационные сигналы в областях приблизительно 12 и 16 kb. В образце ДНК Met1, но не в контрольном образце, была отмечена дополнительная полоса в области приблизительно 14 kb. Эти результаты показывали, что в ДНК каллуса Met1 присутствовали новые последовательности Z10, отсутствовавшие в образцах ДНК контрольного каллуса. Эти результаты были подтверждены другим Саузерн-блоттингом, для которого ДНК Met1 и контрольного каллуса была расщеплена рестриктазами BamHI, NcoI и Nsil. Были проанализированы также образцы нерасщепленной ДНК Met1 и контрольного каллуса. Фильтр гибридизовался с зондом, содержавшим кодирующую последовательность Z10 и меченным 32Р. При всех вариантах расщепления в ДНК каллуса Met1 были отмечены новые сигналы гибридизации Z10, отсутствовавшие в образцах ДНК из каллуса негативного контроля. Эти результаты подтверждали присутствие новых кодирующих последовательностей Z10 в каллусе Met1. На дорожках с нерасщепленной ДНК, как каллуса Met1, так и контрольного каллуса, были отмечены сигналы гибридизации в области нерасщепленной ДНК. Эти результаты показали, что введенные последовательности Z10 были интегрированы в хромосомную ДНК каллуса Met1. 6. Регенерация растений и получение трансгенных семян. Каллус линии Met1 и контрольной линии AB63S был помещен на среду RM5, как описано в примере 1. Через 14 дн инкубации при 26oC в темноте каллус был перенесен на среду R5, описанную в примере 1. Каллус инкубировался в течение 7 дн при 26oC в темноте и затем был перенесен в световой режим, описанный в примере 1. Через 14 дн на свету проростки были пронесены в коробки Magenta (Sigma Chemical Co.), содержащие по 10 мл среды R5. Через 7 - 14 дн нахождения в этой среде проростки были перенесены на вермикулит на 7 дн и затем в почву, где выращивались до созревания. Всего из каллуса Met1 было регенерировано 49 растений (обозначенных как Met1.1 - Met1.49), а из контрольного каллуса AB63S было регенерировано в общей сложности 25 растений. Для подтверждения того, что растения, регенерированные из каллуса Met1, сохранили введенную ДНК, был проведен ПЦР-анализ образцов ДНК, выделенных из листовой ткани. Для этой цели было использовано шесть олигодезоксирибонуклеотидных праймеров. Последовательности этих олигонуклеотидов, их ориентация и относительное положение в химерной конструкции гена Z27-Z10 приведены на фиг. 8 и в табл. 4. Набор олигонуклеотидов (праймеров) был выбран таким образом, чтобы пара олигонуклеотидов, состоящая из одного олигонуклеотида Z27 (Z275" или Z27mid) и одного олигонуклеотида Z10 (Z10mid. или Z103") делала бы возможной амплификацию фрагментов только химерного гена Z27-Z10, но не собственных генов кукурузы Z27 или Z10. Появление амплифицированных фрагментов ожидаемой длины в полимеразных цепных реакциях, использующих эти специфичные для Z27-Z10 пары олигонуклеотидов, свидетельствовало о наличии в образце ДНК конкретного каллуса или растения химерного гена Z27-Z10. Использование пары олигонуклеотидов Z27 (Z275" или Z27mid в сочетании с Z273") или пары олигонуклеотидов Z10 (Z10mid или Z103" в сочетании с Z105") приводило к амплификации соответственно кодирующих последовательностей Z10 или регуляторных последовательностей Z27 в полимеразных цепных реакциях с участием ДНК контрольного каллуса AB63S, ДНК каллуса Met1 или плазмиды pZ27Z10. Эти реакции служили в качестве позитивных контролей при амплификации последовательностей собственных генов кукурузы в образцах ДНК конкретного каллуса или растения. Из листьев двух растений R0 Met1 (обозначенных как Met1 и Met1-2) и одного контрольного растения R0 AB63S была выделена ДНК, как описано выше. В полимеразных цепных реакциях с участием этих образцов ДНК использовались пары олигонуклеотидов, специфичных для кодирующей последовательности НРТ, химерного гена Z27-Z10, регуляторной последовательности Z27 и кодирующей последовательности Z10. Разделение продуктов ПЦР в геле показало, что во всех реакциях с участием ДНК Met1-1 и Met1-2 были получены продукты амплификации ожидаемого размера. В контрольной ДНК AB63S отсутствовали кодирующая последовательность НРТ и химерный ген Z27-Z10, но присутствовали собственная регуляторная последовательность Z27 и кодирующая последовательность Z10. Эти результаты показали, что изученные растения R0 Met1 сохранили введенную ДНК НРТ и химерную ДНК Z27-Z10. Для дополнительного подтверждения того, что продукты диагностической полимеразной цепной реакции Z27-Z10 действительно содержали регуляторные последовательности Z27 и кодирующие последовательности Z10, был проведен Саузерн-блоттинг продуктов ПЦР. Были получены Саузерн-блоты двух агарозных гелей, на которые были нанесены одинаковые образцы. Образцы содержали продукты ПЦР, полученные при амплификации регуляторных последовательностей Z27, кодирующих последовательностей Z10 и последовательностей химерного гена Z27-Z10 описанным выше способом. Один из блотов гибридизовался с зондом, представляющим собой кодирующую последовательность Z10, а другой - с регуляторной последовательностью Z27. Результаты показали, что кодирующая последовательность