способ ингибирования вирусных инфекций гепатита в

Формула изобретения

1. Способ ингибирования вирусных инфекций гепатита В, включающий введение активного соединения, отличающийся тем, что вводят 1-(2-(гидроксиметил)-1,3-оксатиолан-5-ил)-5-фторцитозин формулы I



в виде единичной дозы, содержащей 10 - 1500 мг соединения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что соединение формулы I используют в форме цис-изомера.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к использованию производного 1-/2/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-цитозина и его физиологически функциональных производных для лечения вирусных инфекций гепатита B.

Вирус гепатита B /ВГВ/ является вирусным патогеном, играющим в мире важную роль. ВГВ наиболее распространен в странах Азии и преобладает в африканских странах юга Сахары. Этот вирус этиологически связан с первичной печеночно-клеточной карциномой и, как представляется, служит причиной 80% случаев заболевания раком печени в мире. В Соединенных Штатах Америки более десяти тысяч человек каждый год госпитализируется по причине ВГВ-заболевания, причем констатируется в среднем 250 смертельных исходов в результате скоротечности заболевания. В Соединенных Штатах в настоящий момент имеется примерно 500000 - 1 миллион инфицированных носителей. Хронический активный гепатит развивается у более, чем 25% носителей и часто переходит в цирроз. Приблизительно 5000 больных погибает от цирроза, связанного с ВГВ, каждый год в США и , вероятно, 1000 больных погибает от рака печени, связанного с ВГВ. Даже в тех случаях, когда имеется универсальная ВГВ-вакцина, продолжает ощущаться необходимость в эффективных анти-ВГВ-соединениях. Большие количества устойчиво инфицированных носителей, примерно 220 миллионов во всем мире, не могут извлечь пользы от вакцинации и поэтому будут непрерывно подвергаться высокому риску заболевания печени, вызванного ВГВ. Эти группы носителей могут также быть источником инфекции для восприимчивого организма, который всегда сохраняется, в частности, в эндемических областях или среди групп высокого риска, например, при неправильном введении лекарственных препаратов и среди гомосексуалов. Таким образом, ощущается острая необходимость в эффективных противовирусных агентах как для контроля за хроническими инфекциями, так и для снижения развития печеночно-клеточной карциномы.

Клинические эффекты ВГВ-инфекции включают головную боль, жар, недомогание, тошноту, рвоту, анорексию и боли брюшной области. Репликация этого вируса в общем случае контролируется иммунной реакцией с периодом восстановления от нескольких недель до нескольких месяцев у человека, но инфекция может быть более сильной, что приводит к устойчивому хроническому заболеванию печени, о котором речь шла выше. В книге "Viral Infection of Humas " /второе издание, изд. Plenum Publishing Corporation/1982/, New York, ред. Evans, A.S./, глава 12, описана этиология инфекций вирусного гепатита. В европейском Патентном Описании 0382526 предложены некоторые аналоги 1,3-оксатиолан нуклеозида, которые эффективны при ингибировании репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Заявитель неожиданным образом установил, что производное 1-/2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-цитозина формулы I:



а именно, 1-/2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-5-фторцитозин и его физиологически функциональное производное обладают сильной активностью против ВГВ.

Необходимо заметить, что соединение формулы I содержит два хиральных центра и поэтому оно существует в форме двух пар оптических изомеров /т.е. энантиомеров/ и их смесей, включая рацемические смеси. Таким образом, соединение формулы I может быть либо цис, либо транс-изомером, либо их смесями. Каждый цис- и транс-изомер может существовать в виде одного из двух энантиомеров или их смесей, включая рацемические смеси. Все такие изомеры и их смеси, включая рацемические смеси, и таутомерные формы соединения формулы I находятся в области, охватываемой настоящим изобретением. Цис-изомеры соединения формулы I предпочтительны.

