способ определения микобактериальной бета-лактамазы

Формула изобретения

1. Способ определения микобактериальной бета-лактамазы, включающий контактирование суспензии микобактерий с бета-лактамным антибиотиком и последующее выявление остаточного количества антибиотика по зоне задержки роста чувствительной к нему тесткультуры, отличающийся тем, что в 0,2 - 0,3 мл суспензии испытуемых микобактерий с плотностью 10 мг влажного веса на 1 мл, приготовленной на среде Сотона, помещают бумажный диск, содержащий примерно 10 мкг антибиотика, инкубируют образец в течение 22 - 24 ч, после чего диск переносят на чашки Петри с высеянной на них тест-культурой.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в инкубируемый образец дополнительно вводят эффективную концентрацию ингибитора бета-лактамазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в микробиологии, и может быть использовано в научных исследованиях и практической медицине для изучения микобактериальных ферментов.

С целью повышения эффективности химиотерапии туберкулеза и микобактериоза все шире используют нестандартные антибактериальные препараты. Однако микобактерии проявляют высокую устойчивость к антибиотикам пенициллинового и цефалоспоринового ряда. В основе устойчивости микобактерий к данным антибиотикам лежит продукция специфических ферментов - бета-лактамаз, гидролизующих бета-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов, с образованием лишенных антибактериальной активности продуктов. Открытие ряда препаратов - ингибиторов бета-лактамазы - представляет возможность применения пенициллинов и цефалоспоринов при лечении туберкулеза и микобактериоза. Вместе с тем существуют и другие факторы устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, не связанные с продукцией микобактериальных бета-лактамаз. Поэтому применение ингибиторов бета-лактамазы в клинике требует индивидуального подхода к возбудителю. Микобактерии, выделенные у больного туберкулезом или микобактериозом, необходимо проверить на наличие фермента бета-лактамазы и возможность его ингибирования с помощью ингибитора бета-лактамазы.

Существуют различные способы определения бета-лактамазы: микробиологический, потенциометрический, иодометрический, гидроксиламинный - в зависимости от характера исследуемого материала, типа и чистоты фермента. Известные способы определения бета-лактамазы либо не учитывают бактериологические и биохимические особенности рода микобактерий, либо требуют применения сложной аппаратуры и высококачественных реактивов. Микробиологический способ определения бета-лактамазы следует признать наиболее простым в техническом отношении при получении достоверных и воспроизводимых результатов исследования.

В основе микробиологического способа Lee, Komarmy [1] определения бета-лактамазы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов лежит возможность микробной популяции инактивировать антибиотик, заключенный в диске. Стандартные диски с пенициллином помещают в 1 мл бульонной суспензии испытуемых бактерий. Пробирки с суспензией инкубируют 1 ч при 37^oC. После этого диски вынимают и помещают на мембранные фильтры, которые накладывают на поверхность агара, засеянного тест-культурой. Антибиотик диффундирует в агар в течение получаса при 37^oC, далее диски и фильтры удаляют, а чашки с агаром инкубируют до появления отчетливого роста тест-штамма. Достоинством метода является техническая простота исполнения, быстрота и наглядность полученных результатов. В то же время для определения микобактериальной бета-лактамазы способ Lee, Komarmy никем не применялся, так как род микобактерий характеризуется значительными отличиями культуральных и биохимических свойств от представителей грамположительной и грамотрицательной флоры. Одной из особенностей рода микобактерий является медленный и очень медленный рост, при котором видимые колонии образуются после 2 дней - 8 нед инкубации, в то время как максимальное образование колоний грамположительных и грамотрицательных микробов происходит за 2 ч. Отсюда исходят и отличия в ферментообразующей функции микробных клеток.

