штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней штамм т-75

Формула изобретения

Штамм гибридных культивированных клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) 647 D - продуцент моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней штамм Т-75.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии, иммунологии и биотехнологии, а именно гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и асцитических жидкостях моноклональные антитела (МАт) к вирусу везикулярной болезни свиней (ВБС) штамм Т-75, которые могут быть использованы для научных исследований и приготовления средств диагностики, профилактики и лечения ВБС.

ВБС - высококонтагиозная болезнь свиней всех возрастных групп, характеризующаяся острым течением, лихорадкой и поражением кожного покрова с образованием везикул на рыле, конечностях в области венчика, межкопытной щели и мякишей. Возбудитель-энтеровирус, относящийся к пикорновирусам. Установлено два серотипа вируса. В серологических реакциях обнаружено антигенное родство между вирусами везикулярной болезни и энтеровирусом человека - Коксаки В5. К вирусу чувствительны первично-трипсинизированные монослойные культуры почек свиней, мышей, а также перевиваемые линии клеток JBRS-2 и PK-15.

Впервые ВБС была зарегистрирована в Италии в 1966 г., когда при исследовании патматериала, взятого от свиней, подозреваемых в заболевании ящуром, выделили вирус, относящийся к роду энтеровирусов. С 1972 г. эта болезнь охватила ряд стран Европы, где регистрируется периодически.

Источник инфекции - больные свиньи. Болезнь может распространяться с продуктами убоя таких свиней, необеззараженными отходами животного происхождения, инфицированными вирусом объектами внешней среды (помещения, предметы ухода, транспорт и т.д.). Считается, что во время перелета скворцов и усиленной миграции диких свиней возможно увеличение заболеваемости домашних свиней. Болезнь характеризуется меньшей контагиозностью и распространяется медленнее, чем ящур, с охватом меньшего количества животных. В неблагополучных хозяйствах с низкой санитарной культурой может поражаться 100% восприимчивых свиней, причем у 5-6% из них отмечают осложнения на конечности, которые проявляются отторжением рогового башмака. Продолжительность болезни 7-10 сут. Течение более доброкачественное, чем при ящуре.

Постановка диагноза и дифференциальная диагностика осуществляются по эпизоотическим, клиническим и патологоанатомическим данным. Однако ВБС трудно отличить от ящура, везикулярного стоматита и везикулярной экзантемы свиней. Поэтому для исключения указанных болезней и постановки правильного диагноза необходимо исследовать патматериал от больных животных в серологических и иммунохимических реакциях со специально приготовленными антительными и антигенными реагентами. При отсутствии патматериала нужного качества проводят вирусологическое исследование заражением чувствительных культур клеток с последующей постановкой указанных реакций [1].

В связи с тем, что заболевание является опасной для свиноводства вирусной инфекцией, это вынуждает интенсифицировать работу по созданию более эффективных средств диагностики и профилактики ВБС. Для выявления и идентификации вируса ВБС и противовирусных антител наиболее перспективным является иммуноферментный анализ с применением МАт, которые широко используют зарубежные исследователи [2].

МАт - это наиболее эффективный инструмент для изучения закономерностей взаимодействия вируса и клетки, выявления патологических и функциональных характеристик и биологических свойств возбудителя. С помощью МАт можно изучить антигенное родство штаммов вируса ВБС, а также провести идентификацию возбудителей заболеваний, протекающих с везикулярным синдромом (везикулярная экзантема свиней, везикулярный стоматит, ящур).

МАт имеют ряд преимуществ перед традиционно применяемыми поликлональными антителами. Они характеризуются химической гомогенностью, строго определенной специфичностью к антигенным детерминантам вируса. Источники их получения (гибридомы) отличаются генетической стабильностью и могут длительное время сохраняться в жидком азоте. МАт могут быть наработаны в любых количествах в виде асцитической жидкости мышей или супернатантов культуры клеток.

Для диагностики и идентификации болезней, протекающих с везикулярным синдромом, широко применяется иммуноферментный анализ с использованием МАт.

Известны штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующих МАт к вирусу ящура шести типов A, O, C, Азия-1, САТ-1 и САТ-2 [3 - 7] и к вирусу везикулярного стоматита [8 - 11].

В настоящее время известен также штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих МАт к вирусу ВБС, штамм O-72 [12].

В этой работе приведены данные о получении 10 позитивных клонов гибридных клеток мышей, продуцирующих моноклональные антитела на цельный вирус ВБС, штамм O-72. Титр антител в супернатантах этих клонов по данным ИФА составил 1: 10 - 1:100. Специфическая активность асцитной жидкости была на 3-4 порядка выше по сравнению с супернатантами. С гетерологичными антигенами супернатанты и асцитные жидкости перекрестно не реагировали.