Z10 гибридизовалась с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием кодирующей последовательности Z10 и химерного гена Z27-Z10, но не с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием регуляторной последовательности Z27. Сходным образом, зонд Z27 гибридизовался с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием регуляторной последовательности Z27 и химерного гена Z27-Z10, но не с амплифицированными фрагментами, полученными в полимеразных цепных реакциях с участием кодирующей последовательности Z10. Эти результаты показали также, что амплифицированные в полимеразных цепных реакциях фрагменты содержали ожидаемые последовательности генов и что продукт диагностической ПЦР-амплификации химерного гена Z27-Z10 содержал как регуляторные последовательности Z27, так и кодирующие последовательности Z10. Было проведено контролируемое опыление зрелых растений R0 Met1 с участием инбредных линий кукурузы A188, В73, А654 и Н99. Кроме того, было проведено несколько актов самоопыления и опыления сибсов. Всего было проведено 130 опылений, причем растения R0 Met1 использовались и как мужские (доноры пыльцы), и как женские (реципиенты). Зрелые семена были собраны через 45 дн после опыления и затем подсушены в течение 1-2 нед. 7. Анализ потомства R1. Наличие последовательности НРТ и химерного гена Z27-Z10 в ДНК тканей растений R1 оценивалось в трех выборках потомства R1 при помощи ПЦР. Первая пранализированная выборка потомства R1 содержала четыре незрелых соплодия R0 Met 1-7. Эти соплодия были получены путем открытого опыления пестиков соцветий Met 1-7. Приблизительно через 18 дн после опыления соплодия были отделены от растения, и их поверхность была стерилизована. Эндосперм каждого семени вырезался, замораживался сухим льдом и хранился при -70oC вплоть до его использования для выделения ДНК. Зародыш из каждого семени переносился на среду R5 и проращивался. Через 10 дн проростки переносились на вермикулит на 7 дн и затем в почву, где выращивались до созревания. ДНК каждого эндосперма выделялась и анализировалась при помощи ПЦР с использованием набора олигонуклеотидов, специфичных для кодирующей последовательности НРТ, химерного гена Z27-Z10 и гена Adh-1 кукурузы. В трех из четырех образцов ДНК эндосперма были обнаружены все упомянутые последовательности. В четвертом образце ДНК эндосперма отсутствовали кодирующая последовательность НРТ и последовательность химерного гена Z27-Z10, но присутствовала собственная последовательность Adh-1. Эти результаты показали, что последовательности НРТ и химерного гена Z27- Z10 были переданы потомству R1 растений Met1-7. Аналогичным образом было проанализировано 24 семени из скрещивания А654 Х Met1-1. Через 24 дн после опыления семена извлекались из початков и их поверхность стерилизовалась. Зародыши и эндоспермы изолировались и обрабатывались описанным выше образом. ПЦР-анализ образцов ДНК эндосперма показал, что 9 из 24 потомков унаследовали как последовательности НРТ, так и химерный ген Z27-Z10. Остальные 15 потомков не несли ни одной из введенных последовательностей. Третья проанализированная выборка растений поколения R1 состояла из 28 растений R1, полученных при самоопылении растения Met1-6 поколения R0. Образцы ДНК выделялись из ткани листьев 28 двухнедельных проростков. ПЦР-анализ образцов ДНК листьев показал, что 24 потомка поколения R1 несли как последовательности НРТ, так и химерный ген Z27-Z10. Оставшиеся четыре потомка R1 не несли ни одной из введенных последовательностей. Результаты описанного выше анализа приведены в табл. 5 и показывают, что значительная часть поколения R1 потомства Met1 унаследовала введенную ДНК. Отношение числа растений Z27Z10+/HPT+ к числу растений Z27Z10-/HPT-, полученных в перекрестно скрещивающейся популяции, соответствует отношению 1: 1, характерному для расщепления по одному локусу. Кроме того, отношение числа растений Z27Z10+/HPT+ к числу растений Z27Z10-/HPT-, полученных в самоопыляющейся популяции, соответствует однолокусному расщеплению 3:1. Данные свидетельствуют также о сцеплении введенных последовательностей НРТ и Z27-Z10. Пример 3. Фертильные трансгенные растения из линии каллуса AB12, содержащие рекомбинантную ДНК, кодирующую инсектицидный белок
Было показано, что белки, кодирующиеся различными генами Bacillus thuringiensis, в ряде случаев могут быть использованы в качестве пестицидов. Получение трансгенных растений кукурузы со специфическими гетерологическими генами Bt может усилить устойчивость растений к специфическим вредителям. Фертильные трансгенные растения, содержащие рекомбинантный ген Bt, были получены по методам, описанным в примере 1, с несколькими незначительными модификациями, описанными ниже. Одновременно с линией каллуса AB11, использованной в примере 1, была основана другая линия. Линия AB12 была получена от отдельного скрещивания растений с теми же самыми родительскими генотипами (A188 Х В73). Этот пример демонстрирует регенерацию фертильных трансгенных растений из третьей линии каллуса в дополнение к линиям AB11 и AB63S и показывает, что получение фертильных