В соответствии с одним из отличительных свойств настоящего изобретения предлагается соединение формулы I или его физиологически функциональное производное для использования при лечении или профилактике инфекции вируса гепатита B. В соответствии с еще одним отличительным свойством настоящего изобретения предлагается способ использования соединения формулы I или его физиологически функционального производного при изготовлении медицинского препарата для лечения или профилактики инфекции вируса гепатита B.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения или профилактики инфекции вируса гепатита B у хозяина, например млекопитающего такого, как человек, который содержит обработку хозяина терапевтически эффективным количеством соединения формулы I или его физиологически функционального производного.

Под термином "физиологически функциональное производное" подразумевается приемлемая с фармацевтической точки зрения соль, амид, сложный эфир или соль сложного эфира соединения формулы I или любое другое соединение, которое после применения к пациенту способно дать /непосредственно или косвенно/ вышеупомянутое соединение формулы I, или его активный метаболит или остаток.

Предпочтительные сложные эфиры в соответствии с настоящим изобретением включают сложные эфиры карбоновых кислот, в которых некарбонильную составляющую карбоновокислотной части сложного эфира выбирают из алкила с линейной или разветвленной целью, например н-пропила, третичн.-бутила, н-бутила, алкоксиалкила /например, метоксиметила/, арилалкила /например, бензила/, арилоксиалкила /например, феноксиметила/ и арила /например, фенила/; сложные эфиры сульфонатов, такие как алкил- или арилалкилсульфонил /например, метансульфонил/; сложные эфиры аминокислот /например, L-валил или L-изолейцил/; сложные эфиры дикарбоновых кислот /например, полусукцинат/ и 5"-моно-, ди- или три-фосфатные сложные эфиры. Фосфатные сложные эфиры могут быть затем этерифицированы, например, C_1-20 спиртом или его химически активным производным, 2,3-ди/C_6-24/ ацилглицерином. Любая алкильная составляющая, содержащаяся в таких сложных эфирах, в предпочтительном варианте содержит от 1 до 18 атомов углерода, в частности от 1 до 4 атомов углерода. Любая арильная составляющая, содержащаяся в таких сложных эфирах, в предпочтительном варианте содержит фенильную группу, необязательно замещенную, например, галогеном, C_1-4 алкилом, C_1-4 алкокси или нитро.

Вышеупомянутые, приемлемые с фармацевтической точки зрения, амиды соединения формулы I включают такие производные, в которых группа амино цитозина находится в форме амида, например -NHCOR, в которой R является C_1-6 алкилом или арилом /например, фенилом, необязательно замещенным галогеном, C_1-4 алкилом, C_1-4 алкокси, нитро или гидроксилом/.

Примеры приемлемых с фармацевтической точки зрения солей в соответствии с настоящим изобретением включают основные соли, например, полученные из соответствующего основания, такого как щелочной металл /например, натрий/, соли щелочноземельных металлов /например, магния/, аммония и NX⁺₄ /в которой X является C_1-4 алкилом/. Приемлемые с фармацевтической точки зрения соли присоединения кислот включают соли органических карбоновых кислот таких, как уксусная, молочная, винная, малеиновая, изетионовая, лактобионовая и янтарная кислоты; органических моносульфокислот таких, как метан/моно/сульфокислота, этан/моно/сульфокислота, бензол-/моно/сульфокислота и пара-толуол/моно/сульфокислота, и неорганических кислот таких, как хлористоводородная, серная, фосфорная и сульфаминовая кислоты.

Количество соединения формулы I, в дальнейшем именуемого также как "активный ингредиент"/ или его физиологически функционального производного, которое необходимо для изготовления медицинского препарата, чтобы гарантировать целевой эффект, будет зависеть от нескольких факторов, в частности от специфических условий применения, природы конкретного используемого соединения, способа применения и состояния пациента. В общем случае, соответствующая доза будет изменяться в области от 3,0 до 120 мг на килограмм массы тела пациента в день, в предпочтительном варианте в области от 6 до 90 мг на килограмм массы тела в день, а в наиболее предпочтительном варианте в области от 15 до 60 мг на килограмм массы тела в день. Необходимая доза в предпочтительном варианте может быть представлена в виде двух, трех, четырех, пяти, шести и более поддоз, которые применяют в соответствующие моменты времени в течение дня. Эти поддозы могут быть применены в форме единичных доз, например, содержащих от 10 до 1500 мг, в предпочтительном варианте от 20 до 1000 мг, а в самом предпочтительном варианте от 50 до 700 мг активного ингредиента на форму единичной дозы.

