фармацевтический препарат, содержащий гормон роста или производное гормона роста и гистидин или производное гистидина, препарат, представляющий собой кристаллы гормона роста, содержащие гистидин или производное гистидина и способ получения кристаллов гормона роста и гистидина или производного гистидина

Формула изобретения

1. Фармацевтический препарат, содержащий гормон роста или производное гормона роста и гистидин или производное гистидина, отличающийся тем, что гистидин или его производное содержится в количестве от 0,1 до 12 мг гормона роста.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что используется гормон роста в форме буферного водного раствора гормона роста, забуференного гистидиновым буфером в концентрации от 1 до 100 мМ.

3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что гормон роста используется в форме буферной водной суспензии кристаллов гормона роста, забуференной гистидиновым буфером.

4. Препарат по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что величина pH выбирается в интервале 2 - 9.

5. Препарат по п.3, отличающийся тем, что величина выбирается в интервале от 5 до 8.

6. Препарат по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что дополнительно содержит сахар-спирт или дисахарид или их смесь.

7. Препарат по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что дополнительно содержит маннит или дисахарид или их смесь.

8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что дисахарид является сахарозой или трегалозой.

9. Препарат по любому из пп.1 - 8, отличающийся тем, что гормоном роста является человеческий гормон роста.

10. Препарат, представляющий собой кристаллы гормона роста, содержащие гистидин или производное гистидина.

11. Препарат по п.10, отличающийся тем, что гормоном роста является человеческий гормон роста.

12. Способ получения кристаллов гормона роста и гистидина или производного гистидина, отличающийся тем, что растворяют гормон роста в растворителе, добавляют гистидин или производное гистидина, с помощью соляной кислоты достигают pH раствора от 5 до 8, добавляют неорганические катионы, кристаллизацию проводят при температуре от 0^oC до примерно 30^oC и образовавшиеся кристаллы отделяют известным способом.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что растворитель выбирают из алифатических с короткой цепью алициклических или ароматических спиртов и кетонов.

14. Способ по п.11 или 12, отличающийся тем, что в качестве гормона роста используют человеческий гормон роста.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к стабилизированному фармацевтическому препарату, содержащему гормон роста, к способу получения такого препарата, кристаллам гормона роста, включающих гистидин или его производное, способу получения таких кристаллов и использованию гистидина или производных гистидина для стабилизации препарата гормона роста.

Гормоны роста (ГР) человека и обычных домашних животных представляют собой балки из примерно 191 аминокислоты, синтезируемые и секретируемые передней долей гипофиза. Человеческий гормон роста состоит из 191 аминокислоты.

Гормон роста является ключевым гормоном, включенным в регуляцию не только соматического роста, но также в регуляцию метаболизма белков, углеводов и липидов. Главное действие гормона роста состоит в стимуляции роста.

Система органов, на которую воздействую гормон роста, включают скелет, соединительную ткань, мышцы и внутренние органы, такие как печень, кишечник и почки.

До разработки технологии рекомбинации и клонирования гена гормона роста, приведших в настоящее время к производству, например, человеческого гормона роста (чГР) и Met-чГР в промышленном масштабе, человеческий гормон роста можно было получить только путем экстрагирования из гипофизов человеческих трупов. Очень ограниченные количества гормона роста ограничивали его использование в продольной стимуляции роста в детстве и в период полового созревания для лечения карликовости (недоразвития), даже хотя было предложено его применение, между прочим, для лечения малорослости (связанной с дефицитом гормона роста, нормальной малорослости и синдрома Тернера), дефицита гормона роста у взрослых, бесплодия, для лечения ожогов, заживления ран, лечения дистрофии, образования костной мозоли, лечения остеопороза, диффузного желудочного кровотечения и псевдоартроза.

Кроме того, гормон роста был предложен для повышения скорости роста домашних животных или для снижения количества жира у животных, которые должны забиваться для употребления в пищу человеком.