трансгенных растений не было связано со свойствами, уникальными для одной линии каллуса. Была использована плазмида pHYGI1, описанная в примере 1, а также плазмида pMS533, содержащая ген инсектицидного эндотоксина Bacillus thuringlensis (ВТ), слитый в одной рамке считывания с геном неомицинфосфотрансферазы (NPTII). С 5"-конца от слитного гена расположены участки ДНК промоторов ВТМ и нопалинсинтетазы. С 3"-конца от слитного гена расположены последовательности ДНК, входящие в ген ингибитора протеазы I томатов и район полиаденилирования гена нопалинсинтетазы. Каллус был обстрелян так, как описано в примере 1, за исключением того что ДНК, использованная в ДНК/вольфрамовых образцах, содержала плазмиды pHYGI1 и рМS533. Одна пробирка содержала только 5 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА). Были проведены следующие варианты обстрела: 11 X pHYGI1/pMS533 (потенциальная позитивная обработка) и 3 х ТЕ (контрольная обработка). После обстрела каллус, обработанный pHYGI1/pMS533, помещался на чашки первого цикла отбора со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина, по 10 кусочков каллуса на чашку. То же самое было проделано с двумя чашками, обстрелянными ТЕ (селектируемый контрольный каллус). Каллус с одной из чашек, обстрелянных ТЕ, был перенесен на среду F, без гигромицина; этот каллус поддерживался в течение всего эксперимента в качестве источника контрольной ткани (неселектируемый контрольный каллус). Через 18 дн каллус был перенесен с чашек первого цикла селекции на чашки второго цикла селекции со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина; на каждую чашку было помещено 10 кусочков каллуса по 30 мг. Через 21 дн отбора на чашках второго цикла каллус оказался полностью подавлен. Все каллусы были перенесены на чашки третьего цикла отбора со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина. Через 42 дн отбора на чашках третьего цикла на фоне некротической ткани было обнаружено 6 участков пролиферирующего каллуса; все они происходили от материала, обработанного pHYGI1/pMS533. Эти линии каллуса были перенесены на среду F. Через 24 дн одна из каллусных линий, обозначенная как СВ2, значительно выросла. После этого части каждой каллусной линии были перенесены на среду F, содержащую 15 мг/л гигромицина, и на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина. Контрольный каллус был помещен на среду F, содержащую 15 мг/л гигромицина. Только одна из шести каллусных линий, СВ2, была способна поддерживать устойчивый рост при многократном пассировании в присутствии 60 мг/л гигромицина. Из выборок этого каллуса была выделена ДНК, и присутствие гена Bt было подтверждено Саузерн- блоттингом. ДНК была расщеплена одновременно рестриктазами BamHI и Xhol. BamHI режет 5"- конец кодирующей последовательности Bt, a XhoI режет 3"-конец кодирующего района. Из рестрикционного BamHI/XhoI-фрагмента плазмиды pMS533 размером 1,8 kb был приготовлен меченный 32P зонд. После гибридизации и авторадиографии была отмечена предсказанная полоса в области 1,8 kb. В ДНК из нетрансформированного каллуса полос отмечено не было. Из каллуса СВ2 были регенерированы растения, и были проведены контролируемые опыления описанным выше способом, что позволило получить поколение R1. Растения R1 были проанализированы на присутствие последовательностей генов НРТ и Bt при помощи ПНР и на экспрессию гена НРТ при помощи ферментного анализа, как описано в примере 1. Для проведения ПЦР использовалась ДНК, выделенная из корневой ткани проростков, при этом использовались методы, описанные в примере 1. Для проверки пригодности каждого образца ДНК для проведения ПЦР была проведена ПЦР с использованием праймеров, специфичных для нативного гена 10 кДа-zein кукурузы. Один из праймеров, использованных для ПЦР-анализа гена Bt, был комплементарен 35S-промотору, а другой - кодирующей последовательности Bt. Для ПЦР-анализа гена НРТ были использованы те же праймеры, что и в примере 1. Результаты этого анализа приведены в табл. 6. Эти результаты показывают, что введенные гены НРТ и Bt передаются и через мужских, и через женских родителей и что наблюдаемые частоты соответствуют менделевскому наследованию. Эти результаты подтверждают гипотезу о встраивании генов НРТ и Bt в хромосомную ДНК. Было также показано, что гены НРТ и Bt наследуются сцепленно; это показывает, что эти два гена встроены в одну и ту же хромосому недалеко друг от друга. Пример 4. Фертильные трансгенные растения из каллусной линии AB12, передающие рекомбинантную ДНК в течение двух полных половых циклов
