способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2
Классы МПК: | C12N15/21 альфа-интерферон C12P21/00 Получение пептидов или протеинов |
Автор(ы): | Пикалова М.И., Доманова З.М., Хайбуллина И.И., Остапенко Е.В., Горина Г.И., Наумова Н.В., Юдина И.В., Колокольцов А.А. |
Патентообладатель(и): | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" |
Приоритеты: |
подача заявки:
1996-05-06 публикация патента:
27.08.1998 |
Способ может быть использован для производства рекомбинантного интерферона-альфа-2 человека в промышленном масштабе. Штамм Esoherichia coli SG 20050/pIF выращивают в LB - среде при скорости вращения перемещивающего устройства 12-15 об/мин и интенсивности аэрации 0,5-0,8 л/л
ч. Накопление полипептида составляет (2,4-4,1)
107 МЕ/мл. 4 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
Формула изобретения
1 Способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, включающий глубинное культивирование рекомбинантных бактерий в питательной среде при температуре 30![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118079/186.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к производству рекомбинантного интерферона-альфа-2 человека в промышленном масштабе. Интерферон-альфа-2 является одним из основных компонентов лейкоцитарного интерферона человека и известен своими противовирусными и противоопухолевыми свойствами. Известен способ промышленного получения природного лейкоцитарного интерферона, основанный на использовании лейкоцитов донорской крови, индуцированных вирусом [1]. Низкий выход продукта, высокая стоимость сырья и ограниченность его источников определяют высокую стоимость препарата, получаемого этим способом, и накладывают ограничения на возможность его производства в количествах, необходимых для медицины и научных исследований. Поэтому в течение последних 15 лет в ведущих странах мира проводятся исследования по получению человеческого лейкоцитарного интерферона микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов. Известен способ получения альфа-интерферона с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli 294/pLelFA (ATCC 31446) с плазмидой, содержащей структурный ген человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа A (патент США N 4656131) [2]. Способ заключается в том, что в 5-литровом ферментере выращивают биомассу E.coli 294 на химически определенной среде. Используют стандартную среду М-9, обогащенную добавлением глюкозы, L-глутамата натрия, хлорида железа шестиводного, сульфата меди пятиводного, сульфата цинка, витамина B1, тетрациклина гидрохлорида, L-пролина и L-лейцина. Культивирование ведут при перемешивании 1000 об/мин, аэрации 1 л/л питательной среды в мин и при температуре 37oC, в ходе процесса температуру ступенчато понижают до 25oC в зависимости от оптической плотности культуральной жидкости. В течение культивирования добавляют глюкозу по мере ее потребления до исходного уровня 25 г/л, что обеспечивает уровень биосинтеза интерферона около 3,2![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
описанная технология получения интерферона-альфа A человека микробиологическим синтезом осуществлена на лабораторном оборудовании; прямой перенос результатов от лабораторной установки к промышленному аппарату неочевиден, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии, так же как и в химической технологии, непригодны [3];
при выращивании используют многокомпонентную дорогостоящую питательную среду, содержащую очищенные аминокислоты и витамин B1;
для достижения высокого выхода целевого продукта используют дробное многократное добавление раствора глюкозы, что усложняет технологический процесс;
используемый штамм недоступен российским производителям. Известен штамм-продуцент полипептида с биологической активностью лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека E.coli SG20050/plF14. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте в LB среде образуют интенсивную ровную муть. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 500 мкг/мл) благодаря наличию транспозона [4]. Штамм-продуцент E.coli SG20050/plF14 обуславливает конститутивный синтез полипептида со свойствами интерферона-альфа-2 человека на уровне 1,2-2,5
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
необходимость в тщательном контроле и регулировании условий культивирования: температуры, pH, парциального давления кислорода, оптической плотности среды;
выход целевого белка составляет не более 2,6
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
при культивировании на одном и том же промышленном оборудовании выход целевого белка также на порядок ниже выхода достигаемого при культивировании E.coli SG 20050/plF16 (таблица 4 );
более высокая по сравнению с культивированием E.coli SG20050 plF/16 стоимость питательной среды;
более высокие энергетические затраты, необходимые для интенсивной аэрации и интенсивного перемешивания культуральной жидкости. Задачей изобретения является разработка технологии крупномасштабного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2 при культивировании рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающей оптимальные условия культивирования и, как следствие, максимальное накопление альфа-2-интерферона в клетках бактерий при одновременном снижении энергетических затрат и трудоемкости процесса. Поставленная задача решается тем, что в способе промышленного получения интерферона-альфа-2 человека путем глубинного культивирования рекомбинантного штамма-продуцента на стандартной LB среде при исходном значении pH 7,0-7,2 и температуре 30
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
Готовят LB среду с антибиотиками на водопроводной воде, очищенной от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 мкм (например, ультрафильтрационный аппарат НПО "Химволокно"). Стерилизуют питательную среду известным методом стерилизующей фильтрации (например, используя патронные фильтры фирмы "Millipor" или "Владисарт"). Лабораторный ферментер объемом 5 л со стерильной LB средой с антибиотиками засевают клетками E.coli SG 20050/plF16. Объем питательной среды 3,0 л. Для засева ферментера используют колонии, выращенные на агаризованной LB среде, суспендированные в 50 мл питательного бульона. Культивирование ведут в течение 16-24 ч при постоянном перемешивании со скоростью 100 об/мин и аэрации из расчета 0,5 л сжатого воздуха на литр культуральной жидкости в час. Начальное значение pH среды 7,0-7,2. В процессе культивирования значение pH не регулируют. Выращенным инокулятом засевают промышленный ферментер вместимостью 250 л и культивируют при следующих условиях: обьем питательной среды 100 л; температура 30
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/177.gif)
![способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2, патент № 2118366](/images/patents/353/2118007/183.gif)
1. Human lymphoblastoid interferon. Large scale production and partial purification.//Bridgen P.J. et al. J.Biol.Chem. 1977, p. 6885-6887. 2. Патент США N 4656131. Method for producing interferons. МКИ C 12 P 21/00, НКИ 435/68. 3. Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов. Обзор. Бирюков В.В. Кузьмина Л.М., М. 1984, ВНИИСЭНТИ. 4. Авторское свидетельство СССР N 1703691. C 12 N 15/21. Рекомбинантная плазмидная ДНК plF14, кодирующая полипептид со свойствами лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона-альфа-2 человека. 5. Патент РФ N 2054041. C 12 N 15/21. Рекомбинантная плазмидная ДНК plF16, кодирующая зрелый лейкоцитарный интерферон альфа-2 человека, штамм E. coli - продуцент зрелого интерферона альфа-2 человека. 6. Авторское свидетельство СССР 1712416. C 12 N 15/00. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species.
Класс C12N15/21 альфа-интерферон
Класс C12P21/00 Получение пептидов или протеинов