штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки пк-91 для репродукции парвовирусов плотоядных
Классы МПК: | C12N5/06 клетки или ткани животных |
Автор(ы): | Дурыманов Александр Гаврилович, Шестопалов Александр Михайлович |
Патентообладатель(и): | Дурыманов Александр Гаврилович, Шестопалов Александр Михайлович |
Приоритеты: |
подача заявки:
1994-12-19 публикация патента:
10.11.1998 |
Использование: общая и прикладная вирусология. Сущность изобретения: для культивирования клеток с целью репродукции парвовирусов плотоядных, получен штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91, который прошел 180 пассажей, стабилен и выращивается в монослое в стационарных условиях или во вращающихся флаконах с использованием ростовой среды Игла МЕМ с 4,5% сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы. Штамм клеток ПК-91 депонирован в коллекции ВИЭВ под 49, обеспечивает выход парвовирусного энтерита норок при титровании по РГА от 1:4096 до 1:32768 и парвовируса собак при титровании по РГА 1:256.
Формула изобретения
Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91, ВНИИЭВ 49 для репродукции парвовирусов плотоядных.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области общей и прикладной вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей для наработки и изучения вирусов, а также с целью производства противовирусных вакцин. Известна первичная культура клеток из почки кошки для репродукции парвовирусов плотоядных с целью производства вакцин против парвовирусного энтерита норок на биофабриках России. Данная культура клеток обладает достаточной чувствительностью к парвовирусам плотоядных, обеспечивает выход вируса энтерита плотоядных в титрах реакции гемагглютинации от 1:64 до 1:256, а в отдельных случаях 1:512 - 1:1024. Однако первичная культура клеток почки кошки при ее использовании для репродукции вирусов имеет ряд недостатков: низкий титр получаемого вируса; необходимость в значительном количестве материала для трипсинизации (постоянный поиск кошек определенного возраста) с целью получения нужных клеток; постоянный контроль на чувствительность и качество получаемых клеток вследствие нестандартности используемого материала; многостадийность процесса получения вируса (трипсинизация, центрифугирование, посев клеток на монослой, инфицирование монослоя, смена среды и т.д.); большой процент брака по стерильности вследствие многостадийности указанной технологии получения вируса; использование в технологии культивирования сыворотки крупного рогатого скота требует проверки этой сыворотки на антивирусную активность. Перевиваемые культуры клеток выгодно отличаются от первичных культур возможностью работать в стандартных условиях, иметь эталонные производственные заморозки культур клеток, иметь стабильные параметры роста культуры клеток и, как следствие, стабильные результаты при наработке и выделении вируса с более высоким титром. Известны две перевиваемые клеточные культуры, полученные из почек кошки C81 и F81 для производства вакцин против парвовирусного энтерита норок, в частности для профилактики парвовирусных энтеритов у редких животных (куниц, лисиц, военно-полицейских собак, персидских кошек, тигров, енотов ("Чжунго Кэсюз - Наука Китая". - 1990, с. 399-408). Для культивирования вирусов на указанных культурах клеток используется ростовая среда Игла МЕМ с 10%-ной телячьей сывороткой. Поддерживающая среда содержит (1-4)% телячьей сыворотки. Выход вируса в среднем составляет в реакции гемагглютинации 1:64 - 1: 8192. На клетках успешно культивировались следующие вирусы: парвовирусный энтерит норок (MEV), панлейкемия кошек (FPLV) и собачий парвовирус (CPV). Недостатком данной перевиваемой клеточной культуры является высокая стоимость компонентов питательной среды, в частности телечьей сыворотки, а также недостаточно высокие средние титры получаемых вирусов. Наиболее близким техническим решением (прототипом) является перевиваемая культура клеток почки кошки CRFK (Crandell Feline Kidney cell Line), полученная в США и используемая для производства вакцин против парвовирусного энтерита норок (United Vaccines. U.S. Vet. Lic., N 245. - 1990. - p.p. 2-7). Для культивирования вируса используется ростовая и поддерживающая среда Игла MEM с (4-10)%-ной бычьей сывороткой. Культура клеток CRFK обеспечивает выход вируса в титрах реакции гемагглютинации от 1:128 до 1:1024. Недостатком перевиваемой культуры клеток почки кошки CRFK является недостаточный выход вируса (низкий титр) вследствие ограниченных возможностей указанной культуры клеток и используемой технологии культивирования, кроме того, применение бычьей сыворотки требует проверки на антивирусную активность, а использование Hepes буфера в поддерживающей среде приводит к удорожанию технологии получения вируса. Задачей предлагаемого технического решения является создание нового стабильного отечественного штамма перевиваемой культуры клеток почки кошки, культивируемого на доступных питательных средах и обеспечивающего репродукцию парвовирусов плотоядных в высоких титрах (для MEV - штаммы "Родники", "Береговой" от 1:4096 до 1:32768 в реакции гемагглютинации, а для CPV - 1: 256). Поставленная задача решается тем, что получен новый штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91 (FK-91 Feline Kidney). Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) под номером 49. Штамм перевиваемой культуры клеток почки кошки ПК-91 получают из кортикальной части почек домашней кошки (4-5 месячного возраста). После первичной 3-кратной трипсинизации и общего сбора клеток по общепринятой методике получения первичных культур клеток (В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. Ветеринарная вирусология. - М. : Колос, 1984, с. 372) в количестве 7
1. Видовая принадлежность. Анализ проведен на метафазных хромосомах, окрашенных по G-методу. Кариограммы хромосом составлены в соответствии с номенклатурой, предложенной Варстер-Хилл и Грей (Wurster-Hill, Gray, Cytogenet. Cell Genet. 12, 377-397, 1973). Установлено: кариотип соответствует виду - Felis catus. 2. Плоидность кариотипа. Проанализировано 1000 клеток на препаратах, приготовленных без выжигания фиксатора на стекле и окрашенных азуром-зозином. Полиплоидные клетки (число хромосом больше 100) составляет 2%. 3. Распределение клеток по числу хромосом. Проанализировано 100 клеток на препаратах, приготовленных без выжигания фиксатора на стекле и окрашенных азуром-эозином. Микрофотография метафазной пластинки клеток штамма ПК-91. 2n-38; модальный класс - 64 хромосомы