Наиболее близким к предлагаемому способу является определение бета-лактамазы микобактерий Dufour с соавторами [2], где определение остаточного пенициллина после реакции с микробной суспензией проводится методом вертикальной диффузии. К 5 мл суспензии испытуемых микобактерий прибавляют равный объем пенициллина (50 ед/мл в среде 7H9 твин-альбумин) и помещают в водяную баню при 37^oC. После 18 ч инкубации клетки осаждают центрифугированием. По 1 мл супернатанта вносят в 3 пробирки со скошенным питательным агаром. Диффундирование остаточного пенициллина проводят при комнатной температуре в течение 24 ч. На следующий день в каждую пробирку с питательным агаром и остаточным пенициллином вводят суспензию тест-культуры. Инкубация при 37^oC - 24 ч. После инкубации определяют зону подавления роста, вызванную остаточным пенициллином от основания скошенного агара до точки роста тест-культуры. Контролем служит пробирка, содержащая пенициллин без микробной суспензии.

Недостатком данного способа является сложная, кропотливая и длительная процедура приготовления скошенного питательного агара и диффундирование на его поверхности раствора пенициллина (24 ч). Дополнительные затраты времени требуются также на обязательное центрифугирование реагирующей смеси для осаждения микробных клеток. Кроме того, для каждого испытуемого штамма или нового антибиотика используются 3 пробирки со скошенным агаром, так как зона роста тест-штамма на поверхности скошенного агара не имеет четкой границы, и учет результатов затруднителен.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа определения микобактериальной бета-лактамазы. Целью является также определение инактивации микобактериальной бета-лактамазы.

Поставленная цель достигается путем контакта микобактериальной суспензии с антибиотиком, заключенным в стандартном диске, а при определении инактивации фермента и с ингибитором бета-лактамазы. Активность микобактериальной бета-лактамазы или ее ингибирование определяют по остаточному антибиотику в диске, выражающемуся в изменении зоны подавления роста тест-штамма на чашках Петри.

Отличием представленного способа определения микобактериальной бета-лактамазы является замена способа вертикальной диффузии способом диффузии с диска. Поэтому отпадает необходимость приготовления раствора антибиотика, титрования его в пробирки с последующим диффундированием на поверхность скошенного агара, что сокращает время определения фермента на 24 ч. Диски с антибиотиком после контакта с микобактериальной суспензией раскладывают на питательный агар в чашки Петри по 5 - 6 в каждую, что значительно сокращает использование лабораторной посуды и упрощает процесс работы. Зона задержки роста тест-штамма вокруг диска с антибиотиком имеет хорошо очерченную границу, что способствует получению достоверных результатов.

Таким образом, представленный способ дает возможность проводить определение бета-лактамазы одновременно у большого числа испытуемых культур микобактерий с использованием 8 - 10 дисков с различными антибиотиками. Существенным отличием представленного способа является то, что при расширении технических возможностей способа его можно использовать одновременно для определения микобактериальной бета-лактамазы и для определения ингибирования фермента. Для чего в параллельные пробирки наряду с микобактериальной суспензией и диском вносят раствор ингибитора в необходимой концентрации.

Предлагаемое время инкубации 22 - 24 ч является оптимальным для определения микобактериальной бета-лактамазы. Установлено, что длительность периода инкубации прямо пропорциональна скорости роста микобактерий. Быстрорастущие микобактерии осуществляли полный или почти полный гидролиз антибиотика за 6 ч инкубации. Активность медленнорастущих микобактерий за этот же период у различных видов составляет от 0 до 73% и достигает максимума к 22 - 24 ч (табл.1). Максимум выявления бета-лактамазы приходится на период 22-24 ч, когда 100% быстрорастущих и 69,3 - 72,7% медленнорастущих микобактерий гидролизуют антибиотик. Поэтому время инкубации 22 - 24 ч позволяет полностью выявить активность бета-лактамазы любой исследуемой культуры независимо от ее видовой принадлежности.

