комплексная соль гематопорфирина и его производных, смесь комплексных солей гематопорфирина и его производных, способ получения комплексных солей, способ получения смеси комплексных солей, фармацевтическая композиция

Формула изобретения

1. Комплексная соль гематопорфирина и его производных, имеющая общую формулу I



в которой R¹ и R² одинаковые или разные и обозначают группу -CH=CH₂, группу -CH(OH)CH₃, группу -CH(OR³)CH₃, где R³ обозначает группу, образующую олигомер, содержащий связи эфирные и/или сложноэфирные, составленную из 1 до 5 одинаковых или разных единиц, происходящих от мономера с формулой 2, или R¹ и R² одинаковые и обозначают группу -CH(R⁴) - CH₃, где R⁴ обозначает группу карбоксиметиламиновую, 1-карбоксиэтиламиновую, 1-карбокси-3-карбамоил-пропиламиновую, 1-карбокси-2-фенил-этиламиновую, 1-карбокси-2-метил-пропиламиновую, 1-карбокси-3-метил-бутиламиновую, 1-карбокси-2-метил-бутиламиновую, 1-карбокси-бутиламиновую, 1-карбокси-пентиламиновую, 1-карбокси-2-гидрокси-этиламиновую, 1-карбокси-2-гидрокси-пропилоаминовую, 1-карбокси-2-меркапто-этиламиновую, 1-карбокси-3-метилотио-пропилоаминовую, 1,2-дикарбокси-этиламиновую, 1-карбокси-2-карбомоил-этиламиновую, 1,3-дикарбокси-пропилоаминовую, 1-карбокси-2/4-гидрокси фенил/-этиламиновую, 1-карбокси-2-индолил-этиламиновую, 2-карбокси-пиролидиновую, 2-карбокси-4-гидроксипиролидиновую, 1-карбокси-5-амино-пентиламиновую, 1-карбокси-4-гуанидилобутиламиновую, 1-карбокси-4-гидрокси-5-аминопентиламиновую или группу 1-карбокси-2-/1Н-имидазол/-этиламиновую;

A обозначает аминокислоту основную;

m = 2 - 4;

n = 1 - 5.

2. Соль по п. 1, отличающаяся тем, что A обозначает аргинин, лизин, гистидин или гидроксилизин.

3. Соль по п.1, отличающаяся тем, что R₁ и R₂ одинаковые и обозначают группу -CH(R⁴)CH₃.

4. Соль по пп.1 - 3, отличающаяся тем, что m = 2; n = 1.

5. Смесь комплексных солей гематопорфирина и его производных, содержащая соли гематопорфирина, протопорфирина, винилдейтеропорфирина и дигематопорфиринового эфира с основной аминокислотой.

6. Способ получения комплексных солей гематопорфирина и его производных общей формулы I, в которой R¹ и R² такие же самые или разные и обозначают группу -CH= CH₂, группу -CH/OH/CH₃, группу -CH/OR³/CH₃, где R³ обозначает группу, образующую олигомер, содержащий связи эфирные и/или сложно-эфирные, составленную из 1 до 5 одинаковых или разных единиц, происходящих от мономеров по формуле II



или R¹ и R² одинаковые и обозначают группу -CH/R⁴/ - CH₃, где R⁴ обозначает группу карбокси-метиламиновую, 1-карбокси-этиламиновую, 1-карбокси-2-метилпропилоаминовую, 1-карбокси-3-метил-бутиламиновую, 1-карбокси-2-метил-бутиламиновую, 1-карбокси-бутиламиновую, 1-карбокси-пентиламиновую, 1-карбокси-2-гидрокси-этиламиновую, 1-карбокси-2-гидрокси-пропилоаминовую, 1-карбокси-2-меркапто-этиламиновую, 1-карбокси-3-метилотио-пропилоаминовую, 1,2-дикарбокси-этиламиновую, 1-карбокси-2-карбамоилэтиламиновую, 1,3-дикарбокси-пропилоаминовую, 1-карбокси-3-карбамоил-пропилоаминовую, 1-карбокси-2-фенил-этиламиновую, 1-карбокси-2/4-гидроксифенил/-этиламиновую, 1-карбокси-2-индолил-этиламиновую, 2-карбокси-пиролидиновую, 2-карбокси-4-гидроксипирилидиновую, 1-карбокси-5-амино-пентиламиновую, 1-карбокси-4-гуанидил-бутиламиновую, 1-карбокси-4-гидрокси-5-амино-пентиламиновую группу или группу 1-карбокси-2/1Н-имидазол/-этиламиновую;