Фармацевтические препараты гормона роста имеют тенденцию быть нестабильными. Особенно в растворах гормона роста образуются продукты разложения, такие как дезамидированные или сульфоксидные продукты и димерные или полимерные формы.

Преобладающими путями разложения чГР являются 1) дезамидирование путем прямого гидролиза или через образование циклических сукцинимидных промежуточных соединений с последующим образованием различных количеств L-asp-чГР, L-изо-asp-чГР, D-asp-чГР и D-изо-asp-чГР (ссылки 1 - 3), 2) окисление метиониновых остатков в положениях 14 и 125 (ссылки 4 - 9), и 3) расщепление пептидных связей.

Дезамидирование происходит особенно у Asn в положении 149.

чГР довольно легко окисляется в положениях 14 и 125, особенно в растворе (4 - 8).

Окисление чГР в растворе с образованием сульфоксидов обычно связано с кислородом, растворенным в препарате. Растворимость кислорода в дистиллированной воде составляет примерно 200 мкМ (9). Так как концентрация чГР в препарате, содержащем 4 МЕ/мл, составляет 1,3 мг/мл, соответствуя 60 нМ чГР, кислород при нормальных условиях хранения будет присутствовать в избытке, превышающем примерно в 3000 раз стехиометрическое количество для окисления чГР. Невозможно решить эту проблему, стараясь дегазировать буферы перед разливкой и закупориванием препаратов.

В настоящее время не считается, что эти продукты разложения должны обладать токсическим или измененным биологическим действием или измененной способностью связываться с рецептором, но существует указание на такой эффект, что соответствующая стабильность сульфоксидов снижается по сравнению с нативным чГР.

Для разработки стабильного препарата с растворенным кислородом, содержащего чГР важно знать степень образования сульфоксидов, так же как и средства борьбы с окислением.

Кинетика разложения зависит от температуры, pH и различных консервантов или адъювантов препарата чГР.

Из-за нестабильности в настоящее время гормон роста лиофилизируется и хранится в лиофилизированной форме при 4^oC до того момента, когда он воссоздается (снова растворяется) для использования, чтобы минимизировать разложение.

Лиофилизированные фармацевтические препараты, содержащие чГР, в настоящее время воссоздаются пациентом и затем хранятся при низкой температуре, чаще при 4^oC в холодильнике в виде раствора в течение периода использования, вплоть до 14 дней, во время которого будет происходить некоторое разложение.

Кроме того, процесс воссоздания лиофилизированного гормона роста имеет тенденцию представлять трудности для пациента.

Таким образом, в настоящее время предпочтительно воспроизводить гормон роста как можно позже, перед самым использованием, и хранить и перевозить препарат в лиофилизированном состоянии. Цепь движения препарата от производителя до аптеки приспособлена для перемещения препаратов при контролируемой низкой температуре, например, при 4^oC, которая дает возможность длительного хранения, до двух лет.

Однако, расширенное применение систем ручек-шприцов для самостоятельного введения медикаментов и расширенная область применения требует препарата, который стабилен в течение достаточно длительного времени у конечного пользователя при условиях, когда "достаточное" охлаждение не всегда доступно.

Предпочтительно, препарат должен быть стабилен у конечного пользователя в лиофилизированном состоянии в течение примерно одного месяца и дополнительно в течение одного месяца в воспроизведенном состоянии в устройстве ручка-шприц в течение предназначенного периода использования кассеты.

Таким образом, существует потребность в более стабильных препаратах гормона роста, которые будут стабильны в лиофилизированном состоянии при относительно высокой температуре в течение какого-то периода и дополнительно в течение периода использования при относительно высокой температуре в растворе. Такая стабильность имеет очень большое значение после того, как введение гормона роста перемещается из клиник в дома лиц, которых нужно лечить, где оптимальное хранение может быть недоступно, как указано выше.

