способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов

Формула изобретения

Способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральных добавок, отличающийся тем, что осуществляют глубинное культивирование нефтеокисляющих бактерий на жидкой питательной среде, затем емкости герметично закрывают, после чего осуществляют дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов путем глубинного культивирования бактериального штамма Pseudomonas putida 36 на жидкой питательной среде. Штамм получен путем селекции (Пальгунов П.П., Сумароков Н.В. Утилизация промышленных отходов. -М. : Стройиздат, 1990; "О биологической рекультивации нефтезагрязненных лесных почв Среднего Приобья", Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е. и др. Почвоведение, 1990, N 9, с. 148 - 151).

Данный способ позволяет поручить биопрепарат пригодный, главным образом, для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами воды. Эффективность полученного биопрепарата для очистки почвы весьма низкая (25 - 30%).

Известен также способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральных добавок (патент РФ N 2053205, кл. B 09 C 1/10, 1996).

Данный способ не позволяет обеспечить высокий титр клеток в конечном продукте, который не превышает 710⁹ кл./мл.

Задачей изобретения является создание такого способа получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды, который позволил бы значительно обеспечить получение более высокого титра клеток в конечном продукте, который составляет (1,2 - 2,5)10¹² кл./мл.

Это достигается за счет того, что в способе получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающем культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральных добавок, согласно изобретению осуществляют глубинное культивирование нефтеокисляющих бактерий на жидкой питательной среде, затем емкости герметично закрывают, после чего осуществляют дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе.

Заявителю неизвестны какие-либо источники информации, в которых содержались бы сведения о техническом решении, адекватном заявленным отличиям. Реализация отличительных признаков настоящего изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) обусловливает появление у объекта нового технического эффекта, который состоит в резком увеличении количества жизнеспособных клеток (в 100 - 1000 раз в сравнении со способом, содержащим только одну стадию культивирования, а именно глубинное культивирование). Это объясняется тем, что нефтеокисляющие бактерии (при дополнительном поверхностном культивировании) распределяются по поверхности пористого наполнителя, при этом улучшаются условия аэрации, увеличивается площадь питания клеток. Кроме того, важно отметить, что дополнительное культивирование микроорганизмов на твердой поверхности предотвращает взаимное ингибирование клеток продуктами их метаболизма.

Благодаря указанным новым свойствам объекта происходит значительное увеличение биологической активности препарата в отношении углеводородов.

Приведенные выше обстоятельства обусловливают соответствие предложенного технического решения критерию "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. В качестве нефтеокисляющих бактерий используют консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Preudomonas putida ПИ Ко-1 и Pseudomonas fluorescens ПИ-896. Указанные штаммы зарегистрированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского института защиты растений КМЗР ВИЗР-760. Различать штаммы можно следующим образом: штамм Pseudomonas putida ПИ Ко-1 - мелкие короткие палочки, размеры: (0,2 - 0,3) (0,5 - 0,8) мкм, колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слабовыпуклые, полупрозрачные, бесцветные, диаметром 3 - 5 мм, штамм Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - мелкие короткие палочки, размеры: (0,1 - 0,4) (0,6-0,7) мкм, колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слегка приподнятые в центре, желтоватые, полупрозрачные, диаметром 4 - 6 мм.

Глубинное культивирование указанных выше бактерий осуществляют на жидкой искусственной питательной среде следующего состава, г:

KH₂PO₄ - 2

Na₂HPO₄ - 3

NH₄Cl - 2

MgSO₄7H₂O - 0,5

FeCl₃6H₂O - 0,05

CaCl₂2H₂O - 0,01

Соевая мука - 5

Меласса - 20

Мазут - 1

Вода, л - До 1

Жидкая питательная среда имеет pH 7,0.

Осуществляют совместное глубинное культивирование обоих штаммов-деструкторов нефти в течение 48 ч при температуре 28^oC, в пятилитровых бутылях.

Затем подготавливают стерильные полиэтиленовые пакеты, которые наполняют стерильным торфом, в конкретном примере 600 г. После этого в стерильный торф вводят выращенные путем глубинного культивирования на жидкой питательной среде нефтеокисляющие бактерии вместе с 1% раствором минеральной добавки (NH₄)₂HPO₄. Общий объем посевного материала - 150 мл на 600 г торфа. Затем полиэтиленовые пакеты герметично зарывают и осуществляют дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе при температуре 30^oC в течение 7 сут. Благодаря тому что полиэтиленовые пакеты герметично закрыты, в них поддерживается практически постоянная влажность.

Титр полученного биопрепарата в результате реализации предлагаемого способа составил в конкретном примере 2,510¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Пример 2. В качестве нефтеокисляющих бактерий используют консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Pseudomonas putida ПИ Ко-1 Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ Ку-1. Последний штамм также зарегистрирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского института защиты растений КМЗР ВИЗР-760. Его можно различать по следующим признакам: штамм Micrococcus species ПИ Ку-1-кокки, диаметром 0,6 - 1,0 мкм, колонии штамма круглые с ровным краем, теплого цвета, непрозрачные, гладкие, блестящие, диаметром 2 - 5 мм.

Глубинное культивирование бактерий осуществляют на жидкой питательной среде следующего состава, г:

KH₂PO₄ - 2

Na₂HPO₄ - 3

NH₄Cl - 2

MgSO₄7H₂O - 0,5

FeCl₃6H₂O - 0,05

CaCl₂2H₂O - 0,01

Кукурузная мука - 5

Меласса - 20

Мазут - 1

Вода, л - До 1

Жидкая питательная среда имеет pH 6,8.

Совместное глубинное культивирование осуществляют в течение 24 ч в ферментере объемом 100 л при температуре 30^oC.

Поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий в стерильных полиэтиленовых пакетах на стерильном торфе совместно с 1% раствором минеральной добавки (NH₄)₂HPO₄ осуществляют таким же образом, как и в первом примере. При этом выращивание микроорганизмов проводят в течение 5 сут при температуре 28^oC.

Титр полученного биопрепарата составляет во втором примере реализации способа 1,210¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Таким образом, предлагаемый способ благодаря новым операциям, а именно дополнительному поверхностному культивированию нефтеокисляющих микроорганизмов на стерильном наполнителе с большой поверхностью - торфе в герметично закрытых пакетах, позволяет в 100 - 1000 раз повысить титр жизнеспособных клеток в биопрепарате в сравнении с известными технологическими решениями. Соответственно, резко возрастает биологическая активность препарата. Препарат хорошо сохраняется в течение года. Достоинством предлагаемой технологии является и то, что проведение второй стадии культивирования в закрытых емкостях - полиэтиленовых пакетах исключает необходимость дополнительной расфасовки готового препарата, что удешевляет технологию получения препарата в целом.

Для производства одинакового количества предлагаемого препарата и прототипа в первом случае требуется производить в 12 раз меньше культуральной жидкости на 1 кг препарата, что в 10 раз сокращает затраты на глубинное культивирование и соответственно в 10 раз снижает его себестоимость по сравнению с прототипом.

Для промышленной реализации предлагаемого способа используется обычное оборудование и материалы, использующиеся на заводах-производителях биопрепаратов для сельского хозяйства.