В идеальном случае активный ингредиент необходимо применять таким образом, чтобы добиться пиковой концентрации в плазме активного ингредиента в области от примерно 1 до примерно 75 М, в предпочтительном варианте от примерно 2 до 50 М, в самом предпочтительном варианте от примерно 3 до примерно 30 М. Этого можно добиться, например, при помощи внутривенной инъекции 0,1 - 5% раствора активного ингредиента, необязательно в соляном растворе, или орального применения в виде шариков, содержащих от примерно 1 до примерно 100 мг/кг активного ингредиента. Необходимые концентрации в крови могут поддерживаться при помощи непрерывного вливания, чтобы обеспечить введение от примерно 0,01 до примерно 5,0 мг/кг/ч или при помощи периодических вливаний, содержащих от примерно 0,4 до примерно 15 мг/кг активного ингредиента.

При получении медицинского препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, в дальнейшем именуемого как "композиция", соединение формулы I или его физиологически функциональное производное, именуемое в дальнейшем как "активный ингредиент", в общем случае смешивают (наряду с другими) с одним или несколькими, приемлемыми с фармацевтической точки зрения, носителями или наполнителями и необязательно другими терапевтическими агентами.

Эти формы включают те формы, которые пригодны для стоматического, прямокишечного, носового, местного /включая, трансдермальный, трансбуккальной и подъязычный/, влагалищного или парентерального /включая, подкожный, внутримышечный, внутривенный и внутрикожный/ применения. Эти композиции могут быть в общем случае сформированы в форму единичной дозы и могут быть изготовлены с использованием любой процедуры, которые известны в области фармацевтической промышленности. Такие процедуры включают стадию соединения вместе активного ингредиента с носителем, который состоит из одного или нескольких дополнительных ингредиентов. В общем случае, эти композиции получают при помощи однородного и тщательного соединения активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, или тем и другим, а затем, если это необходимо, продукту придают необходимую форму.

Композиции настоящего изобретения, предназначенные для стоматического применения, могут иметь форму дискретных доз таких, как капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента; порошка или гранул; раствора или суспензий в водной или неводной жидкости; или жидкой эмульсии масло в воде или жидкой эмульсии вода в масле. Активный ингредиент может также иметь форму шариков, лекарственной кашки или пасты.

Таблетка может быть получена при помощи прессовки или формования, необязательно с одним или несколькими дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены при помощи прессовки в специальном средстве активного ингредиента в свободно-текущей форме такой, как порошок или гранулы, необязательно в смеси со связывающим агентом /например, повидоном, желатином, оксипропилметил целлюлозой/, смазочным агентом, инертным разбавителем, консервирующим агентом, разрыхляющим агентом /например, натрий гликоллатом крахмала, сшитым повидоном, сшитой натрий карбоксиметил целлюлозой/, поверхностно-активным агентом или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены при помощи формования в соответствующем средстве смеси порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Эти таблетки могут быть покрыты или снабжены рифлением, или из них могут быть получены формы, которые позволяют обеспечить медленное или регулируемое высвобождение активного ингредиента, в которых, используя, например, оксипропилметил целлюлозу в различных пропорциях, можно обеспечить целевой профиль высвобождения. Эти таблетки могут быть также снабжены дополнительным покрытием, чтобы гарантировать высвобождение в кишечнике, а не в желудке.

Композиции, предназначенные для стоматического использования, которые были описаны выше, могут также включать буферирующие агенты, предназначенные для нейтрализации кислотности желудка. Такой буфер может быть выбран из самых различных органических или неорганических агентов таких, как слабые кислоты или основания, смешанные с сопряженными с ними солями.