Кроме того, изменение устройства для введения гормона роста на устройства типа ручка-шприц требует стабильного растворенного препарата, содержащего гормон роста, для облегчения манипуляций, которые должны выполняться пациентом. Стабильный растворенный препарат, содержащий гормон роста, может производиться готовым к употреблению в форме кассет, устанавливаемых в устройство ручка-шприц, используемое пациентом, который может таким образом, избежать операции восстановления препарата и, следовательно, не должен иметь лиофилизированный препарат, подходящий растворитель для воссоздания, так же как и обладать необходимым умением и стерильным оборудованием для стерильного воспроизведения препарата.

Из соображений безопасности также будет желательно исключить воспроизведение препарата из лиофилизированного непосредственно перед применением препарата.

Кроме того, было бы выгодно исключить стадию лиофилизации при производстве препаратов гормона роста. Лиофилизация является емким по времени и дорогостоящим процессом, а также часто бывает "узким местом" в производстве, из-за ограниченной производительности лиофильной сушилки.

Таким образом, существует потребность снизить скорость процессов разложения, чтобы обеспечить стабильность растворенных препаратов чГР во время хранения и в течение периода использования до одного месяца.

Предыдущие попытки стабилизировать чГР не были полностью успешны в предупреждении образования димера. Проблемы, связанные с образованием димера, отмечены, у Becker G. W. Biotechnology and Applied Biochemistry 9, 478 (1979).

Международная патентная публикация N 0 89/09614 и Австралийская патентная заявка N 30771/89 раскрывают стабильный фармацевтический препарат, содержащий человеческий гормон роста, глицин и маннитол. Такой препарат демонстрирует улучшенную стабильность во время нормальной обработки и хранения в лиофилизированном состоянии, так же как и в период использования после воспроизведения.

Опубликованная Европейская патентная заявка N 303746 раскрывает, что гормон роста животного можно стабилизировать различными стабилизаторами, чтобы получить сниженное образование нерастворимых производных и сохранить активность к растворению в водной среде; такие стабилизаторы включают некоторые полиолы, аминокислоты, полимеры аминокислот, имеющие заряженные боковые группы с физиологическим pH и соли холина. Полиолы выбираются из группы, состоящей из невосстанавливающих сахаров, спиртов сахаров, кислот сахаров, пентаэритрита, лактозы, растворимых в воде декстранов и фиколла; аминокислоты выбираются из группы, состоящей из глицина, саркозина, лизина или их солей, серина, аргинина или их солей, бетаина, N,N-диметил-глицина, аспаргиновой кислоты или их солей, глютаминовой кислоты или ее солей; полимер аминокислоты, имеющей заряженную боковую группу с физиологическим pH, может выбираться из полилизина, полиаспаргиновой кислоты, полиглютаминовой кислоты, полиаргинина, полигистидина, полиорнитина и их солей; и производные холина выбираются из группы, состоящей из холинхлорида, однозамещенного цитрата холина, холинбутартрата, бикарбоната холина, трихолинцитрата, аскорбата холина, бората холина, глюконата холина, фосфата холина, ди(холин)сульфата и дихолинмуката.

EP 374120 раскрывает стабилизированный препарат гормона роста, содержащий буферный полиольный наполнитель, включающий полиол, имеющий три гидрокси-группы, и буфер для достижения pH в интервале, в котором гормон роста сохраняет свою биоактивность в течение достаточного периода времени. В качестве буфера для полиола, имеющего три гидрокси-группы, упоминается гистидин.

В настоящее время к удивлению было обнаружено, что препарат человеческого гормона роста, содержащий только гистидин или его производное в качестве добавки или буферного вещества в количестве от 0,1 до 12 мг гистидина или его производного на мг гормона роста, демонстрирует очень высокую стабильность в отношении дезамидирования, окисления и расщепления пептидных связей. Стабильность продукта дает возможность хранения и транспортировки его в лиофилизированном состоянии или в форме растворенного или повторно растворенного препарата.

В EP 303746 упоминается полигистидин в качестве потенциального стабилизатора для гормона роста животного, но там нет указаний на то, стабилизирует ли он гормон роста животного или человеческий гормон роста.

