способ выделения и очистки нуклеиновых кислот

Формула изобретения

1. Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот, включающий связывание нуклеиновых кислот с силикатным сорбентом в среде хаотропных агентов, отделение силикатного сорбента и связанных с ним нуклеиновых кислот, элюцию нуклеиновых кислот с силикатного сорбента и отделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве силикатного сорбента используют аэросил.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аэросил вносят в содержащую нуклеиновые кислоты жидкость до конечной концентрации 0,3 - 0,6%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выделения однонитевой ДНК и РНК используют среду с содержанием 0,5-2 М хаотропных агентов.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выделения двунитевой ДНК используют среду с содержанием 3-4 М хаотропных агентов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молекулярной биологии, касается способов выделения и очистки нуклеиновых кислот (НК) с помощью силикатных сорбентов и может быть использовано для выделения плазмидной ДНК, однонитевой ДНК, хромосомальной ДНК, фрагментов ДНК из гелей и РНК.

Уровень техники

Получение высокоочищенных НК является важной проблемой в молекулярной биологии. Для получения плазмидной ДНК из грубых спиртовых преципитатов используют такие методы, как центрифугирование в градиенте CsCl, гельфильтрацию или РНКазное и протеиназное расщепление, многократное осаждение спиртом. Эти методы требуют выполнения отличающихся высокой трудоемкостью процедур по удалению CsCl и других солей, бромистого этидия и спирта. Аналогичными недостатками обладает любой из вышеуказанных методов по очистке фрагментов ДНК (1).

Известно использование оксиапатита для селективного выделения одно- и двунитевых НК(2).

Недостатки данного способа состоят в том, что НК не освобождаются от белков и, кроме того, для элюции НК используют фосфатные буферные растворы, которые не пригодны для осаждения из них НК спиртом. Этот метод требует предварительной очистки НК от белков и других веществ и последующее удаление фосфатитов перед спиртовым осаждением.

Известен способ выделения и очистки ДНК с помощью стеклянного порошка или силикатных сорбентов в присутствии хаотропных агентов (NaClO₄, гуанидина гидрохлорид, гуанидинтиоцианат и др.). В среде хаотропных агентов они селективно связывают одно- и двунитевые ДНК, тогда как РНК, белки, агароза и другие вещества удаляются. Хаотропные агенты смывают обычно спиртом, а ДНК элюируют водой или растворами с низким содержанием солей (1,3 - 6).

Недостатки данных методов состоят в низкой сорбционной емкости сорбентов для ДНК и невозможности выделения РНК. Кроме того, стеклянный порошок часто имеет поверхность, несовместимую с боратными буферами и делающей одиночные разрывы.

Известен способ выделения и очистки ДНК, включающий связывание ДНК с соединением гидратированного диоксида кремния в присутствии воды или физиологических буферов, причем соединение гидратированного кремния получают путем дефлагмации смеси SiO₂ и гидроксида натрия или калия при молярном соотношении 2: 1 - 10:1 в течение (приблизительно) 48 часов, отделение и промывание гидратированного соединения диоксида кремния и связанной с ним ДНК, элюцию ДНК с гидратированного соединения кремния в нагретом физиологическом буфере или в нагретой воде (7).

Недостатки данного способа заключаются в его длительности и низкой сорбционной емкости для ДНК, так как гидроксид натрия превращает двуокись кремния в соль Na₂SiO₃ - жидкое стекло или конторский клей, то есть соединение, обладающее слабыми сорбционными свойствами.

Известен препарат аэросил А-300 (далее аэросил) отечественного производства, представляющий собой высокодисперсную аморфную двуокись кремния высокой степени чистоты в виде белого порошка без запаха и вкуса. Аэросил является химически стойким, хорошо смешивающимся с большинством органических и неорганических растворителей.