Композиции, предназначенные для местного применения во рту, включают лепешки, содержащие активный ингредиент во вкусной основе, в общем случае в сахарозе и акации или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе такой, как желатин и глицерин или сахароза и акация; и жидкости для полоскания, содержащие активный ингредиент в соответствующем жидком носителе.

Композиции для прямокишечного применения могут быть изготовлены в виде суппозиториев на соответствующей основе, содержащей, например, кокосовое масло или салицилат.

Композиции, предназначенные для влагалищного применения, могут иметь форму пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пены или распыляемых композиций, содержащих, кроме того, /наряду с активным ингредиентом/ такие носители, которые известны каждому специалисту в этой области техники.

Композиции, предназначенные для парентерального применения, включают водные и неводные изотонные стиральные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые придают композиции изотонность относительно крови пациента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агента и загущающие агенты, липосомы или другие системы в форме микрочастиц, которые предназначены для того, чтобы доставить соединения к компонентам крови или одному или несколькими органами. Эти композиции могут иметь форму закрытых контейнеров, содержащих одну или несколько доз, например ампулы и пузырьки, и их можно хранить при условиях сушки вымораживанием /лиофилизации/, при которых необходимо только добавить стерильный жидкий носитель, например воду для инъекций, непосредственно перед применением. "Неподготовленные" растворы и суспензии для инъекций могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток того типа, что были описаны выше.

Предпочтительные композиции в форме единичных доз являются такими композициями, которые содержат ежедневную дозу или ежедневную поддозу, как это было описано выше, или соответствующие ее доли активного ингредиента.

Необходимо иметь в виду, что в дополнение к ингредиентам, перечисленным выше, композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут включать другие агенты, известные в этой области техники, в зависимости от типа композиции; например, композиции, предназначенные для стоматического применения, могут включать такие дополнительные агенты, как вкусовые агенты, загущающие агенты и ароматизирующие агенты.

Соединение формулы I может быть получено, например, в результате; a) взаимодействия необязательно защищенного соединения 5-F-цитозина с 1,3-оксатиоланом формулы IIA:



в которой

R₁ является водородом или гидрокси-защищающей группой, а L является удаляемой группой; или

b/ взаимодействия соединения формулы IIB:



/в которой

R₁ уже был определен выше, а R^a₁ является аминозащищающей группой/ с фторирующим агентом, который позволяет ввести атом фтора в 5 позицию кольца цитозина; или

c/ взаимодействия соединения формулы IIC:



/в которой

R₁ уже был определен выше/ с агентом, который служит для превращения оксо-группы в 4-позиции урацильного кольца в амино группу; любые оставшиеся защищающие группы удаляют, например, при помощи кислотного или щелочного гидролиза, чтобы получить целевой продукт.

Что касается процедуры а/, то гидрокси-защищающая группа включает такие защищающие группы, как ацил /например, ацетил/, арилацил /например, бензоил или замещенный бензоил/, тритил или монометокситритил, бензил или замещенный бензил, триалкилсилил /например, диметил-третичн.-бутилсилил/ или дифенилметилсилил. Соединение 5-R-цитозина может быть защищено силилом, например, триметил силиловыми группами. Такие группы могут быть удалены при помощи стандартных приемов. Удаляемая группа L является одной из тех, которые хорошо известны в химии нуклеозидов, например, галоген такой, как хлор или бром, алкокси такой, как метокси или этокси, или ацил такой, как ацетил или бензоил.

Реакция в процессе а/ может быть осуществлена в органическом растворителе /например, 1,2-дихлорэтане или ацетонитрила/ в присутствии кислоты Льюиса такой, как хлорид олова и/или триметилсилил трифлат (triflate).

Соединения формулы IIА могут быть получены из соответствующим образом защищенного 2-гидроксиацетальдегида формулы III

R₁OCH₂CHO (III)

в которой

R₁ был определен выше, как это описано в работе Can.J Research, т.8, с. 129 /1933/ и Европейском Патентном описании N0382526. Реакция соединений формулы III с меркаптоацеталем HSCH₂CH/PR/₂, в которой R является C_1-4 алкокси таким, как HSCH₂CH/OC₂H₅/₂, известная в этой области техники /Chem. Ber., т. 85, с. 924 - 932, 1952/, дает соединения формулы IIA, в которой L является OR /алкокси/, например, метокси или этокси. В качестве альтернативы соединения формулы IIA, в которой L является алкокси, может быть превращено в соединения формулы IIA, в которой L является галогеном или ацилом, при помощи приемов, известных в области химии углеводов.