В России штамм вируса Т-75 вируса ВБС является производственным и используется при изготовлении вакцины и диагностических препаратов [13].

Однако в доступных нам источниках информации мы не обнаружили сведений о получении МАт к штамму Т-75 вируса ВБС.

В задачу создания изобретения входило получение штамма гибридных культивируемых клеток (гибридом), продуцирующих МАт к штамму Т-75 вируса ВБС высокоактивных в иммуноферментном анализе и реакции нейтрализации с гомологичным вирусом.

Поставленная задача решена тем, что получен новый, ранее неизвестный штамм гибридных культивируемых клеток мыши (Mus musculus L.) VBS N 1-96, продуцирующий МАт к вирусу везикулярной болезни свиней, штамм Т-75. Культура хранится в музее ВНИИ защиты животных на 6-10 пассажах в культуре клеток, выращиваемых в пластиковых матрасах, а также после перевивания на мышах линии BALB/c, депонирована во Всероссийской коллекции клеточных культур института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером ВСКК(П)647Д.

Характеристика полученного штамма 1.

Родословная штамма.

Гибридный штамм VBS-96 получен слиянием мышиных миеломных клеток линии PAI с клетками селезенки мыши линии BALB/c, предварительно иммунизированный вирусом ВБС штамм Т-75.

2. Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования.

Клетки заморожены на 6-10 пассажах в культуре клеток, выращиваемых в пластиковых матрасах, а также после перевивания на мышах линии BALB/c.

3. Стандартные условия выращивания.

Температура культивирования +37^oC. Среда культивирования DMEM с добавлением 15% сыворотки эмбрионов коров, 50 мкг/мл гентамицина, pH 7,0-7,2.

4. Культуральные свойства.

Штамм растет на средах для культур клеток млекопитающих IMDM, DMEM, RPMI-1640 с добавлением 10-20% фетальной сыворотки КРС с 50 мкг/мл гентамицина. При селекции гибридных клеток в питательную среду добавляют гипоксантин-аминоптерин-тимидин (ГАТ) в рабочих разведениях. Оптимальная ростовая концентрация клеток 150000 кл/мл. Оптимальная pH среды 7,0-7,2, клетки инкубируют во влажной атмосфере с 5% CO₂ при 37^oC. При посеве единичные клетки в процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями, затем колонии сливаются и формируют сплошной монослой. При посевной дозе 150000 кл/мл сплошной монослой формируется на 2-3 день. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью. Легко снимаются со стенок посуды встряхиванием без применения трипсина и версена. Жизнеспособность клеток поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева - 3 раза в неделю.

Кратность рассева составляет 1:2 - 1:5.

Тип роста - станционарная суспензия. При введении гибридом внутрибрюшинно у мышей линии BALB/c образуется асцитная или твердая опухоль. Перед введением клеток за 5-20 дней этим животным вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл минерального масла (ТУ-38-101-884-84). Титр антител в асцитической жидкости в ИФА составляет 10^-3-10^-5. От одной мыши получают 3-10 мл асцита. Асцит образуется через 14-20 дней.

5. Характеристика культивирования гибридомы в организме животного.

Образует асцитические опухоли на мышах BALB/c. Доза клеток при перевивке 4-10 млн/мл мышам, праймированным 0,3-0,5 мл минерального масла (ТУ-38-101-884-84) за 5-20 дней до введения клеток. Срок образования асцита через 10-20 дней, не теряет антителопродуцирующей способности при перевивке в течение 6-10 пассажей на мышах (срок наблюдения).

6. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика.

Кариотип соответствует виду (мышиный). Модальный класс - 84 хромосомы. Модальный класс для родительской миеломной линии PAI-64 хромосомы.

7. Цитоморфологическая характеристика.

Клетки круглые, различной величины. Ядра занимают большую часть клетки.

8. Онкогенность.

Штамм обладает онкогенными свойствами, характеризующимися образованием асцитов или твердых опухолей у мышей линии BALB/c.

9. Маркерные характеристики.

Изоферменты ЛДГ соответствуют мышиным (одна изоформа с дополнительной полосой). Гибридные клетки продуцируют МАт к вирусу ВБС штамм Т-75.

10. Данные о контаминации.

Микробиологическим, цитохимическим (окраска оливомицином, акридиновым оранжевым) и электронно-микроскопическим методами контаминанты не обнаружены.

11. Биотехнологическая характеристика.