Его техническая характеристика:

Двуокись кремния, % - 99,8 - 99,9

Двуокись титана, окись алюминия, трехокись железа, % - 0,093

pH водной суспензии - 3,6 - 4,3

Удельная поверхность в зависимости от марки, м²/г - 150 - 400

размер частиц, нм - 5 - 40

Аэросил получают пиролизом четыреххлористого кремния. Известно использование аэросила в производстве искусственной кожи и пленочных материалов (8,9).

Известен также способ приготовления противоящурной вакцины, включающий получение вируссодержащей суспензии, ее очистку, инактивацию и адсорбцию из нее антигена аэросилом, который используют в виде 3-5%-ной водной суспензии (10).

Наиболее близким по совокупности существенных признаков предлагаемому изобретению является способ выделения и очистки ДНК, включающий связывание ДНК с силикатным сорбентом Prep-A-Gene, представляющим собой гель двуокиси кремния, в среде хаотропных агентов, отделение и промывание сорбента и связанной с ним ДНК, элюцию ДНК с сорбента и отделение целевого продукта (1).

Недостатки способа - прототипа состоят в том, что сорбент Prep-A-Gene является импортным препаратом, обладает низкой сорбционной емкостью для ДНК (0,3 мкг на 1 мкл сорбента) и не может быть использован доля селективного выделения ДНК и РНК.

Сущность изобретения

В задачу создания настоящего изобретения входили поиск нового силикатного сорбента отечественного производства, обладающего более высокой по сравнению с прототипом сорбционной емкостью для НК и способностью селективно связывать одно- и двунитевые ДНК и РНК, и разработка на его основе способа выделения и очистки НК, который должен быть простым, быстрым и дешевым. Полученные препараты ДНК и РНК должны быть пригодны для немедленного использования в качестве субстратов: ДНК- для рестрикционного анализа, лигирования, секвенирования, РНК- для RT-PCR.

Поставленная задача решается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:

1) способ выделения и очистки НК;

2) связывание НК с силикатным сорбентом аэросилом;

3) добавление аэросила в содержащую НК жидкость до конечной концентрации 0,3 - 0,6%;

4) связывание НК с аэросилом проводят в среде хаотропных агентов;

5) использование среды с 0,5 - 2 М хаотропных агентов для выделения однонитевой ДНК и РНК;

6) использование среды с 3 - 4 М хаотропных агентов для выделения двунитевой ДНК;

7) отделение аэросила и связанных с ним НК;

8) промывание аэросила и связанных с ним НК;

9) элюция НК с аэросила;

10) отделение целевого продукта.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1) способ выделения и очистки НК;

2) связывание НК с силикатным сорбентом;

3) связывание НК с силикатным сорбентом проводят в среде хаотропных агентов;

4) отделение силикатного сорбента и связанных с ним НК;

5) промывание силикатного сорбента и связанных с ним НК;

6) элюция НК с силикатного сорбента;

7) отделение целевого продукта;

По сравнению с прототипом отличительными признаками предлагаемого способа являются:

1) использование аэросила в качестве силикатного сорбента;

2) добавление аэросила в содержащую НК жидкость до конечной концентрации 0,3 - 0,6%.

3) использование среды с 0,5 - 2 М хаотропных агентов для выделения однонитевой ДНК и РНК;

4) использование среды с 3 - 4 М хаотропных агентов для выделения двунитевой ДНК.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается объем правовой охраны:

1) способ выделения и очистки НК;

2) связывание НК с аэросилом;

3) связывание НК с аэросилом в среде хаотропных агентов;

4) отделение аэросила и связанных с ним НК;

5) промывание аэросила и связанных с ним НК;

6) элюция НК с аэросила;

7) отделение целевого продукта.

Предлагаемый способ характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:

1) внесение аэросила в содержащую НК жидкость до конечной концентрации 0,3 - 0,6%;

2) использование среду с 0,5 -2 М хаотропных агентов для выделения однонитевой ДНК и РНК;

3) использование среды с 3-4 М хаотропных агентов для выделения двунитевой ДНК.