Соединения формулы III могут быть получены из 1,2-O-изопропилиден глицерина при помощи введения R₁ /например, трехзамещенного силила, бензила или тритила/ и удаления группы изопропилидена с использованием слабой кислоты /например, водного раствора муравьиной или уксусной кислоты/ или бромида цинка в ацетонитриле, далее осуществляют окисления группы спирта водным периодатом.

Что касается процедуры b/, то 5-фтор заместитель может быть введен при помощи приемов, известных в этой области техники /M.J. Robins и др., в книге "Nucleic Acid Chemistry", Part 2, ред. L. B. Townsend и R.S. Tipson, изд. J. Wiley and Sons, New-York, с. 895 - 900 /1978/ и ссылки, приведенные там; R. Duschinsky в книге "Nucleic Acid Chemistry", Part 1, ред. L. B. Townsend и R. S. Tipson, изд. J. Wiley and Sons, New-York. с. 43 - 46 /1978/ и ссылки, приведенные там/. Фторирующим агентом может быть, например, триметилгипофторит в фтортрихлорметане.

Что касается процедуры c/, то соединение формулы IIC в предпочтительном варианте обрабатывают 1,2,4-триазолом, в предпочтительном варианте вместе с 4-хлорфенил дихлорфосфатом, чтобы получить соответствующее 4-/1,2,4-триазолиловое/ соединение, которое затем превращают в гелевое соединение 4-амино/цитидина/ в результате взаимодействия, например, с метанолом.

Исходные материалы формулы IIB и IIC могут быть получены, например, в результате взаимодействия соответствующего /необязательно защищенного/ основания с соединением формулы IIA при помощи той же процедуры, что описана в процедуре a/. 5-Фторурацил и 5-фторцитозин можно получить от фирмы Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA.

Разделение //-цис и //-транс изомеров, например, в защищенной форме может быть осуществлено при помощи хроматографии на силикагеле со смесями органических растворителей такими, как этил ацетат/метанол, этилацетат/гексан или дихлорметан/метанол. Любая защищающая группа может быть затем удалена, используя соответствующий реагент для каждой группы.

Соединение формулы I может быть превращено в приемлемые с фармацевтической точки зрения сложные эфиры и амиды в результате взаимодействия с соответствующим ацилирующим агентом, например галогенидом или ангидридом кислоты, который служит для ацилирования 5"-OH и 4-NH₂ групп. Ацильная группа затем может быть удалена селективно из одной или другой группы 5"-OH и 4-NH₂. Например, в результате обработки диацилированного соединения при кислотных условиях, например, с кислотой Льюиса такой, как бромид цинка в метаноле, удаляют 4N-ациловую группу и получают соответствующий 5"-OH сложный эфир, а в результате обработки диацилированного соединения при щелочных условиях, например, с метилатом натрия удаляют 5"-OH ациловую группу и получают соответствующий 4N-амид. Ацильная группа может быть также удалена селективно в результате обработки производимыми промышленностью ферментами эстеразой или липазой, например эстеразой печени свиньи или липазой поджелудочной железы свиньи, или в результате обработки в соответствии с процедурами, описанными в Патентном описании США 5071983. Соединение формулы I может быть превращено в его приемлемую с фармацевтической точки зрения соль при помощи известных приемов, например в результате обработки соответствующим основанием. Сложный эфир или соль соединения формулы I могут быть превращены в "базовое" соединение, например, при помощи гидролиза.

С целью лучшего понимания настоящего изобретения ниже в качестве иллюстрации приведены примеры.

Пример 1: цис-1-/2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-5- фторцитозин.