1. Линии растений и культура тканей. Была использована каллусная линия AB12, описанная в примере 3. 2. Плазмиды. Были использованы плазмиды рВII221 и pHYGI1, описанные в примере 1. 3. Процесс введения ДНК. Каллус был обстрелян, как в примере 1, за исключением того, что в ДНК/вольфрамовых образцах была использована другая ДНК. Каждая пробирка содержала по 25 мкл взвеси вольфрама N-10 в воде (50 мг/мл), 25 мкл 2,5 M CaCl2 и 10 мкл 100 мМ спермидина, а также 5 мкл раствора плазмидной ДНК с общей концентрацией ДНК 1 мг/мл. Одна пробирка содержала только плазмиду рВII221, две пробирки содержали только плазмиду pHYGI1 и одна пробирка вообще не содержала плазмид, но содержала 5 мкл буфера ТЕ. Были проведены следующие варианты обстрела: 2 Х рВII221 (для промежуточной экспрессии), 7 X pHYGI1 (потенциальная позитивная обработка) и 3 x ТЕ (негативная контрольная обработка). После проведения всех обстрелов каллус, обработанный рВII221, был перенесен на среду F. С каждой чашки каллуса на отдельную чашку со средой F переносилось 5 кусочков по 50 мг. Через два дня каллус был помещен в буфер для анализа GUS, описанный в примере 1. Было подсчитано число клеток с промежуточной экспрессией GUS, оказавшееся равным 686 и 845 GUS-положительным клеткам; это показывало, что процесс введения частиц произошел и на других обстрелянных чашках. 4. Отбор трансформированного каллуса После обстрела каллус, обработанный pHYGI1, был помещен на чашки первого цикла отбора со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина; на каждую чашку было помещено 10 кусочков каллуса по 25 мг. То же самое было проделано с каллусом из двух чашек, обстрелянных ТЕ (селектируемый контрольный каллус). Каллус c одной из чашек, обстрелянных ТЕ, был помещен на среду F без гигромицина; этот каллус поддерживался на протяжении всего эксперимента в качестве источника контрольной ткани (неселектируемый контрольный каллус). Через 13 дн каллус на чашках первого цикла отбора был неотличим от неселектируемого контрольного каллуса. Все каллусы были перенесены с чашек первого цикла отбора на чашки второго цикла отбора со средой, содержащей 60 мг/л гигромицина. Количество чашек увеличилось приблизительно в 5 раз. Через 23 дн масса каллуса на чашках второго цикла отбора существенно увеличилась, но к этому моменту каллус оказался близок к некротическому состоянию. Все каллусы были перенесены с чашек второго цикла отбора на чашки третьего цикла отбора со средой, содержащей 60 мг/л гигромицина. Через 58 дн после обстрела на фоне мертвой ткани было обнаружено 3 живых полиферирующих участка. Эти три линии происходили из обработок pHYGI1 и были обозначены как 24C, 56A и 55A. Через 15 дн на поддерживающей среде был отмечен рост линий. Линия 24С росла хорошо, тогда как линии 55A и 56A росли медленнее. Все три линии были перенесены на среду F, содержащую 60 мг/л гигромицина. Неселектируемый контрольный каллус также был перенесен с поддерживающей среды на среду F с 60 мг/л гигромицина. Через 19 дн на среде с 60 мг/л гигромицина рост линии 24C оказался абсолютно не подавленным, тогда как увеличение массы контрольного каллуса составило 80% от массы линии 24C. Линия 56A полностью некротировала, а линия 55A была очень близка к некротическому состоянию. Линии 24C и 55A были вновь перенесены на среду F, содержащую HPT. B ДНК контрольной ткани полос отмечено не было. Линия каллуса 24С была переименована в PHS. Для доказательства того, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой, выделенная из каллуса РНЗ и из контрольного каллуса ДНК была обработана (1) без рестриктаз, (2) рестриктазой BamHI, как описано выше, и (3) рестриктазой PstI, имеющей уникальный сайт в пределах кодирующей последовательности HPT плазмиды pHYGI1. ДНК переносилась на фильтр и гибридизовалась с использованной в качестве зонда кодирующей последовательностью HPT описанным выше образом. Нерасщепленная ДНК PH2 гибридизовалась с зондом только в области, соответствовавшей нерезаной ДНК; это показывало, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой. Как было показано ранее, при рестрикции ДНК PH2 рестриктазой BamHI наблюдается ожидаемая полоса в области 1,05 kb. Если бы ген устойчивости к гигромицину находился в составе интактной плазмиды pHYGI1, то при рестрикции ДНК PH2 рестриктазой PstI следовало бы ожидать появления полосы в области 5,9 kb. В случае интеграции гена в геномную ДНК следует ожидать появления двух и более полос изменчивого размера (размер зависит от положения сайтов PstI в последовательностях, фланкирующих ген в хозяйской ДНК). Реально были обнаружены две полосы с молекулярной массой приблизительно 6,0 и 3,0 kb. Эти данные подтверждают встраивание гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. ДНК контрольного каллуса не гибридизовалась с зондом ни при какой из описанных обработок. Эти результаты показывают, что кодирующая последовательность HPT присутствует в каллусе PH2 не в составе интактной плазмиды pHYGI1 и не в составе небольшой внехромосомной плазмиды. Напротив, они подтверждают встраивание гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. Проведенный впоследствии Саузерн- блоттинг показал, что кодирующая последовательность НРТ и 35S-промотор входят в состав одной непрерывной последовательности. 6. Регенерация растений и получение семян. Линия PH2 и неселектируемый контрольный каллус были помещены на среду RM5 для регенерации растений, как в примере 1. Через 16 дн каллус был перенесен на среду R5, также описанную в примере 1. Через 25 дн на среде R5 проростки были перенесены на свежую среду R5 и выращивались на ней в течение 20 дн. После этого проростки были перенесены на вермикулит на одну неделю и затем высажены в почву, где выращивались до полового созревания. Затем были проведены контролируемые опыления с участием линии В73. 