Для определения микобактериальной бета-лактамазы объем реагирующей смеси должен составить 0,2 - 0,3 мл, так как уменьшение диаметра зоны роста тест-штамма вокруг диска происходит не только из-за гидролиза бета-лактамных антибиотиков микобактериальными ферментами, но и за счет элиминации части антибиотика в реагирующую смесь. Известно, что диски с антибиотиками рассчитаны, как правило, на применение на плотной питательной среде, и в основе их использования лежит диффузия (элиминация) активного начала с поверхности диска. При использовании дисков в жидкой среде изменяется скорость диффузии антибиотика с диска. Кроме того, если для работы с грамотрицательными и грамположительными микробами требуется экспозиция в микробной суспензии в течение 1 ч, то для микобактериальных клеток срок инкубации составляет 22 - 24 ч. Определение изменения содержания антибиотика в диске в зависимости от объема реагирующей смеси и времени инкубации показало, что величина элиминации антибиотика с диска находится в прямой зависимости от объема реагирующей смеси и практически не зависит от времени инкубации. При объеме реагирующей смеси 1,0 и 5,0 мл с диска элиминирует от 40 до 60% антибиотика. Среда в объеме 0,1 мл практически высыхает за 24 ч инкубации. При объеме реагирующей смеси 0,2 и 0,3 мл наблюдается минимальное элиминирование антибиотика за 24 ч инкубации, что проявляется незначительным уменьшением зоны задержки тест-штамма (91,6 - 91,2%). Таким образом, для определения микобактериальной бета-лактамазы объем реагирующей смеси составляет 0,2 - 0,3 мл (табл.2). Контролем опыта является диск, заключенный в таком же объеме среды Сотона, как и объем бактериальной суспензии в опытной пробирке.

Исследования по определению микобактериальной бета-лактамазы проводятся при постоянном экспериментально отработанном числовом значении плотности суспензии - 10 мг влажного веса в 1 мл среды Сотона.

Для определения микобактериальной бета-лактамазы применяются диски как производства НТО им. Л. Я. Карпова, так и собственного изготовления. Концентрация антибиотика, нанесенная на диск, колеблется от 10 до 30 мкг. Несмотря на различия в дозе антибиотика, величина зоны задержки роста чувствительного тест-штамма вокруг контрольного диска колеблется незначительно и дает четкое представление о наличии фермента в испытанной культуре. Следовательно, можно сделать вывод, что различия в концентрации препаратов, нанесенных на диски, связаны с их индивидуальными антибактериальными свойствами. Для получения идентичных результатов необходимо иметь одинаковую эффективность воздействия на тест-культуру.

Способ определения микобактериальной бета-лактамазы применен на 469 культурах различных видов микобактерий. Установлено, что после 24 ч. контакта с пенициллином полный или частичный гидролиз антибиотика наблюдается у 90 - 100% испытанных культур всех видов микобактерий, за исключением M. avium. Необходимость последних инактивировать пенициллин при высокой резистентности к данному антибиотику позволяет предположить другой механизм устойчивости M. avium к бета-лактамным антибиотикам. Подобные результаты по определению бета-лактамазы различных видов микобактерий получены в работах Dufour с соавторами, способ которого послужил аналогом в нашей работе. С помощью предложенного способа проведено определение бета-лактамазы с последующим ингибированием фермента на культурах микобактерий туберкулеза. Установлено, что отечественный сульбактам способен подавлять микобактериальную бета-лактамазу по всей широте спектра действия (табл. 3). Незначительная активность фермента, оставшаяся в фильтрате культуры против пенициллина, была устранена увеличением дозы препарата.

В результате использования предложенного способа проведено углубленное исследование микобактериальной бета-лактамазы и установлено совпадение полученных результатов с работами зарубежных авторов:

микобактериальная бета-лактамаза характеризуется широким спектром действия и видовой специфичностью;

отечественный сульбактам ингибирует фермент в бактериальной суспензии микобактерий туберкулеза по всей широте спектра активности.

Способ определения микобактериальной бета-лакткамазы осуществляется следующим образом.

Материал:

1. Испытуемую культуру микобактерий выращивают на среде Левенштейна-Иенсена. Возраст культуры: быстрорастущие МБ 5 - 7 дней, медленнорастущие МБ 2 - 4 нед. Бактериальную суспензию МБ плотностью 10 мг влажного веса в 1 мл готовят на среде Сотона.

2. Стандартные диски с ампициллином, содержащие 10 мкг антибиотика, изготовленные в объединении НПО им. Л.Я. Карпова.