В EP 374120 указывается, что гистидин гидрохлорид может использоваться в качестве буфера для забуферивания полиола, имеющего три гидроксигруппы, с целью улучшения стабильности препарата гормона роста в форме раствора, содержащего гормон роста в высокой концентрации и полиол в качестве стабилизатора. Гидрохлорид гистидина должен добавляться в количестве примерно 3% по весу раствора, соответствующего концентрации 0,15 М раствора гидрохлорида гистидина. В EP 374120 также указывается, что один гистидин не придает химическую и физическую стабильность препарату гормона роста.

Препарат этого изобретения может быть в форме лиофилизированного порошка, подлежащего позднее воспроизведению до раствора с использованием общепринятых растворителей, таких как дистиллированная вода или вода для инъекций, или в форме раствора или суспензии кристаллов, состоящих из гормона роста. Такие растворители могут включать общепринятые консерванты, такие как м-крезол и бензиловый спирт.

Предпочтительное осуществление изобретения представляет собой форму фармацевтического препарата человеческого гормона роста, содержащего гистидин или его производное в форме буферного водного раствора гормона роста, забуференного гистидиновым буфером. Такой препарат является формой, готовой к употреблению, и может храниться и транспортироваться в виде водного раствора без значительной деградации. L-гистидин имеет рКА 6,0 и является соответственно подходящим в качестве буфера сам по себе с pH 6,5.

Препарат гистидина с pH 6,5 считается стабильным при 25^oC в течение почти 50 дней.

И еще одно предпочтительное осуществление изобретения находится в форме фармацевтического препарата человеческого гормона роста, содержащего гистидин или его производное в форме буферной водной суспензии кристаллов гормона роста, забуференного гистидиновым буфером. Такой препарат очень стабилен и поддерживает гормон роста в кристаллической фазе во время хранения и транспортировки в готовой для применения форме, дающей даже более слабую тенденцию к деградации. Такой препарат действует как растворенный препарат при инъекции, т.е. не происходит поддерживаемое освобождение человеческого гормона роста.

Из соображений стабильности pH раствора или суспензии в препаратах предпочтительно доводится до значения в интервале 2 - 9. Более предпочтительны препараты, имеющие pH от 5 до 8, и особенно pH от 6 до 7,5.

Для получения стабилизирующего эффекта концентрация гистидина составляет предпочтительно от 1 мМ до 100 мМ. Более предпочтительно, чтобы концентрация добавленного гистидина присутствовала в количестве от 2 до 20 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 15 мМ.

Добавление 10% этанола ил 5% метанола приводило к более чем 20% снижению дезамидирования.

Препарат согласно данному изобретению может также находиться в форме лиофилизированного порошка или спекшейся массы, содержащих гормон роста или производное гормона роста и гистидин или его производное в количестве от 0,1 до 12 мг гистидина или его производного на мг гормона роста или производного гормона роста, и заполняющий агент для лиофилизации, выбираемый из группы, состоящей из спиртов сахаров и дисахаридов и их смесей. Спиртом сахаром является, предпочтительно, маннит.

Лиофилизированные препараты в соответствии с этим изобретением, содержащие сахарозу, предпочтительны вследствие очень высокой стабильности, а препараты, содержащие сахарозу и маннит, особенно предпочтительны, так как соединяют очень высокую стабильность с очень хорошей способностью к переработке, обеспечивающей твердые лиофилизированные продукты, которые легко растворимы и очень стабильны в растворе в течение продолжительного периода времени после растворения. Кроме того, предпочтительными препаратами в соответствии с этим изобретением являются препараты, содержащие маннит и трегалозу в качестве заполняющего средства для лиофилизации. Препараты по этому изобретению, содержащие маннит и дисахарид, обычно содержат примерно одинаковое количество двух составляющих по весу.

Количество сахарозы, присутствующее в препаратах этого изобретения, может меняться в широких пределах. Соотношение гормона роста и сахарозы может меняться от 0,005 до 1,5 по весу. Таким образом, количество сахарозы может быть от 0,67 до 200 мг на мг гормона роста, причем предпочтительно количество от 1,1 до 50 мг на мг гормона роста.