7. Анализ потомства R1. A. РН2 в качестве донора пыльцы. Десять растений R1 от скрещивания В73 Х РН2.6 были проанализированы на экспрессию НРТ с использованием корневой и листовой ткани. Одно из растений дало положительный ответ. Наличие гена НРТ в этом растении было подтверждено Саузерн-блоттингом с использованием зонда НРТ, как описано в примере 1. Для анализа удлинения корня семена были стерилизованы разбавленным в два раза промышленным отбеливателем (водный раствор) с добавлением 0,1% алканокса в течение 20 мин в баночках Erlenmeyer объемом 125 мл и 3 раза отмыты стерильной водой. Семена насыщались водой с добавлением 50 мг мл каптана в течение ночи при встряхивании с частотой 150 об/мин. После набухания семян раствор сливался и семена переносились в проточные коробки (Flow Laboratories) с тремя слоями пропитанной водой бумаги для проращивания семян. Четвертый слой пропитанной водой бумаги для проращивания семян был помещен поверх семян. Затем семена проращивались в течение четырех дней. После прорастания семян с каждого проростка срезался приблизительно 1 см верхушки первичного корешка, который затем помещался на среду, содержавшую соли MS, 20 г/л сахарозы, 50 мг/л гигромицина и 0,25% гельрита, и инкубировался в темноте четыре дня при 26oC. Корни анализировались на присутствие либо отсутствие обильных корневых волосков и боковых корней. Корни классифицировались на трансгенные (устойчивые к гигромицину), если они имели корневые волоски и боковые корни, и нетрансформированные (чувствительные к гигромицину), если они имели ограниченное число ответвлений. После отрезания верхушек корешков проростки с одного початка РН2 и одного контрольного початка переносились на влажный вермикулит и подращивались в темноте в течение пяти дней. После этого для проведения анализа этиолированных листьев с верхушки первичного побега делались срезы по 1 мм, поверхность которых затем стерилизовалась в течение 10 с, после чего они помещались на среду, содержавшую соли MS, 20 г/л гельрита и (кроме контроля) 100 мг/л гигромицина, и инкубировались 18 ч в темноте при 26oC. На каждую чашку помещалось по 2 среза каждого побега. Затем чашки инкубировались при световом режиме, включающем 14 ч света и 10 ч темноты, при 26oC в течение 48 ч, после чего их цвет оценивался по шкале от 0 (полностью коричневые) до 6 (полностью зеленые) для определения процента зеленой окраски в ткани листьев. Побеги классифицировались на нетрансформированные (чувствительные к гигромицину), если им был присвоен нулевой балл, и трансформированные (устойчивые к гигромицину), если им был присвоен балл 3 или более. В. PH2 в качестве реципиентов пыльцы. 80 растений поколения R1 потомства РН2 от скрещивания РН2.23 Х В73 были проанализированы на экспрессию НРТ с помощью анализа удлинения корня, 26 из них дали положительный ответ. Для всех 26 растений экспрессия гена НРТ была затем подтверждена непосредственным высаживанием проростков на гигромицинсодержащую среду в проточных коробках. Два устойчивых растения были проанализированы при помощи ПЦР, и в них было подтверждено присутствие последовательности НРТ. 8. Анализ поколения потомства R2. Трансгенное растение R1, имевшее PH2 в качестве мужского родителя, было выращено до созревания и использовано для опыления растения FR 4326. Семена R2 от этого скрещивания были пророщены и проанализированы на присутствие последовательностей НРТ при помощи ПЦР. Экспрессия гена НРТ была определена при помощи ферментного анализа НРТ, описанного в примере 1. Три из 19 проанализированных потомков содержали последовательности гена НРТ и экспрессировали фермент НРТ. Остальные не содержали последовательностей НРТ и не проявляли активности фермента. Этот результат подтверждает передачу через пыльцу и экспрессию ДНК, введенной при помощи генной инженерии, через два последовательных поколения, показывая тем самым, что ген стабилен. Пример 5. Использовалась рыхлая эмбриогенная каллусная культура кукурузы AB12, описанная в примере 3. Плазмиды pGHN1-1 и pLUC-1 были сконструированы на основе вектора pBS+ (Stratagene, Inc., San Diego, CA), являющегося кольцевой плазмидой размером 3,2 kb, c использованием стандартных методов работы с рекомбинантными ДНК. Плазмида pCHN1-1 содержит кодирующую последовательность гигромицин В-фосфотрансферазы (НРТ) E.coli [22], фланкированную с 3"-конца сигналом полиаденилирования гена нопалинсинтетазы (nos) Agrobacterium tumifaclens (Chilton and Barnes, 1983). Экспрессия регулируется 35S-промотором вируса табачной мозаики (ВТМ) [23], расположенным выше кодирующей последовательности НРТ. В данном примере были также использованы плазмиды pBII221 и pHYGI1. Плазмида pLUC-1 содержит кодирующую последовательность люциферазы огневки (DeWet et al.,1987), фланкированную с 5"-конца 35S-промотором ВТМ, а с 3"-конца - сигналом полиаденилирования nos. Данная плазмида использовалась исключительно в качестве