Известно, что аэросил сорбирует белки и белковые комплексы, преимущественно вирусы, в средах с низким содержанием солей и при pH, близкой к нейтральной. Это свойство аэросила используется для концентрации вирусов (10).

В предлагаемом изобретении авторами впервые предложено использовать аэросил в качестве сорбента для НК. Авторами изобретения экспериментально установлено, что оптимальной конечной концентрацией аэросила, вносимого в пробу, является 0,3 - 0,6%.

Кроме того, в результате проведенных исследований авторами установлено новое свойство аэросила сорбировать при высоких концентрациях хаотропных агентов (3-4 М ГТЦ) только двунитевую ДНК, а при низких концентрациях (0,5-2 М ГТЦ) однонитевую ДНК и РНК, что позволяет эффективно использовать это свойство аэросила для дифференциального разделения и очистки НК, в то время как для всех известных силикатных сорбентов это свойство не продемонстрировано.

Сорбционная емкость известных силикатных сорбентов достигает 0,5 - 2,5 мГ на микролитр сорбента. Максимальная сорбционная емкость определена для силикагеля фирмы Sigma и диатомовой суспензии - 2,5 мГ на микролитр сорбента.

Однако концентрация сорбентов составляет 12-20%, что в 4-7 раз выше, чем концентрация аэросила. Кроме того, процесс приготовления силикагеля очень длителен и сложен (30 часов и несколько отмывок). В то же время сорбционная емкость аэросила по отношению к нуклеиновым кислотам в 10 и более раз выше сорбционной емкости используемых для этих целей известных сорбентов, что значительно ускоряет и удешевляет процедуру выделения и очистки НК.

Фотографии, необходимые для понимания сущности изобретения

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на фотографиях, где на:

фиг. 1 показано влияние концентрации ГТЦ на сорбционные свойства аэросила по отношению к РНК и плазмидной ДНК:

1 - маркер ДНК (pGEM (Promega),

2 - проба для очистки,

3 - проба после сорбции на аэросиле в присутствии 4М ГТЦ,

4 - проба после сорбции на аэросиле в присутствии 3М ГТЦ,

5 - проба после сорбции на аэросиле в присутствии 2М ГТЦ,

6 - проба после сорбции на аэросиле в присутствии 1М ГТЦ;

фиг. 2 - выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей:

1 - маркер ДНК (ДНК фага , , рестрицированная EcoR91 1),

2 - фрагменты ДНК, выделенные из агарозного геля с помощью аэросила;

фиг.3 - выделение однонитевой ДНК:

1 - маркер ДНК (pGEM (Promega),

2 - однонитевая ДНК фага М 13 mp 18;

фиг. 4 - выделение РНК из клеток E.coli и MDVK:

1 - маркер ДНК (ДНК фага , , рестрицированная EcoR91 1),

2 - РНК, выделенная из клеток E.coli,

3 - РНК, выделенная из клеток MDVK;

фиг. 5 - выделение РНК из вируса болезни Ньюкасла:

1 - маркер ДНК (ДНК фага , , рестрицированная EcoR91 1),

2 - РНК вируса болезни Ньюкасла;

фиг. 6 - выделение высокомолекулярной ДНК из клеток MDVK:

1 - маркер ДНК (ДНК фага , рестрицированная EcoR91 1),

2 - ДНК клеток MDVK.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Отдельную колонию клеток E. coli (штамм DHS), трансформированных плазмидой p TZ 19R, переносят в 2 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и, интенсивно перемешивая, инкубируют в течение ночи при 37^oC. 1 мл ночной культуры переносят в 200 мл среды LB с ампициллином и инкубируют в течение 12-16 часов при 37^oC. После этого культуру охлаждают во льду, клетки осаждают центрифугированием при 400 g в течение 10 минут и ресуспендируют в 8 мл раствора 1 (50 мМ Трис-HCl; pH 8,0; 10 мМ ЭДТА, 20 мкг/мл PНазы А). К суспензии добавляют 16 мл свежеприготовленного лизирующего раствора II (0,2н. NaOH, 1% SDS), перемешивают переворачиванием и инкубируют во льду в течение 15-20 минут. Затем добавляют 12 мл охлажденного во льду раствора III (3 М ацетат калия), перемешивают переворачиванием и инкубируют во льду 10 минут. Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 20000 g в течение 20 минут при 4^oC, переносят в чистый центрифужный стакан, добавляют 0,6 объема (21,6 мл) изопропанола и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, отобрав перед этим аликвоты по 1 мл (для контроля). Плазмидную ДНК осаждают центрифугированием в течение 20 минут при 20000g. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок растворяют в 1 мл 0,1 М раствора Трис-HCl, pH 7,4 содержащего 4М гуанидин тиоцианата (ГТЦ). Затем производят очистку ДНК-содержащей жидкости путем внесения в нее аэросила до конечной концентрации 0,3 - 0,6%. Суспензию аэросила готовят ресуспендированием 0,5 г аэросила в 15 мл 0,1 М раствора Трис-HCl, pH 7,4 содержащего 4 М ГТЦ.

Оптимальное количество вносимого в раствор ДНК аэросила определяют добавлением 5, 10, 15 и 20 мкл суспензии аэросила к 50 мкл раствора плазмидной ДНК в 4 М ГТЦ. После инкубации в течение 1-2 минут аэросил осаждают центрифугированием на микроцентрифуге в течение 1-2 минут, осадок дважды промывают 80%-ным изопропанолом (этанолом): ресуспендируют в 800 мкл 80%-го изопропанола (этанола) и осаждают центрифугированием. После инкубации в течение 5-10 минут при 37^oC плазмидную ДНК элюируют водой (100 мкл). Содержание НК в пробе определяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и спектрофотометрически.

Эффективность очистки плазмидной ДНК и РНК показана на фиг. 1. Видно, что аэросил одинаково эффективно выделяет и кольцевые, и суперскрученные формы ДНК. Следует отметить также, что РНК выявляется в пробах и для ее удаления необходимо ввести промывки сорбента 4 М ГТЦ сразу после сорбции. Из данных спектрофотометрического определения количества адсорбированной ДНК следует, что 1 мкл аэросила адсорбирует 3-3,5 мкг ДНК и в этом проявляются его уникальные по сравнению с другими сорбентами свойства.

Для определения концентрации ГТЦ, при которой происходит эффективная сорбция аэросилом ДНК, к пробе ДНК (50 мкл), растворенной в 1, 2, 3 и 4 М растворах ГТЦ в 0,1 М Трис-HCl, pH 7,4, добавляют 15 мкл суспензии аэросила и выделяют ДНК, как описано выше. Адсорбция ДНК наиболее эффективно происходит в 4 М растворах ГТЦ (фиг. 1).

Очищенные препараты плазмидной ДНК обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Bam H1, Hind III и EcoR I по известным методикам (Fermentas, Вильнюс). Для анализа берут 10 мкл пробы, объем рестрикционной смеси - 40 мкл. После рестрикции 8 мкл отбирают для контроля (хранят при температуре - 70^oC), из 10 мкл ДНК выделяют с помощью ГТЦ (добавляют 10 мкл 4 М ГТЦ и 5 мкл аэросила, промывка и элюция (40 мкл воды), как описано выше, а в оставшейся части рестрикционной смеси эндонуклеазы рестрикции(Hind III и Eco RI) инактивируют прогревом при 65^oC в течение 20 минут. Аликвоты плазмидной ДНК (2 мкл после термоинактивации и 7 мкл после очистки аэросилом) лигируют при 37^oC в течение 1 часа, используя 2 единицы ДНК-лигазы фага Т4 (Биопол, Москва). После лигирования весь объем лигазной смеси используют для анализа электрофорезом в агарозном геле.

Полученные препараты ДНК используют также в опытах по секвенированию методом Сэнгера с помощью набора Taq-Nrack фирмы Promega.