3. Индикаторный штамм St. aureus 209, высокочувствительный к антибиотикам пенициллинового ряда. Бактериальную суспензию индикаторного штамма готовили из суточной культуры в физиологическом растворе по стандарту мутности N 5 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, с последующим разведением в 10 раз.

Среда Сотона.

Последовательность определения фермента:

1-й день. Диски с ампициллином раскладывают в стерильные пробирки (120 х 16 мм). В пробирку вносят 0,2 мл суспензии испытуемой культуры МБ. Контролем опыта служит диск с ампициллином, помещенный в 0,2 мл среды Сотона без микобактериальной суспензии. Инкубация при 37^oC в течение 24 ч.

2-й день. Готовят суспензию индикаторного штамма. Для образования газона бактериальную суспензию индикаторного штамма в количестве 0,1 мл наносят на поверхность кровяного агара, растирают шпателем. Диски с ампициллином удаляют из микобактериальной суспензии испытуемой культуры с помощью петли, обсушивают на стерильной фильтровальной бумаге и раскладывают на засеянный индикаторным штаммом кровяной агар в каждую чашку Петри по 5 - 6 дисков. Инкубация при 37^oC в течение 24 ч.

3-й день. Оценка результатов опыта. Активность микобактериальной бета-лактамазы определяют по изменению диаметра зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином. Действие микобактериального фермента оценивается по следующим критериям (фиг. 1):

1 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином значительный - контроль;

2 - зона подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином отсутствует - высокая активность фермента;

3 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином уменьшен на 50% и более по сравнению с ростом вокруг контрольного диска - умеренная активность фермента;

4 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином равен контролю или уменьшен менее чем на 50% по сравнению с контролем - фермент, инактивирующий антибиотик, отсутствует.

Способ ингибирования микобактериальной бета-лактамазы осуществляется следующим образом.

Материал:

1. Культура микобактерий.

2. Стандартные диски с ампициллином.

3. Индикаторный штамм St. aureus 209.

4. Среда Сотона.

Первые четыре компонента используют для способа ингибирования как в предыдущем исследовании.

5. Сульбактам - препарат, ингибирующий фермент бета-лактамазу, синтезирован ВНИИ антибиотиков АМН (г. Москва). Навеску сульбатама 25 мг растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды, получают разведение 250 мкг в 1 мл.

Последовательность ингибирования фермента:

1-й день. Диски с ампициллином раскладывают в стерильные пробирки (120 х 16 мм). На каждую испытуемую культуру необходимо две пробирки: 1. определение активности фермента; 2. ингибирование фермента. Суспензию каждой испытуемой культуры МБ вносят по 0,2 мл в две пробирки с дисками. Во второй ряд пробирок вносят по 0,2 мл приготовленного раствора сульбактама. Контролем опыта служит диск с ампициллином, помещенный в среду Сотона без бактериальной суспензии. Инкубация при 37^oC в течение 24 ч.

2-й день. Как описано в предыдущем исследовании.

3-й день. Оценка результатов опыта. Ингибирующее действие сульбактама на микобактериальную бета-лактамазу определяют по изменению диаметра зоны роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином. Действие ингибитора бета-лактамазы оценивают по следующим критериям (фиг. 2):

1 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином значительный - контроль;

2 - зона подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином отсутствует - высокая активность фермента;

3 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма равен контролю - фермент инактивирован сульбактамом.

Простота исполнения и доступность для бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений описанного способа позволяет использовать его с целью рационального вывода химиотерапии больных туберкулезом и микобактериозом.

Источники информации

1. Lee W.S., Komarmy L. New method for detecting in vitro inactivation of penicillins by Haemophilus and Stafilococcus aureus // Abstrs. 79-th Ann. Meet. Amer.Soc.Microbiol. Los Angeles. Calif., 1979 Washington. 1979, p.12.

2. Dufour A.P., Knight R.A., Harris H.W. Mycobacterial penicillinase activity // Amer.Rev. Res.Dis. - 1966. - V.94, p.965-968.