Лиофилизация чГР в гистидиновом буфере не вызывает никаких проблем. Скорость дезамидирования снижается на 20% при стоянии после повторного растворения по сравнению с фосфатным буфером.

Фармацевтический препарат этого изобретения может, кроме того, включать соли, обычно используемые для облегчения его обработки, например лиофилизации или воспроизведения.

Другой путь стабилизации гормона роста, в соответствии с этим изобретением, состоит в образовании кристаллов гормона роста, обеспечивающих хорошую защиту против разложения. Было обнаружено, что препараты гормона роста в форме кристаллов, включающих гистидин, удовлетворяют вышеупомянутым потребностям. Кристаллы в высушенной форме могут использоваться непосредственно в качестве препарата ГР, который будет воспроизводиться перед использованием общепринятым путем.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к кристаллам гормона роста, или производного гормона роста, включающим гистидин или его производное и органический или неорганический катион. Было показано, что качество таких кристаллов лучше, чем качество препаратов, получаемых с использованием ранее разработанных форм гормона роста.

Хотя ГР легко доступен в количествах, достаточных для кристаллизации, до сих пор не сообщалось об успешной его кристаллизации.

О микрокристаллах или аморфном материале сообщалось в ряде источников: (Jones et al., Bio-Technology (1987) 5, 499-500; Wilhelmi et al., J. Biol. Chem. (1984) 176, 735-745; Clarkson et al., J. Mol. Biol. (1989) 208, 719-721; и Bell et al., J. Biol. Chem. (1985) 260, 8520-8525.

Метод висящей капли - наиболее обычный метод, используемый при попытках кристаллизации ГР. По-видимому из-за гетерогенности препаратов гормона роста, как сообщалось, размер и форму кристаллов значительно варьируют. О самых больших кристаллах сообщается в публикации Jones et al., (1987). Для своих успешных экспериментов они использовали смесь полиэтиленгликоля 3500 и бетаоктилглюкозид при нейтральной pH. Clarkson et al., (1989) сообщили, что использование низших спиртов и ацетона дает возможность образования кристаллов размером от 0,001 до 0,005 мм³ с различной формой. Ни один из известных методов не пригоден, однако, для коммерческого производства кристаллов ГР и др. из-за того, что необходимы периоды роста от нескольких недель до одного года.

Была получена лекарственная форма бычьего гормона роста для применения в ветеринарии в смеси с дивалентными ионами и маслом (EP 343696). Путем добавления ZnCl₂ к или бычьему или свиному гормону роста в присутствии липидов образуются неопределенные по форме частицы для получения лекарственной формы с пролонгированным выделением лекарственного вещества. Гормон роста диспергируется в носителе таким образом, что каждой молекулой гормона роста захватываются от 1 до 4 молекул Zn. Растворы готовили в присутствии меняющихся концентраций денатурирующих растворенных веществ (от 1 до 4 М мочевины) при высоком pH (9,5). Воспроизведение этого процесса с чГР показало, что невозможно получить кристаллы таким образом.

Из литературы хорошо известно, что присутствие дивалентных катионов во время процесса кристаллизации инсулина дает не только превосходную ориентацию при анализе, но также улучшенные физические условия для кристаллизации (смотрите, например, пат. США N 2174862). Гормон роста, однако, более чем в три раза больше, чем инсулин, и имеет полностью другую конформацию. Удивительно, что теперь было показано, что добавление катионов к растворам, содержащим чГР и гистидин или производное гистидина, делает возможным образование стабильных однородных кристаллов гормона роста с высоким выходом. Кроме того, период времени, необходимый для образования кристаллов высокого качества из чГР, является относительно коротким.

Дополнительный аспект изобретения составляет метод получения кристаллов гормона роста и гистидина или производного гистидина, включающий стадии:

a) получение раствора гормона роста или производного гормона роста в растворителе и добавления гистидина или производного гистидина и, факультативно, доведения pH до значения от 5 до 8, с использованием соляной кислоты;

b) добавления органических или неорганических катионов;

c) кристаллизации раствора при температуре от примерно 0^oC до примерно 30^oC, и

d) выделения кристаллов, полученных известным способом.