Пример 2. Выделение и очистка фрагментов ДНК из агарозных гелей.

Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей проводят после разделения рестрицированной Eco 911 ДНК фага лямбда в 1%-ной легкоплавкой агарозе (Sigma) в буфере ТБЕ. Зоны, содержащие нужные фрагменты, вырезают, помещают в микроцентрифужные пробирки (1,5 мл), вносят в них 10-кратный объем 4 М раствора ГТЦ в 0,1 М Трис-HCl, pH 7,4 и 100 мкл суспензии аэросила в 0,3% концентрации. Суспензию аэросила готовят так, как описано в примере 1. Смесь инкубируют при комнатной температуре до полного растворения геля (5-10 минут), периодически перемешивая суспензию. После инкубации в течение 5 минут и периодического перемешивания аэросил осаждают центрифугированием в течение 2-3 минут. Аэросил дважды промывают ресуспендированием и осаждением центрифугированием сначала в 1 мл 1 М ГТЦ, а затем дважды в 1 мл 80%-ного изопропанола. Осадок аэросила сушат при 37^oC в течение 30 минут. ДНК элюируют 100 мл воды (буфера ТЕ). Результаты выделения фрагментов ДНК из агарозных гелей приведены на фиг. 2.

Пример 3. Выделение и очистка однонитевой ДНК и высокомолекулярной РНК.

При низких концентрациях ГТЦ не происходит полной денатурации белков, что не позволяет полностью разрушить комплекс НК-белки. Это приводит, во-первых, к загрязнению получаемых препаратов НК белками и, во-вторых, к низкому выходу НК при десорбции. В связи с этим для выделения РНК и однонитевой ДНК проводят сначала полное разрушение комплекса белки - НК путем прогрева пробы при 70^oC в присутствии 4М ГТЦ с последующим ее охлаждением до комнатной температуры и добавлением равного объема изопропанола. К 50 мкл пробы добавляют 400 мкл 4М ГТЦ, перемешивают и инкубируют при 70^oC в течение 5 минут. После инкубации пробу охлаждают до комнатной температуры и к ней добавляют 450 мкл изопропанола и 100 мкл суспензии аэросила. Аэросил готовят и используют так, как описано в примере 1. После инкубации в течение 5 минут и периодического перемешивания аэросил осаждают центрифугированием в течение 2-3 минут. Аэросил дважды промывают ресуспендированием и осаждением центрифугированием сначала в 1 мл 1М ГТЦ, а затем дважды в 1 мл 80%-ного изопропанола. Осадок аэросила сушат при 37^oC в течение 30 минут. НК элюируют 100 мл воды (буфера ТЕ).

Результаты выделения высокомолекулярной РНК и однонитевой ДНК представлены на фиг. 3, 4 и 5. При этом в качестве проб использованы суспензии клеток E.coli, MDVK и очищенные препараты вируса болезни Ньюкасла.

Пример 4. Выделение и очистка высокомолекулярной ДНК.

Выделение и очистку высокомолекулярной ДНК клеток MDVK осуществляют следующим образом. К 50 мкл суспензии клеток добавляют 450 мл 4М ГТЦ, инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре, добавляют 50 мкл суспензии аэросила, которую готовят так, как описано в примере 1. Смесь инкубируют 5 минут, периодически помешивая. Аэросил осаждают центрифугированием в течение 2-3 минут, дважды промывают ресуспендированием и осаждением центрифугированием сначала в 1 мл 4М ГТЦ, а затем дважды в 1 мл 80% изопропанола. Осадок сушат при 37^oC в течение 20-30 минут. ДНК элюируют 100 мкл воды (буфера ТЕ). Результаты выделения высокомолекулярной ДНК представлены на фиг. 6.