негативной контрольной ДНК. Плазмиды вводились в культуру AB12 методом обстрела микрочастицами. Было приготовлено 26 чашек описанными в примере 1 методами. Одна пробирка содержала только плазмиду pBII221, две пробирки содержали и pHYGI1, и pBII221, две пробирки содержали и pGHNI-1, и pBII221, и одна пробирка содержала только pLUC-1. Информация о проведенных обстрелах приведена в табл. 7. Две чашки с каллусом, обстрелянным pBII221, были проанализированы на промежуточную экспрессию GUS. Было подсчитано число синих клеток, оказавшееся равным 291 и 477 клеткам с промежуточной экспрессией GUS; это показывало, что процесс введения ДНК произошел и на других обстрелянных чашках. Сразу после обстрела всех образцов каллус во всех чашках, обработанных pHYGI1/pBII221, pCHNI-1/pBII221, и с трех чашек, обработанных pLUC-1, был перенесен на чашки первого цикла отбора со средой F, содержащей 15 мг/л гигромицина В (с каждой чашки 5 кусочков каллуса переносилось на отдельную чашку). Каллус с четвертой чашки, обработанной pLUC-1, был перенесен на среду F без гигромицина. Эта ткань поддерживалась на неселективной среде, пересевалась каждые 2 - 3 недели и в дальнейшем обозначается как неселектируемый контрольный каллус. Через 2 нед отбора ткань выглядела практически одинаково на селективной и неселективной среде. Все каллусы, обработанные pHYGI1/pBII221 и pCHN1-1/pBII221 (по 8 чашек), и два контрольных каллуса (с селективной среды) были перенесены с чашек первого цикла отбора на чашки второго цикла отбора со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина. На каждую чашку второго цикла отбора было помещено 10 кусочков каллуса по 30 мг, в результате чего общее число чашек увеличилось. Оставшаяся ткань, поддерживаемая на селективной среде (по две чашки с обработок pHYGI1/pBII221 и pGHN1-1/pBII221 и одна чашка с контрольным каллусом) была перенесена в буфер для анализа GUS при 37oC для определения того, видны ли синие кластеры клеток через две недели после обстрела. Через 6 дн пребывания ткани в буфере для анализа она была проанализирована на предмет экспрессии GUS. Результаты анализа приведены в табл. 8. Через 21 дн на чашках второго цикла отбора все живые участки материала были перенесены на чашки третьего цикла отбора со средой, содержавшей 60 мг/л гигромицина. Чашки второго цикла, содержавшие только мертвую на вид ткань, были сохранены. Чашки второго и третьего циклов отбора периодически просматривались для обнаружения живых пролиферирующих участков. Через 35 дн на чашках третьего цикла отбора все чашки обоих циклов были проверены на наличие живых участков каллуса. Два таких участка, пролиферирующих на фоне мертвой ткани, были обнаружены на чашках, обработанных pHYGI1/pBII221. Первый участок, названный 3AA, был обнаружен на чашке третьего цикла, а второй, названный РН1, на чашке второго цикла. Обе линии были перенесены на среду F без гигромицина. Через 19 дн на среде F без гигромицина линия 3AA подросла очень мало, тогда как линия РН1 росла быстро. Обе линии были вновь перенесены на среду F без гигромицина на 9 дн. Затем линии 3AA и РН1 были перенесены на среду F, содержавшую 15 мг/л гигромицина, на 14 дн. При этом оказалось, что линия 3AA росла медленно и имела очень низкое качество. Однако линия РН1 быстро росла на среде F с 15 мг/л гигромицина; эта линия пассировалась затем на среде F без гигромицина. Через 10 дн на среде F было начато изучение ингибирования линии РН1. Каллус РН1 был перенесен на среду F, содержавшую 1, 10, 30, 100 и 250 мг/л гигромицина В. Для каждой концентрации было приготовлено 5 чашек, и каждая чашка содержала по 10 кусочков каллуса приблизительно по 50 мг. Для каждой концентрации гигромицина была приготовлена одна чашка неселектируемой контрольной ткани. Выяснилось, что линия РН1 способна к устойчивому росту при концентрации гигромицина 0, 10, 30, 100 и 250 мг/л после 9 пассажей. С чашек второго и третьего циклов отбора в разное время были также восстановлены дополнительные участки ткани. Ни один из них не был способен расти в присутствии гигромицина при многократном (двух- и трехкратном) пассировании. Для доказательства того, что каллус РН1 приобрел ген устойчивости к гигромицину, этот каллус был проанализирован методом Саузерн-блоттинга, для чего была выделена ДНК из РН1 и неселектируемого контрольного каллуса. Для выделения ДНК 2 г каллуса замораживались в жидком азоте и растирались в тонкий порошок, который затем переносился в пробирку объемом 30 мл (Oak Ridge), содержащую 6 мл буфера для экстракции (7 M мочевина, 250 мМ NaCl, 50мМ Трис-HCl (pH 8,0), 20 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 1% саркозина). К этому добавлялись 7 мл смеси фенол/хлороформ (1:1), пробирки встряхивались и инкубировались при 37oC в течение 15 мин. Образцы центрифуговались при 8 К в течение 10 мин при 4oC. Супернатант переносился пипеткой через фильтр Calbiochem 475855 в пробирку объемом 15 мл (American Scientific Products, C3920-15A), содержащую 1 мл 4,4 M ацетата аммония (pH 5,2). Затем добавлялось 6 мл изопропанола, пробирка встряхивалась и выдерживалась в течение 15 мин при -20oC. ДНК осаждалась в центрифуге Beckman TJ-6 при максимальной скорости в течение 5 мин при 4oC. Супернатант сливался, и осадок растворялся в 500 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 10 мМ ЭДТА) в течение 15 мин при комнатной температуре. Образцы переносились в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, и к ним добавлялись 100 мкл 4,4 M ацетата аммония (pH 5,2) и 700 мкл изопропанола. Смесь инкубировалась в течение 15 мин при -20oC, после чего ДНК осаждалась в течение 5 мин при 1200 об/мин в центрифуге Eppendorf. Осадок промывался 70%-ным этанолом, высушивался и ресуспендировался в ТЕ-1 (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА). 