A обозначает основную аминокислоту;

m = 2 - 4;

n = 1 - 5,

отличающийся тем, что гематопорфириновую производную с общей формулой IV



в которой R¹ и R² имеют выше указанное значение, с тем, что если R¹ и R² обозначают группу -CH/R⁴/-CH₃, то карбоксильные группы заместителя R⁴ могут быть свободны или защищены,

подвергают взаимодействию с основной аминокислотой со свободными или защищенными карбоксильными группами или с ее монохлоргидридом или устраняют группы, обеспечивающие карбоксильные функции и выделяют продукт, являющийся солью по формуле I.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что реакцию проводят в органическом растворителе, в смеси органических растворителей или в среде, содержащей органический растворитель и воду или содержащей смесь органических растворителей и воду.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что в виде аминокислоты применяются аргинин, лизин, гистидин или гидроксилизин.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что соль выделяют, добавляют в реакционную массу низкополярный растворитель или смесь растворителей, образующих гомогенный раствор с растворителем, применяемым в реакции.

10. Способ получения смеси комплексных солей, отличающийся тем, что смесь, содержащую гематопорфирин, протопорфирин, винилдейтеропорфирин и дигематопорфириновый эфир, подвергают взаимодействию с основной аминокислотой.

11. Фармкомпозиция для диагностики и/или лечения новообразований, включающий действующее средство на основе гематопорфирина и носитель, отличающаяся тем, что в качестве действующего средства она содержит соединение по п.1 общей формулы I (где R¹, R², A, m, n имеют указанные выше для п.1 значения), в эффективном количестве.

12. Фармкомпозиция для диагностики и/или лечения новообразований по п. 11, отличающаяся тем, что в качестве действующего средства она содержит смесь солей гематопорфирина, протопорфирина, винилдейтеропорфирина и дигематопорфиринового эфира с основной аминокислотой в эффективном количестве.

Описание изобретения к патенту

Комплексная соль гематопорфирина и его производных, смесь комплексных солей гематопорфирина и его производных, способ получения комплексных солей, способ получения смеси комплексных солей, фармацевтическая композиция.

Предмет изобретения - это комплексные соли гематопорфирина и его производных, способ их производства и фармацевтическое средство. Новые соли гематопорфирина и его производных предназначены для обнаруживания и лечения новообразований.

Уже более десяти лет как гематопорфирин и его производные (HpD) применяют как фотосенсибилизаторы для обнаружения и уничтожения новообразований в организмах людей и животных. Соединения эти подаются во внутривенной инъекции и они переносятся активным транспортом к разным органам тела. В здоровой ткани находятся они относительно короткий период, так как они метаболизируются и выделяются, зато в ткани новообразования они аккумулируются и на почти неизменном уровне остаются на протяжении нескольких суток. Это было использовано в фотодинамическом методе диагноза и селективного уничтожения ткани новообразования. Так как все производные гематопорфирина трудно растворимые в воде, способ приготовления их водяных растворов был до сих пор весьма тяжелый.

B Cancer Research том 44, стр. 1924, 1984 г.(см. то же том 45, стр. 635, 1985 г.) описан метод получения гематопорфириновых препаратов для инъекций. Он состоит в том, что производные гематопорфирина растворяют в растворе NaOH, смешивают один час и после того нейтрализируют до pH около 7,1 и титрованием 0,1 N HCl. Метод этот весьма неудобный, так как в случае небольшого перехода pH ниже 7 имеет место выпадение осадка. Конечный раствор приготавливают, добавляя соответственное количество физиологической соли. Раствор стерилизуют и хранят в закрытых ампулах. Такие препараты в виде водяных растворов неустойчивые ввиду большой тенденции всех производных гематопорфирина к агрегации. Как подано в вышеупомянутой публикации, изготовленные растворы сохраняют свою стабильность в течениe около 3-х месяцев при условии, что их хранят в темном и холодном месте (при температуре -20^oC).