Метод A: //-цис и //-транс 2-бензоилоксиметил-5- /N₄-ацетил-цитозин-1-ил/-1,3-оксатиолан получали и разделяли на //-цис и //-транс изомера, как это описано в Европейской Патентном /EP/ описании 0382526. //-Цис изомер подвергали фторированию при помощи трифторметил гипофторита в фтортрихлорметане /СCl₃F/ и хлороформе при температуре -78^oC в соответствии с процедурой из Robins и др. , Nucleic Acid Chemistry, Part 2, с. 895 - 900, 1978. N₄-ацетильные и 2-бензоильные группы удаляли диметиламином в этаноле, а продукт, //-цис-1-/2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-5- фторцитозин, выделяли.

Метод B: //-цис и //-транс-2-бензоилоксиметил-5-/урацил-1-ил/-1,3-оксатиолан получали, как это описано в EP 0382526. После депротекции 2-гидроксильной группы насыщенным метанольным раствором аммиака изомеры разделяли на силикагеле, используя EtOAc/MeOH в качестве элюента /EP 0382526/. //-Цис изомер взаимодействовал с уксусным ангидридом в пиридине при комнатной температуре, чтобы получить 2-ацетат. Растворитель удаляли под вакуумом при температуре <30C. Затем 2-ацетат растворяли в CHCl₃ и промывали водным раствором бикарбоната натрия. Отделившийся органический слой сушили, а CHCl₃ выпаривали под вакуумом. //-Цис-2-ацетилоксиметил-5-/уранил-1-ил/-1,3-оксатиолан подвергали фторированию, как это описано выше /метод A/, с использованием процедуры Робинса и др. Превращение 5-F-урацилового основания в 5-F-цитозиновое основание осуществляли при помощи получения производного 4-/1,2,4-триазол-1-ила/ в соответствии с процедурами из C.B. Reese, J. Chem. Soc., Perkins I, с. 1171, 1984 и W.L. Sung, Nucleic Acid Res., т.9, с. 6139, 1981, используя 1,2,4-триазол и 2 эквивалента 4-хлорфенилдихлорфосфата в сухом пиридине при окружающей температуре. После этого превращения осуществляли реакцию с метанолом, предварительно насыщенным аммиаком, при температуре 0^oC, а 2-ацетат гидролизовали, получая //-цис-1- /2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-5-фторцитозин. Т. пл. 195 - 196^oC.

Фармацевтические композиции

В приводимых ниже примерах композиций "активным ингредиентом" является цис-1-/2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-5-фторцитозин.

Пример 2

Композиция таблеток

¹H ЯМР (DMCO-d₆) 8,2 (1H, д., H₆); 7,8 и 7,6 (2H, широкий, NH₂); 6,1 (1H, д. д. , H_1"); 5,4 (1Н,т.,ОН); 5,2 (1H, т., H₄); 3,7 (2H, м., 2 H_5"); 3,4 (1H, д.д., H₂); и 3,1 (1H, дд., H_2").

Анализ: (C₈H₁₀O₃N₃SF): C 38,97% (38,86); H 4,07% (4,08); N 16,43% (17,00); S 12,89% (12,97).

Композиции A, B (см. табл. 1 и 2) и C получали при помощи влажной грануляции ингредиентов с раствором повидона с последующим добавлением стеарата магния и прессовкой.

Композиция C - мг/таблетка

Активный ингредиент - 100

Лактоза - 200

Крахмал - 50

Повидон - 5

Стеарат магния - 4 - 359

Приводимые ниже композиции D и E получали при помощи прямого прессования смешанных ингредиентов. Лактоза в композиции E предназначена для прямой прессовки /фирма Dairy Crest "Zeparox"/.