10 мкг изолированной ДНК расщеплялось рестриктазой BamHI (NEB) и анализировалось описанным в примере 1 способом с использованием зонда НРТ. Как видно на фиг. 3, в ДНК каллуса РН1 была отмечена полоса в ожидаемой области 1,05 kb, что показывало наличие кодирующей последовательности НРТ. В ДНК контрольного каллуса полос отмечено не было. Для доказательства того, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой, ДНК, изолированная из каллуса РН1 и из контрольного каллуса, была обработана (1) без рестриктаз, (2) рестриктазой BamHI описанным выше способом и (3) рестриктазой Pst1, которая расщепляет плазмиду pHYGI1 только по одному сайту в пределах кодирующей последовательности НРТ. Образцы были перенесены на блот и проанализированы при помощи зонда, представляющего собой кодирующую последовательность НРТ, описанным выше способом. Нерасщепленная ДНК каллуса РН1 гибридизовалась с зондом только в области, соответствующей нерасщепленной ДНК; это показывало, что ген устойчивости к гигромицину встроен в ДНК с большой молекулярной массой. При расщеплении ДНК РН1 рестриктазой BamHI была отмечена полоса в ожидаемой области 1,05 kb, как было показано выше. При расщеплении ДНК РН1 рестриктазой Pst1 в случае, если ген устойчивости к гигромицину присутствовал бы в составе интактной плазмиды pHYGI1, ожидалась бы полоса в области 5,9 kb. Если ген встроен в ДНК с большой молекулярной массой, то следует ожидать появления двух или более полос различного размера (размер зависит от положения сайтов расщепления Pst1 в последовательностях, фланкирующих ген в ДНК хозяина). Было отмечено три полосы с приблизительными размерами 12, 5,1 и 4,9 kb. Этот результат свидетельствует о встраивании гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. Интенсивность полосы в области 4,9 kb примерно вдвое больше интенсивности других полос; это наводит на мысль, что или расщепление ДНК было неполным, или ген НРТ тандемно повторен. Ни в одной из описанных выше обработок не было отмечено гибридизации с зондом ДНК контрольного каллуса. Эти результаты показывают, что кодирующая последовательность НРТ присутствует в каллусе РН1 не в виде интактной плазмиды pHYGI1 и не в виде небольшой внехромосомной плазмиды. Они подтверждают встраивание гена устойчивости к гигромицину в ДНК с большой молекулярной массой. Кроме того, Саузерн-блоттинг показал, что кодирующая последовательность НРТ входит в состав одного непрерывного района с 35S-промотором. Из всех чашек с разными концентрациями гигромицина, использованных при изучении ингибирования каллуса, каллус РН1 был перенесен на среду RM5, и растения были регенерированы так, как описано в примере 1. Всего было получено 65 растений из каллуса РН1 и 30 растений из контрольного каллуса. Для доказательства того, что введенная ДНК сохранилась в тканях растений R0, был проведен Саузерн-блоттинг расщепленной рестриктазой BamHI ДНК листьев трех случайно выбранных растений поколения R0, полученных из каллуса РН1. Методы проведения Саузерн-блоттинга описаны выше. Блот гибридизовался с зондом НРТ, как описано в примере 1. Как видно на фиг. 4, в ДНК всех трех растений была отмечена полоса в области 1,05 kb, что свидетельствовало о присутствии кодирующей последовательности НРТ. В ДНК контрольных растений полос отмечено не было. Были проведены контролируемые опыления растений РН1 при помощи стандартных методов с участием инбредных линий Zea mays A188, В73 и Oh43. Семена были собраны через 45 дн после опыления и подсушены в течение 2-3 нед. Наличие устойчивости к гигромицину у потомства поколения R1 оценивалось при помощи анализа удлинения корня, анализа этиолированных листьев и Саузерн-блоттинга. С каждого растения, регенерированного из каллуса РН1 или контрольного каллуса, было отобрано для анализа по два початка. Для всех початков донором пыльцы была инбредная линия A188. Результаты приведены в табл. 9 и на фиг. 5. Присутствие гена НРТ было подтверждено в двух растениях поколения R2, происходящих от материнского растения РН1. Растение РН1.3.1 (табл. 9) было опылено пыльцой Oh43. Девять семян, полученных от этого скрещивания, были пророщены, и из листьев четырех дочерних растений была выделена ДНК, которая затем была проанализирована методом Саузерн-блоттинга с использованием зонда, представляющего собой кодирующую последовательность НРТ. Два из четырех проанализированных растений