Предметом изобретения являются новые, растворимые в воде комплексные соли гематопорфирина и его производных, которые в зависимости от концентрации дают pH от 7,2 до 7,8, что дает возможность быстро изготовить раствор хорошо растворимый в воде или в физиологической соли и получить лучшую биодоступность лечебного средства. Неожиданно оказалось, что новые комплексные соли проявляют большую терапевтическую активность, чем, например, известные натриевые соли гематопорфирина и его производных (HpD Na₂). Кроме того, новые соли задерживают без облучения развитие клеток новообразований, что было подтверждено в исследованиях на клеточных линиях. Согласно изобретению соли гематопорфирина и его производных имеют общую формулу I (фиг. 1), в которой R¹ и R² такие же самые или разные и обозначают группу -CH=CH₂, группу -CH(OH)CH₃, группу -CH(OR³)CH₃, где R³ обозначает группу создающую олигомер, содержащий связь эфирную и/или сложноэфирную, составленную из 1 до 5 одинаковых или разных единиц, происходящих от мономера по формуле II (фиг. 2), или R¹ и R² одинаковые и обозначают группу -CH(R⁴)-CH₃, где R⁴ обозначает группу карбоксиметиламиновую, 1-карбоксилэтиламиновую, 1-карбокси-2-метилпропиламиновую, 1-карбокси-3-метил-бутиламиновую, 1-карбокси-2-метил-бутиламиновую, 1-карбоксибутиламиновую, 1-карбоксипентиламиновую, 1-карбокси-2-гидроксиэтиламиновую, 1-карбокси-2-гидрокси-пропиламиновую, 1-карбокси-2-меркапто-этиламиновую, 1-карбокси-3-метилотиопропилоаминовую, 1,2-дикарбоксиэтиламиновую, 1-карбокси-2-карбамоилэтиламиновую, 1,3-дикарбоксипропиламиновую, 1-карбокси-3-карбамоилпропиламиновую, 1-карбокси-2-фенил-этиламиновую, 1-карбокси-2-(4-гидроксилфенил)-этиламиновую, 1-карбокси-2-индолилэтиламиновую, 2-карбоксипиролидиновую, 2-карбокси-4-гидроксипиролидиновую, 1-карбокси-5-амино-пентиламиновую, 1-карбокси-4-гуанидил-бутиламиновую, 1-карбокси-4-гидрокси-5-амино-пентиламиновую или группу 1-карбокси-2-(1H-имидазол)-этиламиновую. А обозначает основную аминокислоту, m равняется 2-6, n равняется 1-5. В объеме изобретения находятся тоже смеси солей по формуле I и комплексы этих солей. Выгодные аминокислоты символа A - это аминокислоты, у которых изоэлектрическая точка есть более чем 7, главным образом аргинин, лизин, гистидин или гидроксилизин. Выгодные соли это соли формулы I, в которой R¹ и R² одинаковые и обозначают группу -CH(R⁴)-CH₃. Примерами солей с формулой I являются тоже соли эфира по формуле III (фиг. 3) и соли по формуле V (фиг. 5).

Выгодной смесью является смесь, в которой содержатся аминокислотные соли гематопорфирина, протопорфирина, винилдейтерийпорфирина и дигематопорфириного эфира и, возможно, их агрегаты.

Способ изготовления новых комплексных солей гематопорфирина и его производных общей формулы I или смесей солей общей формулы I, в которой символы имеют вышеуказанное значение, основан согласно изобретению на том, что гематопорфириновую производную общей формулы IV (фиг. 4) или смесь не менее чем двух производных общей формулы IV, в которой R¹ и R² имеют вышеподанное значение, с тем, что если R¹ и R² обозначают группу -CH(R⁴)-CH₃, то карбоксильные группы заместителя R⁴ могут быть свободными или защищенными, подвергают реакции с основной аминокислотой со свободными или защищенными карбоксильными группами или с его монохлористоводородной солью, выгодно в органическом растворителе, в смеси органических растворителей или в среде, содержащей органический растворитель и воду или смесь органических растворителей и воду, либо устраняют группы, защищающие карбоксильные функции и изолируют продукт представляющий соль формулы I или смесь солей формулы I, либо содержащий агрегаты солей формулы I. В процессе по изобретению реакции групп аминовых аминокислот с карбоксильными группами производных гематопорфирина образуют ионные системы согласно формуле

-COOH+H₂N-R _ -COO^-+H₃N-R.