Было обнаружено, что кристаллизация чГР в присутствии гистидина или производного гистидина дает более высокий выход кристаллического чГР в форме больших и более чистых однородных кристаллов, чем кристаллизация в присутствии фосфатного буфера, обычно используемого для формирования препаратов чГР. Таким образом, выделение и очистка кристаллов облегчается.

Выход кристаллов был повышен на 20% при выполнении кристаллизации в присутствии гистидина по сравнению с кристаллизацией из прежних составов.

Исходный материал, гормон роста, может быть концентратом, полученным непосредственно из среды ферментации, или стандартным лиофилизированным препаратом, который растворяется в растворителе и доводится до концентрации предпочтительно большей чем 0,1 мг/мл, предпочтительно до концентрации от 4 до 7 мг/мл и наиболее предпочтительно до концентрации 6 мг/мл. Растворитель, использованный на стадии a), является соответственно водным буфером, таким как фосфатный буфер или гистидиновый буфер.

Кристаллизации дают пройти в течение периода от 1 до 120 часов, предпочтительно от 5 до 72 часов, и наиболее предпочтительно от 20 до 48 часов при температуре. Температура составляет предпочтительно от 4 до 25^oC.

pH на стадии a) обычно находится в интервале от 5,0 до 7,5, предпочтительно от 5,0 до 6,8, более предпочтительно от 5,8 до 6,5, и наиболее предпочтительно от 6,0 до 6,3.

Концентрация гистидина или производного гистидина на стадии a) может меняться от 5 - 25 мМ, причем 5-15 мМ предпочтительна для получения кристаллов соответствующего размера и качества, о которых сообщалось выше.

Предпочтительны дивалентные катионы и неорганические катионы, такие как Zn⁺⁺, которые, как было показано, хорошо подходят для быстрого образования стабильных кристаллов ГР. Также могут использоваться смеси катионов.

Катионы должны добавляться в количестве, обеспечивающем быстрое и эффективное образование хорошо оформленных кристаллов. Верхний предел количества добавляемых катионов равен количеству, которое вызывало бы неспецифическое осаждение, значительного количества аморфного материала.

При использовании Zn⁺⁺ подходящие концентрации будут обычно составлять от примерно 0,2 до 10 моль Zn⁺⁺/моль ГР. Однако, если реакционная смесь для кристаллизации содержит буфер или другое вещество, которое способно к связыванию катионов, например, в форме комплексов, будут необходимы более высокие концентрации катиона для процесса кристаллизации, чтобы компенсировать это связывание.

Zn⁺⁺ будут предпочтительно использоваться в количестве, которое будет вызывать образование кристаллов ГР, имеющих молярное соотношение между Zn⁺⁺ и ГР от 0,2 до примерно 10, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 5 и наиболее предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 2.

При использовании других неорганических катионов, концентрация может меняться в интервале между 0,5 и 10 моль катиона/моль ГР.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический растворитель или смесь органических растворителей добавляется на стадии a).

Подходящие органические растворители, которые будут добавляться для кристаллизации, могут выбираться из алифатических, алициклических или ароматических спиртов и кетонов, таких как метанол, этанол, 1- и 2-пропанол, циклогексанол, ацетон, фенол или м-крезол. Предпочтительными органическими растворителями являются этанол и ацетон, наиболее предпочтителен этанол.

В раствор можно вносить затравку, путем добавления небольших и хорошо оформленных кристаллов чГР гексагональной или игольчатой формы, но предпочтительно затравка не проводится.

Концентрация органического растворителя может быть от 0,1 до 50% объем/объем, предпочтительно, от 0,1 до 30%, более предпочтительно, от 0,1 до 20%, даже более предпочтительно, от 5 до 15% и наиболее предпочтительно, от 6 до 12% объем/объем.