Композиция D - мг/таблетка

Активный ингредиент - 250

Предварительно желатинизированный крахмал NF 15 - 150 - 400

Композиция E - мг/таблетка

Активный ингредиент - 250

Лактоза - 150

Авицел - 100 - 500

Композиция F /композиция для регулируемого высвобождения/

Эту композицию получали при помощи влажной грануляции ингредиентов /перечисленных ниже/ с раствором повидона с последующим добавлением стеарата магния и прессовкой. - мг/таблетка

/a/ Активный ингредиент - 500

/b/ Гидроксипропилметилцеллюлоза /Methocel K4M Premium/ - 112

/c/ Лактоза /Фармакопея Великобритании/ - 53

/d/ Повидон /Фармакопея Великобритании/ - 28

/c/ Стеарат магния - 7 - 700

Высвобождение препарата имеет место в течение примерно 6 - 8 ч и завершается спустя 12 ч.

Пример 3

Композиции для капсул

Композиция A

Композицию для капсул получали при помощи смещения ингредиентов из Композиции D в примере 2 выше и заполнения ею жесткой желатиновой капсулы, состоящей из двух частей. Композицию B /см. ниже/ получали аналогичным образом.

Композиция B - мг/капсула

/a/ Активный ингредиент - 250

/b/ Лактоза /Фармакопея Великобритании/ - 143

/c/ Натрий гликоллат крахмала - 25

/d/ Стеарат магния - 2 - 420

Композиция C - мг/капсула

/a/ Активный ингредиент - 250

/b/ Макрогол 4000 /Фармакопея Великобритании/ - 350 - 600

Композиция D - мг/капсула

Активный ингредиент - 250

Лецитин - 100

Арахисовое масло - 100 - 450

Капсулы с композицией D получали при помощи диспергирования активного ингредиента в лецитине и арахисовом масле, и заполнения дисперсией мягких, эластичных желатиновых капсул.

Композиция E /капсула для регулируемого высвобождения/.

Следующую композицию для капсулы с регулируемым высвобождением получали при помощи экструзии ингредиентов a, b и c, используя экструдер, грануляции экстрадированного продукта и сушки. Высушенные гранулы затем покрывали мембраной /d/ для регулируемого освобождения, а затем ими заполняли жесткие желатиновые капсулы, состоящие из двух частей. - мг/капсула

/a/ Активный ингредиент - 250

/b/ Микрокристаллическая целлюлоза - 125

/c/ Лактоза /Фармакопея Великобритании/ - 125

/d/ Этил целлюлоза - 13 - 513

Пример 4

Композиция для инъекций

Композиция А

Активный ингредиент - 0,200 г

Раствор хлористоводородной кислоты, 0,1 М или раствор гидрата окиси натрия, 0,1 М - Сколько нужно, чтобы обеспечить pH от 4,0 до 7,0

Стерильная вода - Сколько нужно до 10 мл

Активный ингредиент растворяли в большей части воды /35-40^oC/ и pH обеспечивали на уровне от 4,0 до 7,0 при помощи хлористоводородной кислоты или гидрата окиси натрия, в зависимости от цели. Затем эту порцию доводили до необходимого объема при помощи воды и фильтровали через стерильный микропористый фильтр в стерильный 10 мл желтый стеклянный пузырек /типа I/ и герметически закрывали в стерильных условиях.

Композиция В

Активный ингредиент - 0,125

Стерильный, свободный от пирогенов, pH 7 фосфатный буфер - Сколько нужно до 25 мл

Пример 5

Внутримышечная инъекция

Активный ингредиент - 0,20 г

Бензиловый спирт - 0,10 г

Гликофурол 75 - 1,45 г

Бензиловый спирт - Сколько нужно до 3,00 мл

Активный ингредиент растворителя в гликофуроле. Затем добавляли бензиловый спирт и получали раствор, затем добавляли воду до 3 мл. Затем смесь фильтровали через стерильный микропористый фильтр и заполняли ею стерильные 3 мл желтые стеклянные пузырьки /типа I/.

Пример 6

Сироп

Активный ингредиент - 0,25 г

Раствор сорбита - 1,50 г

Глицерин - 2,00 г

Бензоат натрия - 0,005 г

Вкусовой агент, Peach 17.42.316 9 - 0,0125 мл

Очищенная вода - Сколько нужно до 5,00 мл

Активный ингредиент растворяли в смеси глицерина и большей части очищенной воды. Водный раствор бензоата натрия затем добавляли в раствор, затем добавляли раствор сорбита и, наконец, вкусовой агент. Объем доводили до необходимого очищенной водой и тщательно перемешивали.