В качестве основной аминокислоты применяется аминокислота с изоэлектрической точкой >7, особенно аргинин, лизин, гистидин или гидроксилизин.

Для защиты карбоксильных групп в исходных соединениях можно применять разные известные блокирующие группы, например, описанные в Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Green, John Wilex and Sons, 1981. Примерами этих групп являются группы, образующие сложные эфиры алкильные, бензиловые, силиловые, и другие группы, применяемые для обеспечения карбоксильных функций. Реакция может происходить в широком диапазоне температур, выгодно в пределе от комнатной температуры до 100^oC, особенно при температуре 50-70^oC. Время реакции обыкновенно от несколько минут до более десяти часов.

Выгодные органические растворители - это амиды, такие как формамид, диметилформамид, диэтилформамид; нитриды, такие как ацетонитрил, пропионитрил, изобутиронитрил; сложные эфиры, например, ацетат этила; кетоны как, например, ацетон; сульфоксиды, например, диметилсульфооксид; алкоголи и угольнодиэтиловый эфир или их смеси. Обычно реакция проводится в водно-органической среде.

Блокирующие группы, если они присутствуют, устраняются известными способами, например, гидролизом или гидрогенолизом.

Соль или соответственную смесь солей с формулой I можно выделить из реакционной смеси разными методами, например, осаждением, кристаллизацией и другими известными методами.

Особеннo выгодный метод основан на том, что до реакционной смеси добавляется растворитель или смесь низкополярных растворителей, таких, однако, которые с растворителем, применяемым для реакции, образуют гомогенный раствор с соотношением от 1:1 до 1:5. Соответственными растворителями являются, например, этиловый эфир, ацетон. Полученную смесь оставляют на несколько (до более десяти) часов для медленного осаждения продукта. Осадок после фильтрации и промытия высушивают в вакууме над сушильным средством, выгодно P₂O₅. Он устойчив и не расплывается на воздухе. Полученные соединения надо защищать от света. Стадия выделения содержит возможное разделение смеси.

Исходные соединения с формулой IV известны. Можно их получить из гемина.

Предметом изобретения является также фармацевтическое средство для обнаружения и/или лечения новообразований, содержащее соль с общей формулой I, в которой символы имеют вышеприведенное значение или смесь не менее двух солей формулы I либо их агрегаты. Примерная смесь - это смесь, содержащая аминокислые соли гематопорфирина, протопорфирина, винилдейтеропорфирина и дигематопорфиринного эфира либо их агрегаты.

Средством по изобретению может быть соль по формуле I или смесь солей по формуле I в виде твердого тела, выгодно находящаяся в стерильном, плотном контейнере.

Стерильный, плотный контейнер содержит обыкновенно соль или смесь солей в терапевтически эффективной дозе. Терапевтическая эффективная порция - это обычно 1,5-10 мг/кг веса тела. Из соли, находящейся в контейнере, можно весьма быстро изготовить стерильные водяные растворы для непосредственной внекишечной подачи.

Средство по изобретению можно также изготовлять в виде препаратов, готовых к использованию. В таком случае активное вещество, т.е. соль или смесь солей по формуле I, смешивают с фармакологически допустимым растворителем и/или носителем. Обыкновенно средство подается путем инъекции, главным образом внутреннeй, хотя можно ее тоже применять внутрибрюшинно или внутри прямой кишки. Примерный препарат - это стерильный водяной раствор. Водяной раствор, кроме соли по формуле I, содержит возможно физиологическую соль и в случае необходимости - пропиленгликоль.

Как уже упомянуто, такие растворы можно применять непосредственно после их изготовления или можно их хранить в стерильных контейнерах. Средство по изобретению можно применять без облучения, однако более эффективное действие проявляет оно как фотосенсибилизатор в фотодинамическом методе диагноза и терапии новообразований.