Таким образом, авторами предложен способ выделения и очистки НК, использование которого обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества:

1) ускорение процесса;

2) упрощение процесса;

3) удешевление процесса;

4) селективное выделение двунитевой ДНК и однонитевой ДНК или РНК;

Предлагаемый способ найдет применение для выделения плазмидной ДНК, однонитевой ДНК, хромосомальной ДНК и фрагментов ДНК из гелей и РНК.

Источники информации.

1. Willis Е.Н., Mardis E.R., Jones W.L., Little M.C. Prep-A-Gene: A superior matrix for the purification of DNA and DNA Fragments.- Biotechniques. - 1990, 9, 1, 92-99 (прототип).

2. Остерман Л.А. Хроматография белков и НК. М., Наука, 1985 г.

3. Kristensen Т. , Voss Н., Ansorge W. Nucleic Acids. Res.- 1987, 15, 5507 - 5516.

4. Marko M.A., Chipperfield R., Birnboim H.C. Anal. Biochem., 1982, 121, 382-387.

5. Vodelskin В. , Gellerspic D. Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1976, 76, 615-619.

6. Mezei L. Promega, Notes, 1991, 34, 1.

7. Пат. США N 5342 931; МПК⁵ C 12 P 19/34; C 12 Q 1/68; C 07 H 21/00, 21/04; НКИ 536-25.4; Способ очистки ДНК на гидратированном диоксиде кремния.

8. ГОСТ 14922-69.

9. Золотарева Л.Н., Кухарев Д.И., Якубовская Е.П. Пути снижения себестоимости аэросила.- Сб. "Технология синтетических минеральных наполнителей, адсорбентов и коагулянтов". - Ленинград, НИОХИМ, изд. "Химия", Ленинградское отделение, 1970, 21, 115-120.

10. Временная инструкция по изготовлению и контролю моновалентной вакцины для ранней защиты животных против ящура типа A, типа O, типа C и типа Азия-1 из лапинизированного вируса. Утверждена ГУВ Госагропрома СССР 16.02.89г.

11. Авт. свид. СССР N 861399, МПК³ C 12 N 1/08. Способ получения ДНК из биомассы E.coli.

12. Авт.свид. СССР N 1532050, МПК⁴ A 61 K 39/00, 39/12; C 12 N 7/00.

13. Заявка ЕПВ 0376080, МПК⁵ C 12 N 15/10, C 12 P 19/34. Способ выделения и очистки ДНК.

14. Заявка ЕПВ 0388171, МПК⁵ C 12 Q 1/68. Способ очистки, амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты.

15. Заявка ЕПВ 0391608, МПК⁵ C 12 Q 1/68. Металлоидные носители для НК.

16. Заявка ЕПВ 0402997, МПК⁵ C 12 Q 1/68; G 01 N 33/569, 33/576. Способ определения НК.

17. Пат. США N 4794075, C 12 Q 1/68, G 01 N 33/48; НКИ 435-5.

Способ локализации и очистки ДНК, содержащей некорректное спаривание одного основания.

18. Пат. США N 5204246, МПК⁵ C 12 N 1/08, 1/06, C 12 P 19/34; НКИ 435-270. Способ выделения ДНК.

19. Заявка РСТ 90/14431; МКИ⁵ C 12 P 21/00, C 12 N 15/00; C 07 K 3/18, 13/00.

Фузионные белки, имеющие сайт пост-трансляционной модификации и способ их получения и очистки.

20. Заявка РСТ 90/02179, МКИ⁴ C 12 N 15/00, C 12 P 19/34, C 12 Q 1/68.

Способ выделения ДНК.

21. Заявка РСТ 90/04650, МПК⁵ C 12 Q 1/68.

Способ очистки ковалентно-связанных ДНК-белковых комплексов.

22. Заявка РСТ 91/00924, МПК⁵ C 12 Q 1/68, C 12 N 15/10, C 07 H 21/04.

Способ и устройство для выделения ДНК из образцов.

23. Заявка Японии N 2-92284, МПК⁵ C 12 N 15/10, C 07 H 21/04; G 01 N 27/447, 33/50.

Способ выделения фрагмента ДНК.