Пример 7

Суппозиторий - мг/суппозиторий

Активный ингредиент - 250

Твердый жир, Фармакопея Великобритании /Witepsol H15 - фирма Dynаmit Nobel/ - 1770 - 2020

Одну пятую жира Witepsol H15 плавили в чашке, снабженной паровой рубашкой, при максимальной температуре 45^oC. Активный ингредиент просеивали через сито 200 M и добавляли в расплавленную основу при перемешивании, используя средство Силверсон /Silverson/, снабженное срезающей головкой до тех пор, пока не будет получена равномерная дисперсия. Поддерживая смесь при температуре 45^oC, в суспензию добавляли оставшийся Witepsol H15 и перемешивали, чтобы получить однородную смесь. Всю суспензию пропускали через сито из нержавеющей стали 250 M и при непрерывном перемешивании смеси давали возможность остыть до 40^oC. При температуре от 38 до 40^oC 2,02 г смеси заполняли соответствующие 2 мл пластиковые формы. Суппозиториям давали возможность остыть до комнатной температуры.

Пример 8.

Пессарии - мг/пессарий

Активный ингредиент - 250

Безводная декстроза - 380

Картофельный крахмал - 363

Стеарат магния - 7 - 1000

Перечисленные выше ингредиенты непосредственно перемешивали, а пессарии получали при помощи прямого прессования полученной в результате смеси.

Пример 9. Противовирусная активность против Вируса Гепатита B /ВГВ/

Соединение цис-1-/2-/гидроксиметил/-1,3-оксатиолан-5-ил/-5-фтор-цитозин испытывали в соответствии с описанием, приведенным ниже.

Линия клеток продуцента человеческого ВГВ HepG₂, 2,2.15, описанная и охарактеризованная в работах Sell и др., PNAS, т. 84, с. 1005, 1987 и J. Virol. , т. 62, с. 2836, 1988, как было установлено, обладает многими характеристиками хронически ВГВ-инфицированного гепатоцита. Он инфекционен, что подтверждали тем фактом, что он вызывал заболевание у шимпанзе. Эту линию клеток использовали in vitro, чтобы идентифировать соединения с анти-ВГВ-активностью.

Для того чтобы испытать соединения на противовирусную активность, монослойные культуры обрабатывали соединением, 500-200 M в течение десяти дней. Верхний слой среды, содержащий внеклеточную ДНК вириона /частицы Дэйна/, собирали на третий, шестой и десятый день, обрабатывали протеиназой К /1 мг/кг/ и додецил сульфатом натрия /1%/ и инкубировали при температуре 50^oC в течение одного часа. ДНК экстрагировали равными объемами фенола, затем хлороформом, а затем осаждали при помощи агента аммония и пропанола. Осадок ДНК растворяли и собирали на нитроцеллюлозе, используя процедуру Schleicher и Schuell /S & S, 10 Optical Ave., Keene, NH 03431, Publication N 700, 1987/ и обрабатывали, как это описано в работе Southern, J.Mol. Biol., т. 98, с. 503, 1975. Клетки собирали, а внутриклеточную ДНК, а внутриклеточную ДНК получали после лизиса клеток с использованием изотиоцианата гуанидина. С внутриклеточной ДНК работали точно так же, как с внеклеточной ДНК. После осаждения ацетатом аммония и пропанолом осадок внутриклеточной ДНК растворяли, расщепляли эндонуклеазой рестрикции Hind III, наносили на агарозовый гель, а затем обрабатывали, как это описано у Саутерна, чтобы определить количество репликационных промежуточных форм. Противовирусное действие соединения определяли при помощи измерения по крайней мере 100-кратного снижения количества частиц Дэйна, попавших в культурную среду, и такого же уменьшения во внутриклеточных репликационных промежуточных материалах.

Полученные результаты приведены в табл. 3.