Новые соединения по формуле I были исследованы на клеточных линиях. Для исследований использовано 9-10 разных клеточных линий новообразований, которые были инкубованы в течениe 48 ч с разными солями производных протопорфирина и с новой солью применяемого препарата HpD (hematoporphyrin derivatives), полученную по методу Липсона и сотрудников.

Все использованные в испытании соединения были применены в виде водяных растворов. Их подавали в концентрации 50 мкг/мл.

Были исследованы и определены:

1) флуоресценция F клеток после 48-часовой инкубации, после этого клетки отмывали и исследовали интенсивность флуоресценции во флуоресценционном микроскопе, определяя ее в произвольной шкале от 0 до 4;

2) был определен (P%) - процент живых клеток после заранее описанного времени инкубации;

3) был определен коэффициент размножения клеток M под влиянием отдельных препаратов, определяя его следующим способом:

M = количество умноженных клеток в культуре с препаратом концентрации 50 мкг/мл после 48 ч/количество умноженных клеток в контрольной культуре после 48 ч

Результаты исследований даны в таблицах 1-3.

Из данных, представленных в таблицах 1-3, видно, что соединения с формулой I оказывают разное срoдство для исследованных клеточных линий, и разным способом влияют на их переживание.

Имея выбор разных производных, можно подобрать производную, наиболее активную для данного типа новообразования, что расширяет возможности эффективной терапии.

Список примененных в таблицах 1-3 символов клеточных линий, применяемых в исследованиях антикарциноматозных препаратов, производных протопорфирина и препарата HpD:

Hep - 2 клетки рака гортани

Hela - клетки рака шейки матки

KB - клетки рака полости рта

HBT-39/w клетки рака соска

T-47D - клетки рака соска

P3HR1 - клетки лимфака Буркитта

GLCH - малые клетки рака легких

Линии мышиных новообразований:

GR MT/F6 - клетки рака соска мыши штамма GR

Mm5MT/Cl - клетки рака соска мыши штамма C3H

MA-104 - клетки рака зародыша почки обезьяны резус

В сравнении с известным препаратом HpD новые соли обладают более широким пределом проникновения внутрь разных видов раковых клеток и лучшей эффективностью их уничтожения.

Примерно при использовании новой аргининовой соли HpD(HpD Ag₂) процент живых клеток после 48 ч инкубации (P%) для линии Hela равен 13, для линии MA-104 равен 6; для линии HBT-39/w равен 0, в случае же применения известного препарата, т.е. натриевой соли HpD(HpD Na₂), величины во много раз больше и равняются: для линии Hela - 28; для линии MA-104 - 17; для линии HBT-39/w - 10.

Новые соединения были испытаны тоже на животных. Выбрано соединение одно из самых активных в испытаниях для клеточной линии Mm5MT/Cl - рак соска мыши штамма C₃H - т.е. PP(Lyz)₂(Arg)₂ (соединение из примера XXI) и самое меньшее активное для этого типа рака, т.е. PP(Glu)₂(Arg)₂ (соединение из примера XIX).

Исследования произведены на мышах C₃H с трансплантированным раком соска при подаче обoих соединений в дозе 10 мг/кг и в двух вариантах. Животные были облучены лазером He-Ne в порции 150 J/см², что обозначено буквой L около символа соединения на диаграмме (фиг. 6), а в другом варианте они не были облучены.

На диаграмме показаны в виде графиков полученные результаты. Они показали, что:

1) итоги исследований на клеточных линиях нашли свое подтверждение в исследованиях на животных,

2) препарат PP(Liz)₂(Arg)₂ оказался активным и значительно продолжил проживание испытательных животных,

3) аминокислотные производные протопорфирина действуют цитотоксично на раковые клетки, тоже не возбужденные лазерным светом, хотя слабее, чем под влиянием лазера.