Штамм продуцирует МАт, относящиеся к классу IgG и обладающие специфической активностью в ИФА и РН на культуре клеток ПГСК, обнаруживаются в асцитической жидкости в ИФА на протяжении 6-10 пассажей на мышах (срок наблюдения) в разведениях 10^-3-10^-5 и обладают специфической активностью к вирусу ВБС, штамм Т-75. Активность в РН - 6,5 лог₂. Культуральную жидкость можно применять в качестве диагностического антительного препарата, однако для получения более высокого титра антител до 10⁵ гибридные клетки в дозе 1-10 млн/0,5 мл вводят внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, праймированным мышам внутрибрюшинно минеральные масла. Через 14-20 дней после появления у мышей асцитных или твердых опухолей собирают жидкость (3-10 мл), клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость содержит МАт. Осадок, содержащий гибридные клетки, вновь вводят мышам. Для повышения активности и специфичности МАт проводят их концентрирование и очистку, выделяя чистые иммуноглобулины. Иммуноглобулиновую фракцию получают путем трехкратного осаждения полунасыщенным раствором сульфата аммония и центрифугируют при 3500 об/мин в течение 30 мин.

Осадок ресуспендируют в уменьшенном количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР) с последующим диализом против этого же буфера при +4^oC 24-48 часов. Культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл, а асциты - 20-30 мг/мл специфических иммуноглобулинов.

12. Способ криоконсервирования.

Гибридомные клетки консервируют в жидком азоте в пластиковых или стеклянных ампулах в объеме 1 мл с концентрацией 4-10 млн/мл. Криозащитная среда: ДМЕМ-50%, фетальная сыворотка КРС-43%, диметилсульфоксид-7%. Выживаемость клеток после хранения 60-90%. Размораживание проводят при 38^oC в течение 70 секунд. Ампулы с клетками центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин и переносят во флакон. Выращивание на среде ДМЕМ с 15-20% фетальной сыворотки и ГАТ и высевают в стеклянный матрас объемом 50 см³. Клетки инкубируют при температуре 37^oC. Когда колонии заполнят 50-70% площади матраса, отбирают пробу культуральной жидкости для определения титра антител к вирусу ВБС в ИФА. Наивысший титр антител отмечен при полном монослое.

Предложенный штамм гибридных культивируемых клеток получен по ранее разработанной методике [14] следующим образом.

Мышам линии BALB/c в возрасте 1,5-2 месяцев вводили интраперитонеально вирус ВБС штамм Т-75 в количестве 100 мкг/мышь в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Через 21 день проводили гипериммунизацию мышей интраперитонеально этим же антигеном в дозе 100 мкг/мышь без адъюванта. Спустя три дня после повторного введения антигена проводили тестирование сыворотки крови мышей на наличие специфических антител в ИФА. В опыт отбирали доноров с титром антител в сыворотке крови не менее 10³.

Для гибридизации у иммунизированных мышей стерильно брали селезенку, гомогенизировали ее и клетки ресуспендировали в 50 мл культуральной среды ДМЕМ без сыворотки. Клетки миеломы линии PAI в логарифмической фазе роста отмывали в среде ДМЕМ от сыворотки и смешивали с иммунными клетками селезенки в соотношении 1: 1 - 1:5 и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 10 минут. К осадку по каплям в течение минуты добавляли 50% раствор ПЭГ с м.м. 4000, содержащий 5% ДМCO. Клетки оставляли на 5 минут с ПЭГ. Затем по каплям в течение минуты добавляли 5 мл среды ДМЕМ без сыворотки и оставляли на контакт еще на 5 минут. Полученную суспензию клеток разбавляли средой ДМЕМ, содержащей 20% фетальной сыворотки и ГАТ, в количестве 13,6 мг/л, 0,176 мг/л и 3,78 мг/л соответственно в рабочих концентрациях. Клетки вносили в 96-24-луночные пластины фирмы "Costar" (США) по 0,2-1,0 мл с концентрацией 100-20 тыс/лунка соответственно. Через 10-14 дней супернатанты гибридных клонов тестировали на наличие антител в ИФА.

Позитивные клоны составляли от 5-50% от общего количества клонов. Эти клоны дважды субклонировали методом предельных разведений. Стабильный клон с наивысшим титром антител (МАт-3Д1) заложили на хранение в банк клеток (ВНИИЗЖ) под авторским названием VBS N 1-96 и депонировали во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером ВСКК (П) 647Д.

