способ консервирования ксеногенных клеток печени

Формула изобретения

1. Способ консервирования ксеногенных клеток печени, включающий забор печени свиней, перфузию раствором Хенкса, освобождение печени от капсулы, диспергирование печени путем механического измельчения, двухстадийной фильтрации, промывки и центрифугирования, стабилизацию ее в среде 199, замораживание с последующей сублимационной сушкой, отличающийся тем, что используют печень 2-5 месячных свиней, перед диспергированием проводят разделение ее на доли, для стабилизации используют дополнительно раствор Хенкса в соотношении со средой 199 1:100, а сушку проводят на поддонах толщиной слоя 40-50 мм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что первую стадию фильтрации осуществляют через фильтр 100-120 мкм, а вторую стадию - через 60 мкм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что замораживание осуществляют при температуре минус 30-35^oC, а досушивание - при температуре плюс 20^oC.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделению и сохранности культуры клеток.

Создание биологических препаратов на основе функционально активных клеток является одним из самых сложных направлений биотехнологии. Стабильность биологических свойств изолированных клеток, например таких, как функциональная активность, предъявляют особые требования к биотехнологии промышленного производства препаратов и определяют их эффективность. Отсутствие заметных успехов в культивировании гепатоцитов на искусственных питательных средах привело к созданию способа выделения изолированных гепатоцитов из донорской печени, а также разработке путей и методов для возможно более длительного поддержания их функциональной активности с целью использования их при лечении синдрома печеночной недостаточности различной этиологии. Применение клеточной терапии требует наличия действующего банка гепатоцитов с сохранением их функциональной активности.

Известный способ консервирования выделенных клеток печени в жидком азоте при минус 196^oС предъявляет особые требования к наличию соответствующего оборудования, больших производственных площадей, требует больших энергетических затрат. Данный способ не предусматривает транспортирование выделенных клеток для клинического использования в другие медицинские заведения, в связи с непродолжительным сроком их сохранности и функциональной активности вне дюара с жидким азотом. (Онищенко Н.А. 1994, Суббота Н.П., 1992).

Известен также способ консервирования интактных клеток печени, где предусмотрена ферментативная обработка донорского органа, расфасовка полученных клеток в стеклянные ампулы объемом 2 см³ со средой 199 и замораживанием при минус 50 ^o С в течение 3-4 ч под вакуумом 50-100 мм рт.ст. с сублимацией при минус 30 - минус 20^oС и температурой досушивания 25^oС. (Гладских Л.В. и др. Патент N 2073435, 20.02.97). Этот способ позволяет сохранять функциональную активность клеток в течение 12 мес. Однако он требует дорогостоящих ферментных препаратов для выделения клеток, больших объемов растворов Хенкса для их отмывки, имеет лекарственную форму и дозировку, непригодную для перорального применения в клинической практике.

Задачей изобретения является повышение жизнеспособности и активности ксеногенных клеток печени при упрощении и удешевлении способа, а также возможность для перорального применения в клинической практике и для производства лекарственных форм.

Это достигается тем, что способ включает забор печени, перфузию раствором Хенкса, освобождение от капсулы, диспергирование печени, стабилизацию ее в среде 199, замораживание с последующей сублимационной сушкой. Согласно изобретению, отбирают печень клинически здоровых свиней в возрасте 2-5 мес, проводят разделение ее на доли, проводят перфузию соленым раствором Хенкса, который по своему составу и соотношению ионов соответствует межклеточной жидкости, освобождают от глиссоновой капсулы, печень механически разрушают, фильтруют, полученный осадок промывают солевым раствором, обогащают питательной средой 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, сушат на поддонах толщиной слоя 40-50 мм. Целесообразно фильтрацию проводить через фильтр 100-120 мкм, затем через фильтр 40-60 мкм, а замораживание осуществлять при температуре минус 30-35^oС в течение 3-4 ч, с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25-30^oС в течение 36-48 ч и досушиванием при 20-25^oС.

Для обоснования данного способа были проведены экспериментальные исследования.