Пример I. HpD - это смесь производных гематопорфирина, таких как гематопорфирин, протопорфирин, винилдейтерпорфирин, дигематопорфириновый эфир и их агрегаты. 1 г HpD молекулярным весом 600 (1,67 ммоль) растворено в 30 мл диметилформамида (DMF) и добавлено 581,8 мг аргинина (3,34 ммоль), растворенного в 2 мл воды. Смесь подогревали 15-20 мин при температуре 60^oC на водяной бане, интенсивно смешивая. После этого добавлено 100 мл ацетона и далее смесь перемешивали около 3-5 мин. Раствор был оставлен в покое на 5-15 ч. В этом времени осаждался осадок смеси солей, обозначенной HpD(Arg)₂. Осадок фильтровали, промывали эфиром и сушили в вакууме. После сушки в вакууме осадок становится стойким на воздухе и надо его защищать от света ввиду содержанных в нем порфириновых производных. Реакция проходит с выходом около 75%.

Пример II. 1 г HpD растворено в 20 мл формамида и добавлено 581,8 мг аргинина, растворенного в 2 мл H₂O. Раствор подогревали и смешивали как в примере 1. Затем после охлаждения добавлено 100 мл этилового эфира. Раствор был размешан и оставлен в покое на несколько часов. После фильтрации и промывки эфиром осадок сушили в вакууме.

Получено 126,8 мг осадка смеси солей HpD(Arg)₂, что соответствует выходу 86%.

Пример III. 1230 мг дилизилпротопорфирина PPLiz₂ (1,4 ммоль) растворено в 40 мл формамида и смешано с 490 мг 1-аргинина (2,8 ммоль), растворенного в 1,5 мл воды. Смесь подогревалась в температуре 60^oC на водяной банe в течение около 20 мин. После охлаждения додано 100 мл этилового эфира, смешано и оставлено на несколько часов. Осадок был фильтрован, промыт эфиром и сушен в вакууме. Получено 1630 мг осадка, что отвечает выходу 90%. Данные полученного соединения приведены в примере XXI в таблице 4.

Пример IV. 1199,6 мг (1,4 ммоль) диглутамилпротопорфирина растворено в 60 мл формамида и добавлено 409,3 мг 1-лизина, растворенного в 1,5 мл воды. Смесь подогревалась в течениe 30 мин при температуре 60^oC, затем добавлено 120 мл ацетон-эфирной смеси с соотношением 1:3 (30 мл ацетона, 90 мл этилового эфира), смешивалась еще 10 мин, а затем была оставлена в покое на несколько часов. Затем фильтровалась в вакууме, промывалась этиловым эфиром и сушилась в вакууме над P₂O₅. Получено 1575 мг продукта, что отвечает 97,8%-ному теоретическому выходу.

Пример V. 1081,8 мг (1,4 ммоль) дисерилпротопорфирина растворено в 50 мл формамида и добавлено 490 мг 1-аргинина (2,8 ммоль), растворенного в 1,5 мл H₂O. Смесь подогревали при температуре 60^oC в течение 30 мин, затем добавлено 120 мл ацетон-эфирной смеси с соотношением 1:3 (30 мл ацетона и 90 мл этилового эфира) и все смешивалось еще 50 мин.

Раствор оставлен для кристаллизации на несколько часов. Затем осажденный осадок был фильтрован в вакууме и сушен в вакууме над P₂O₅. Получено 1500 мг осадка, то есть 95,5%. Подобным способом, как описано в примере V, получены все соли, приведенные в таблице 5.

Символы соединений, перечисленных в таблицах 1-3, строки 2-11, и в таблице 5 представляют соединения формулы I, где A=аргинин, m = 2, n = 1, R₁=R₂=-CH(R₄)-CH₃, где R₄ см. в табл. 5.

Пример XXVI.

К 1037,12 мг (1,4 ммоль) ди-(N-аланил)протопорфирина, растворенного в 40 мл диметилформамида, добавляют 434,4 мг (2,8 ммоль) гистидина, растворенного в 3 мл воды. Смесь нагревают в течение 40-50 мин на водяной бане при интенсивном перемешивании. После охлаждения добавляют 100 мл смеси ацетон-эфир (1:3). Затем смесь перемешивают в течение около 10 мин и дают отстояться несколько часов. После фильтрации в вакууме и вакуумной сушки над P₂O₅ получен продукт - соль гистидина - в количестве 1353 мг, что соответствует выходу 92%.

Спектр УФ vis _max нm/208/гистидин/, 400, 514, 550, 570, 632.