Пример 1. Антиген ВБС штамм Т-75 идентифицируют в ИФА с помощью МАт. Для этого МАт, разведенные в 0,02-молярном карбонатно- бикарбонатном буфере pH 9,5 в количестве 100 мкл/лунка в концентрации 1-10 нг/лунка, вносят в лунки пластин из полистирола для ИФА и инкубируют в течение 12-14 часов при температуре 4^o или 20^oC. После сорбции избыток антител удаляют и 3-5 раз промывают лунки ФБР с 0,05% Твин-20. Затем в лунки вносят по 100 мкл испытуемого антигена в ФБР с 10% фетальной сыворотки КРС. Антиген готовят путем пяти- или десятикратных разведений в этом же растворе. Антиген инкубирут в лунках планшета 2 часа при 37^oC, а затем 3-5 раз отмывают в ФБР. После этого в лунки вносят конъюгат (МАт, меченые пероксидазой хрена) в рабочем разведении. Конъюгат на ФБР с 10% фетальной сыворотки КРС до концентрации 1-5 мкг/мл в расчете на IgG и инкубируют 1-2 часа при комнатной температуре. Затем лунки 3-5 раз промывают ФБР и в них вносят субстрат, содержащий орто-фенилендиамин 0,4 мг/мл в 0,1М цитрат-фосфатном буфере pH 5,0 и 0,01% перекиси водорода. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-5 минут проводят учет реакции путем определения оптической плотности раствора на автоматическом 12-канальном спектрофотометре фирмы "Dynateck". Реакцию можно учитывать и визуально по интенсивности окраски оранжевого цвета. Установлено, что штамм гибридных клеток стабилен как по культуральным и морфологическим признакам, так и по титру специфических антител в ИФА и РН.

Активность и специфичность МАт к вирусу ВБС определяется в ИФА и РН как с гетерологичными антигенами (вирус ящура A₂₂ N 550, O₁ N 194 и ВЭС), так и с гомологичным антигеном (ВБС штамм O-72).

Проведенные испытания показали, что МАт к вирусу ВБС штамм Т-75 не реагируют с возбудителями ящура, везикулярной экзантемы свиней и везикулярной болезни свиней штамм O-72.

Данные определения специфической активности культуральной жидкости, содержащей МАт, полученные от штамма VBS N 1-96 регистрационный номер ВСКК(П)647Д, с гомо- и гетерологичными антигенами представлены в таблице.

Согласно данным, представленным в таблице, МАт клона 3Д1 имеют высокую специфическую активность с гомологичным антигеном ВБС штамм Т-75 и не активны с антигенами (ВБС штамм O-72, ВЭС штамм A-48 и C-72, ВЯ A₂₂ N 550 и O₁ N 194).

Пример 2. Титрование моноклональных антител к вирусу ВБС в реакции микронейтрализации на микропанелях.

Реакция микронейтрализации ставится против 100 ТЦД₅₀ в 50 мкл вируссодержащей жидкости, определяемые с помощью референтных сывороток, взятых от переболевших животных разных видов.

Схема постановки РН на 96-луночных микропанелях.

Во все лунки панели вносят по 5 мкл ростовой среды без сыворотки с антибиотиками по 50 мкл, моноклональных антител и 12-канальной пипеткой без смены наконечников перемешивают содержимое лунок и переносят по 50 мкл из ряда A до ряда H, т.е. делают двухкратные разведения. Из последнего ряда 50 мкл удаляют. Предварительно подготовленные разведения вируса вносят во все лунки, намеченные для данной дозы вируса, используя при этом 4-канальную пипетку. Доза вируса в 50 мкл.

Инкубируют при 37^oC в течение часа в CO₂ - атмосфере.

Во все лунки панели вносят суспензию клеток в ростовой среде в концентрации 0,5 - 1,010⁶ кл/мл по 50 мкл.

Инкубируют при 37^oC в течение 48 часов.

По истечении указанного времени панели просматривают под инвертированным микроскопом, регистрируя лунки с выраженным ЦПД и/или лунки со сформировавшимся монослоем.

Реакцию считают достоверной, если:

контроль дозы вируса показал, что в реакции использовали 32- 316 ТЦД₅₀/50 мкл;

контроль культуры клеток показал наличие клеточного монослоя без признаков дегенерации;

в контроле среды и контроле ростовой среды отсутствуют признаки контаминации;

контроль токсичности тестируемых моноклональных антител показал отсутствие таковой, т.е. наличие плотного монослоя без признаков дегенерации.

Положительным считают титр сыворотки 1:16.

Полученные в соответствии с изобретением МАт, как химически чистые реагенты, могут применяться в ИФА и РН для обнаружения вируса ВБС штамм Т-75 и противовирусных антител в сыворотке крови восприимчивых сельскохозяйственных животных, а также при генно-инженерной и молекулярно-биологической характеристике возбудителя.