Для выделения изолированных ксеногенных гепатоцитов используют свиную печень, полученную от клинически здоровых животных. Ксеногенные гепатоциты имеют преимущества по сравнению с аллогенными: доступность биологического материала, уменьшение срока тепловой ишемии донорского органа, исключение инфицирования вирусными гепатитами, ВИЧ-инфекцией. Установлены возрастные пределы для животных-доноров: нижний - два месяца в связи с тем, что дефинитивные отношения в печени окончательно завершаются к этому возрасту, верхний - пять месяцев, так как у животных старше этого возраста по результатам ветеринарно-санитарной экспертизы в 65% выявляются дистрофические изменения в печени. В связи с тем, что масса печени часто превышает 1,1 кг и имеет более развитую соединительно-тканную строму, обладает большей теплоемкостью, проводят ее разделение на доли. Затем раствором Хенкса проводят перфузию до соломенно-желтого цвета печени и удаляют глиссоновую капсулу. Механически разрушают ткань печени до получения гомогенной суспензии, которую фильтруют дважды через фильтры: 100-120 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 40-60 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 35^oС в течение 3-4 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25^oС в течение 36-48 ч с температурой досушивания 20-25^oС. Полученный препарат после измельчения и просеивания передают на фасовку. Препарат высушенных клеток печени, полученный по данному способу, оценивали по функциональной активности, которая определялась методом К. Бакирджиева, основанным на изменении скорости бродильной реакции дрожжей. При анализе результатов испытаний установили, что активность высушенных клеток выше в четыре раза по сравнению с контрольной пробой, которая сохраняется в течение 18 мес (см. таблицу).

Пример 1. Отбирают печень от клинически здорового животного трехмесячного возраста массой 900 г. Отделяют желчный пузырь и разделяют печень на доли. Затем через систему кровеносных сосудов проводят перфузию раствором Хенкса до соломенно-желтого цвета печени. Для уменьшения срока перфузии печень подвергают массированию. Затем удаляют глиссоновую капсулу с помощью металлического гребня и измельчают до получения гомогенной суспензии. Фильтрование проводят через фильтр 100 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 60 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 35^oС в течение 3 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 30^oС в течение 36 ч с температурой досушивания 20^oС. Функциональная активность высушенных клеток составляет 420%.

Пример 2. Отбирают печень от клинически здорового животного четырехмесячного возраста массой 1100 г. Отделяют желчный пузырь и разделяют печень на доли. Затем через систему кровеносных сосудов проводят перфузию раствором Хенкса до соломенножелтого цвета печени. Для уменьшения срока перфузии печень подвергают массированию. Затем удаляют глиссоновую капсулу с помощью металлического гребня и измельчают до получения гомогенной суспензии. Фильтрование проводят через фильтр 120 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 40 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 30^oС в течение 4 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25^oС в течение 48 ч с температурой досушивания 20^oС. Функциональная активность высушенных клеток составляет 400%.

Пример 3. Отбирают печень от клинически здорового животного двухмесячного возраста массой 750 г. Отделяют желчный пузырь и разделяют печень на доли. Затем через систему кровеносных сосудов проводят перфузию раствором Хенкса до соломенножелтого цвета печени. Для уменьшения срока перфузии печень подвергают массированию. Затем удаляют глиссоновую капсулу с помощью металлического гребня и измельчают до получения гомогенной суспензии. Фильтрование проводят через фильтр 100 мкм из нержавеющей стали для первой фильтрации и 60 мкм из капрона - для второй. Осадок промывают раствором Хенкса и центрифугируют, затем к осадку добавляют питательную среду 199 на растворе Хенкса в соотношении 10:1, разливают на поддон толщиной 50 мм и замораживают при температуре минус 35^oС в течение 3 ч с последующей сублимационной сушкой при температуре минус 25^oС в течение 36 ч с температурой досушивания 25^oС. Функциональная активность высушенных клеток составляет 410%.

Таким образом, как видно из таблицы, предлагаемый способ наиболее экономичен и эффективен по сравнению с прототипом.