содержали большое число копий последовательности НРТ. Хотя в двух растениях присутствовал ген НРТ, экспрессия этого гена не была отмечена при анализе этиолированных листьев. Растение РН1.10.8 (табл. 9) было использовано для опыления растений линии В73 и, кроме того, самоопылено. Пятьдесят дочерних растений, полученных в скрещивании, было проверено на экспрессию НРТ при помощи анализа как корней, так и листьев. Экспрессия не была отмечена. Кроме того, Саузерн-блоттинг ДНК восьми дочерних растений не показал присутствия гена НРТ. В потомстве от самооплодотворения при анализе листьев девяти растений не было получено данных, которые свидетельствовали бы о присутствии гена НРТ; Саузерн-блоттинг ДНК четырех из этих растений также не дал таких данных. Наследование рекомбинантной ДНК потомством было отмечено только тогда, когда трансгенное растение (R0 или R1) использовалось в качестве женского родителя. Это свидетельствует о материнском наследовании рекомбинантной ДНК у РН1. Все цитированные выше публикации и патентные документы включены в данное описание в качестве ссылок. Изобретение было описано в связи с различными конкретными и предпочтительными вариантами его осуществления; однако необходимо иметь в виду, что возможны и другие его модификации и варианты, соответствующие его сущности и находящиеся в пределах его объема. -
Литература. 1. Adang M.J. et al. Gene, 36, 1985, 289
2. Altenbach et al. Plant Mol. Biol., 8, 1987, 239
3. Armstrong C.L, et al. Planta, 164, 1985, 207 - 214
4. Benner M.S. et al. Theor. Appl. Genet., 78, 1989, 761
5. Bevan M. et al. Nuc. Acids. Res., 11, 1983, 36a
6. Bradford. Anal. Biochem., 72, 1976, 248
7. Cabanes-Bastos E. Gene, 77, 1989, 169
8. Callis J. et al. Genes & Develop., 1, 1987, 1183 - 1200
9. Chu, C.C. et al. Sci.Sin. (Peking), 18, 1975, 659 - 668
10. Cocking А. et al. Science, 236, 1987, 1259 - 1262
11. Cristou P. et al. Plant Physiol., 87, 1988, 671
12. Datta S.K. et al. Bio/Technology, 8, 1990, 736
13. DeWet et al.Proc. Natl. Sci. USA, 82, 1985, 7870 - 7873
14. DeWet J. et al. Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. Chapman et al., eds., Longman, Inc., New York, 1985, 197 - 269
15. Freeling J.C. et al. Maydica XXI, 1976, 97 - 112
16. Fromm M.E. et al. Nature, 319, 1986, 791
17. Geiser M. et al. Gene, 48, 1986, 109
18. Geraghty D.E. Ph.D. Thesis, University of Minnesota, 1987
19. Graves A. et al. Plant Mol. Biol., 3, 1986, 43 - 50
20. Green C. et al. Crop Sci. 15, 1975, 417 - 421
21. Green C. et al. Maize for Biological Research, Plant Molec. Biol. Assoc., 1982, 367 - 372
22. Gritz L. et al. Gene, 25, 1983, 179 - 188
23. Guilley H. et al. Gell, 30, 1982, 763 - 773
24. Hallauer A.R. et al. Corn and Corn Improvement, 3rd. ed., Agronomy Society of America, 1988, 469 - 564
25. Hofte H. et al. Microbiol. Rev., 53, 1989, 242
26. Jefferson R. et al. EMBO J., 6, 1987, 3901 - 3907
27. Kirihara et al. Gene, 7, 1988, 359
28. Kamo K. et al. Bot. Gaz., 146, 1985, 327 - 334
29. Klein T. et al. Plant Physiol., 91, 1989, 440 - 444
30. Klein T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1988, 4305 - 4309
31. Klein T. et al. Bio/Technology, 6, 1988, 559 - 563
32. Lu C. et al. Theor. Appl, Genet., 62, 1982, 109 -112
33. McCabe D, et al. Bio/Technology, 6, 1988, 923 - 926
34. Murashige T. et al. Physiol. Plant, 15, 1962, 473 - 497
35. Murray et al. Nucl. Acids Res., 17, 1987, 477
36. Neuffer M. Maize for Biological Research, Plant. Mol. Biol. Assoc., 1982, 19-30
37. Ohta Y. PNAS USA, 83, 1986, 715
38. Pedersen et al. J. Biol. Chem., 261, 1986, 6279
39. Phillips R. et al. Corn and. Corn Improvement, 3rd ed., Agronomy Society of America, 1988, 345 - 387
40. Potrykus l. Trends in Biotechnology, 7, 1989, 269 - 273
41. Prioli L.M. et al. Bio/Technology, 7, 1989, 589
42. Rhodes C.A. et al. Bio/Technology, 6, 1988, 56
43. Rhodes C.A. et al. Science, 240, 1988, 204 - 207
44. Sambrook J. et al. Molecular Cloning. A Laboranory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
45. Sanford J. et al. Part. Sci. & Techn., 5, 1987, 27 - 37
46. Shillito R.D. et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581
47. Staebell M. et al. Anal. Biochem., 185, 1990, 319
48. Vasil l.. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.I, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, 152 - 158
49. Vietra J. et al. Methods Enzymol., 153, 1987, 3
50. Weising K. et al., Ann.Rev. of Genetics, 22, 1988, 421 - 478
51. Whitely H.R. et al. Ann. Rev. Microbiol., 40, 1986, 549
52. Yanisch-Perron L. et al. Gene, 33, 1985, 109 - 119
53. Опубликованная заявка на европейский патент N 270356 (McCabe et al.)
54. Опубликованная заявка на европейский патент N 275069 (Arntzen et al. )
55. Опубликованная заявка на европейский патент N 331855 (Sanford J. C. et al.), основанная на заявке N 07/161807 от 29.03.88 на патент США. 56. Патент США N 4683202 (K.B. Mullis).
Класс C12N15/82 для клеток растений
Класс C12N15/87 введение чужеродного генетического материала с использованием процессов, не предусмотренных в других рубриках, например совместной трансформации