способ получения латексного антигенного микобактериального диагностикума

Формула изобретения

Способ получения латексного антигенного микобактериального диагностикума, включающий сенсибилизацию частиц латекса белками сониката микобактерий с последующим блокированием свободных альдегидных групп латекса глицином, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют барботирование гелием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к способам получения иммуносорбентов, которые могут быть использованы в диагностике особо опасных инфекций, и касается способа получения латексного антигенного микобактериального диагностикума.

Известен способ получения латексного антигенного микобактериального диагностикума, включающий сенсибилизацию частиц латекса (АКР-2) белками сониката микобактерий при pH 8,0 - 8,6 с последующим блокированием свободных альдегидных групп латекса глицином.

Цель изобретения - повышение срока годности.

Поставленная цель достигается дополнительным барбатированием гелием.

Способ осуществляется следующим образом.

Бактериальную массу микобактерий, выращенную на синтетической жидкой среде, инактивируют 2%-ным раствором фенола в течение 2 - 3 сут., отмывают от фенола дистиллированной водой до отрицательной реакции на фенол с применением центрифугирования при 10000 об/мин в течение 30 мин. Разрушение клеток проводят на аппарате УЗДН-2Т при частоте 20 кГц с водным охлаждением 10 циклами по 2 мин. Концентрация белка - 350 мкг/мл50 мкг/мл. Латекс отмывают фосфатным буфером (pH 7,6 - 7,8) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. 5%-ную суспензию розового латекса АКР-2 добавляют по каплям к раствору микобактериальных антигенов в 0,1 М фосфатном буфере. Конечная концентрация латекса - 0,3%. Свободные альдегидные группы блокируют глицином. Диагностикум разливают во флаконы по 2,0 мл, закрывают резиновой пробкой. Через иглу, вколотую в пробку, пропускают гелей в течение 2 мин. Расход газа - 30 - 40 см³, давление - 1,2 атм. Готовый диагностикум хранят при температуре от 4 до 10^oC.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Получение латексного антигенного микобактериального диагностикума.

Бактериальную массу М. bovis (штамм Vallee), выращенную на жидкой синтетической среде, инактивируют 2%-ным раствором фенола в течение 2 - 3 дней, отмывают от фенола дистиллированной водой до отрицательной реакции на фенол (проба с 10%-ным раствором бария), центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. Микобактерии разрушают на дезинтеграторе УЗДН-2Т с охлаждением бактериальной массы в ледяной бане в режиме прерывистых циклов (2 мин разрушения - 2 мин пауза) при частоте 20 кГц (10 циклов). Концентрация белка в соникате - 300 - 500 мкг/мл. Латекс АКР-2 отмывают 2 раза водой (pH 7,6 - 7,8) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. 5%-ную суспензию латекса в 0,1М фосфатном буфере по каплям добавляют к раствору микобактериальных антигенов в 0,1М фосфатном буфере. Конечная концентрация латекса 0,3%. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч при постоянном помешивании на магнитной мешалке ММ-5 со скоростью 400 об/мин. Сенсибилизированный белками латекс отмывают дистиллированной водой 1 раз и инкубируют в 1%-ном растворе глицина в фосфатном буфере 0,1М (pH 7,8 - 8,0) при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования свободных альдегидных групп. Полученную суспензию сенсибилизированного латекса отмывают 2 раза дистиллированной водой с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин и разливают по 2,0 мл в пенициллиновые флаконы, которые закрывают резиновой пробкой. По игле, вколотой в пробку, пропускают гелий из расчета 30 - 40 см³ при давлении 1,2 атм в течение 2 мин, затем герметически укупоривают флаконы.

Пример 2. Активность латексного антигенного микобактериального диагностикума в зависимости от срока хранения определяют в реакции агглютинации с кроличьей иммунной сывороткой к М. bovis, штамм Vallee. Учет реакции проводят визуально по общепринятой четырехкрестной системе на чистых сухих серологических пластинах, на белом фоне. Результаты представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, хранение обработанных гелием диагностикумов в течение 18 месяцев практически не повлияло на их качество.

Пример 3. Активность латексного диагностикума трех серий (11, 12, 13) в зависимости от срока хранения определяют, как в примере 2, с кроличьей иммунной сывороткой к M. avium. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, ни одна из трех испытанных серий не дала с гипериммунной кроличьей сывороткой к M.avium агглютинационного титра выше 1:20, что указывает на видовую специфичность диагностикума независимо от срока хранения.

Пример 4. Сравнительное изучение латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами, проводят как в примере 2, на сыворотках крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Нижегородской области. За диагностический принят титр 1: 40. Результаты представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, практически отсутствуют различия в активности латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами.

Пример 5. Изучение специфической активности латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами, проводят, как в примере 2, с сыворотками крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств Нижегородской области. За диагностический принят титр 1:40. Результаты представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, практически отсутствуют различия в специфической активности латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами. Ни одно из здоровых животных не дало с диагностикумами реакции в титре 1:40 и выше.

Таким образом, в предлагаемом техническом решении удалось подобрать такие условия, при которых срок годности увеличивается до 18 месяцев при сохранении активности латексного антигенного микобактериального диагностикума, что расширяет возможности его применения.