Кроме того, МАт против вируса ВБС могут быть весьма полезны в ветеринарной вирусологии в практических и чисто научных областях при:

идентификации полевых вирусных изолятов;

идентификации иммунологически важных антигенных сайтов на уровне аминокислотных последовательностей;

характеристике антигенных сайтов с использованием различных вариантов иммуноферментного анализа.

Использование МАт в ветеринарной практике при диагностике и профилактике заболевания сельскохозяйственных животных позволит оптимизировать диагностику и эпизоотическую ситуацию в стране по везикулярным болезням.

Источники информации:

1. Справочник ветеринарного врача, Н.М.Алтухов, В.И.Афанасьев, Б.А.Башкиров и др. ; Сост. А.А. Кунаков. - 2-е изд., перераб. и доп. - M.: Колос, 1996, 90-93.

2. Hedger R., Mann J. Swine vesicular disease virus. Virus Infections of Porcines. Amsterdam etc., 1989, 241-250.

3. Авт. св. СССР N 1565021 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент МАт к вирусу ящура O-1618", кл. C 12 N 5/00, 1987.

4. Авт. св. СССР N 1692146 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к 146 S компоненту вируса ящура O", кл. C 12 N 5/18, 1989.

5. Авт.св. СССР N 1692147 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител 146 S компоненту вируса ящура C₁ N 564", кл. C 12 N 5/18, 1989.

6. Пат. СССР N 1751202 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к 146 S компоненту вируса ящура A₅ (Алье)", кл. C 12 N 5/00, 1992.

7. Пат. России N 2012594 на "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к 146 S компоненту вируса ящура Азия-1, кл. C 12 N 5/00, 1991.

8. Pal R., Grinuell B., Snyder K., Wagner R. Regulation of viral transcription by the matrix protein of vesicular stomatitis virus probed by monoclonal antibodies and temperature - sensitive mutants. J.Virol., 1985, 56, 2, 386-394.

9. De Bishnu P., Tahara S., Banerjee A., Production and characterization of a monoclonal antibody to the protein vesicular stomatitis visus (Indiana serotype). J.Virol., 1982, 122, 2, 510-514.

10. Ohno S., Arnheiter H., Dubois-Dalcg M., Lazzarini R.lmmunocytochenucal localization of vesicular stomatitis virus proteins N and with monoclonal antibodies. J.Histochemistry, 1985, 82, 2, 185-196.

11. Vernon S., Webb P. Recent VSV infection detected by immunoglobulin M antibody capture ewzyme - linked immunosorbent assay. J.CIin.Microbiol, 1985, 2, 4, 582-586.

12. Фоменко В.Ю., Глобенко Л.А., Шажко Ж.А. Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела к возбудителям везикулярной экзантемы свиней и везикулярной болезни свиней. В мат.междунар.науч.конф. "Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы". - Харьков, 1995, 529-531.

13. Инструкция по изготовлению и контролю гипериммунных сывороток и эталонных антигенов вируса везикулярной болезни свиней для реакции связывания комплемента, используемой в диагностических целях. Утверждена ГУВ ГАПК СССР 5 июля 1987 г.

14. Методика получения и поддержания гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела к вирусу ящура Азия-1. Утверждена директором ВНИИЗЖ 22.06.94 г.

15. Методика выявления антител к вирусу ящура и везикулярных болезней в PH на микропанелях. Авторы: С.А.Дудников, С.Р.Кременчугская, И.Н.Селютина, С. Г.Баранов, Н.С.Дудникова. Утверждена директором института ВНИИЗЖ 31.01.96 г.

16. Tanda Т., Tokni Т., Ondere T. Induction of neitralising antibodies by structural proteins VP, and VP₂ swine vesicular disease virus, Jan.Vet. Sci., 1987,49, 1, 129-132.

17. Ferris N., Powell H., Donaldson A. Use of precoated immunoplates and freere - dried reagents for the diagnosis of fooy and mouth disease and swine vesicular disease by enzime linked immunosorbent assay (ELISA). J.Virol. Methods, 1988, 19, 3-4, 197-206.

18. Ferris N. , Dawson M. Rontine application of enzyme - linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot - and mouth disease and swine vesicular diseases. J.Vet. Microbiol, 1988, 16, 3, 201-209.

19. Amstrong R. , Barnett l., An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and guantification of antibodies against swine Vesicular disease virus (SVDV)/ J.Virol.Metods, 1989, 25, 1, 71-80.

20. Williams P., Williamson K., Emerson S. Monoclonal antibodies to the N3 protein of VSV inhibit initiation of transcripts in vitro and dissociate leader RNA from m RNA synthesis.J.Virol., 1988, 167, 2, 342-348.