4. Наличие маркерных хромосом. Имеется 3 маркерных хромосомы: M1 - B3p+; M2 - C2p+; M3 - i(D1q). Стандартные условия выращивания. Для выращивания культуры клеток ПК-91 используют ростовую среду Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ и 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы. В качестве антибиотиков используют пенициллин - 100 ед/мл и стрептомицин - 0,1 мг/мл. Температура выращивания: (36,5+0,5)oC. Культуральные свойства. Клетки ПК-91 культивируют в монослое (в стационарных условиях или во вращающихся флаконах). Посевная доза составляет 40-80 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева: 1:4 - 1:8. Клетки пассируют с частотой 3-4 суток. Для снятия клеток с монослоя используют 0,02% раствор версена (9/10) и 0,125% раствор трипсина (1/10). Способ криоконсервации. Для криоконсервации клеток используется среда: Игла MEM - 60%, сыворотка эмбриональная плодов коровы - 30%, глицерин - 10% или ДМСО - 7,5%. Режим замораживания клеток осуществляют путем понижения температуры на 1oC в минуту до -40oC с последующим их помещением в жидкий азот. Для длительного хранения клеток в жидком азоте при температуре 196oC используют криопробирки или криоконтейнеры. Режим оттаивания. Ампулу (контейнер) помещают в воду, подогретую до 37oC, при постоянном перемешивании. После оттаивания содержимого ампулы ее вскрывают в стерильных условиях. Содержимое ампулы помещают в центрифужный стакан, добавляют ростовой среды 5 частей, центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость выливают, осадок ресуспендируют в ростовой среде до посадочной концентрации и высевают на матрас (роллер) и помещают в термостат с температурой (36,5+0,5)oC до образования монослоя. Перед высевом на матрас берут пробу (0,5 мл) и смешивают 1:1 с 0,2% раствором трипанового синего. Подсчет % жизнеспособных клеток ведут в камере Горяева


где
N - общее количество клеток;
n - количество живых клеток;
m - количество мертвых клеток. Характеристика вируспродукции. Культура клеток ПК-91 обеспечивает выход парвовирусного энтерита норок при титровании по реакции гемагглютинации (РГА) от 1:4096 до 1:32768, а собачьего парвовируса - 1:256. Штамм сохраняет свои свойства по вируспродукции до 180 пассажа (время наблюдения). Тенденции к снижению вируспродукции нет. Пример 1. Подготовка культуры клеток ПК-91 для репродукции парвовирусов плотоядных. Чистую культуру клеток ПК-91, хранящуюся в виде производственных заморозок в жидком азоте, оттаивают, добавляют ростовой среды Игла MEM с 4,5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ, 0,5% эмбриональной сыворотки плодов коровы, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 0,1 мг/мл. Смесь центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость выливают, осадок ресуспендируют в ростовой среде до посадочной концентрации. Культуру клеток ПК-91 (FK-91) выращивают на 1,5 литровых матрасах. Посадочная концентрация клеток 0,04




Класс C12N5/06 клетки или ткани животных