Настоящий процесс может использоваться в качестве быстрой и эффективной последующей обработки рассматриваемого гормона роста, благодаря образованию кристаллов в больших объемах растворов.

При использовании этанола в качестве органического растворителя, подходящей является концентрация между 0,1 и 20%, более предпочтительной - между 5 и 15% и наиболее предпочтительной - от 6 до 12% (объем/объем).

Образовавшиеся кристаллы могут изолироваться общепринятыми методами, такими как центрифугирование или фильтрация, отмывание, и, по желанию, лиофилизацией для удаления следов органических растворителей.

Размер кристаллов будет зависеть от соотношения Zn⁺⁺ и ГР и выбора и содержания (объема) растворителя, использованного в процессе.

Кристаллы чГР в соответствии с настоящим изобретением, как было показано, обладают биологической активность, сходной с активностью растворенного стандарта чГР при испытаниях in vitro. Новые кристаллы ГР могут, таким образом, использоваться при тех же показаниях, что и коммерчески доступный препарат чГР.

Еще один аспект изобретения относится к использованию гистидина или его производного для приготовления стабилизированного препарата гормона роста.

Фармацевтические препараты этого изобретения, предпочтительно, представлены в форме стандартной дозы, содержащей от 4 ИЕ до 100 ИЕ гормона роста на дозу.

В настоящем контексте "гормон роста" может быть гормоном роста любого происхождения, таким как птичий, бычий, лошадиный, человеческий, овечий, свиной, лососевый, форелевый или тунцовый гормон роста, предпочтительно бычий, человеческий или свиной гормон роста, человеческий гормон роста наиболее предпочтителен. Гормон роста, используемый в соответствии с этим изобретением, может быть природным гормоном роста, выделенным из природного источника, например путем экстрагирования гипофизов общепринятым способом, или гормоном роста, полученным с помощью генной инженерии, например, как описано у Е. В. Jensen и S.Carlsen в Biotech and Bioeng. 36, 1-11 (1990). "Производное гормона роста может быть усеченной формой гормона роста, в которой удален(ы) один или более аминокислотных остатков; его аналогом, в котором один или более аминокислотных остатков в природной молекуле замещен(ы) другим(и) аминокислотным(и) остатком(и), предпочтительно, остатком природно встречающейся аминокислоты, поскольку замещение не дает какого-либо побочного действия, такого как антигенность или сниженное действие; или его производным, например, дезамидированной или сульфоксидной формами гормона роста, или формами, имеющими продолжение N - или C-конца, таким как Met-чГР, Met-Glu-Alа-Glu-чГР или Ala-Glu-чГР. Предпочтительным гормоном роста является чГР.

Термин "производные гистидина" используются при настоящей цели для обозначения амидов и сложных эфиров гистидина, таких как метиловый или этиловый эфиры, дипептидов, таких как His-Gly His-Ala, His-Lеu, His-Lys, His-Ser и His-Phe, и аналогов или производных гистидина, таких как имидазол, дезамино-His или поли-His. Для простоты содержания гистидина или его производного в препаратах этого изобретения рассчитывается и используя молярный вес самого гистидина.

Термин "моли", использованный для обозначения дополнительных средств для облегчения обработки или воспроизведения фармацевтических препаратов, включает общепринятые добавки, такие как соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов или аммония органических кислот, таких как лимонная кислота, пировиноградная кислота или уксусная кислота, например цитрат натрия, тартрат натрия или ацетат натрия, или минеральных кислот, таких как соляная кислота, например, хлорид натрия.

В настоящем контексте "высокая стабильность" получается когда препарат более стабилен, чем общепринятые (обычные) препараты, содержащие фосфатный буфер.

"Спиртом-сахаром" может, например, быть маннит, ксилит, эритрит, треит, сорбит или глицерин.

В настоящем контексте "дисахарид" используется для обозначения встречающихся в природе дисахаридов, таких как сахароза, трегалоза, мальтоза, лактоза, сефароза, тураноза, ламинарибиоза, изомальтоза, гентиобиоза или мелибиоза.

Растворитель, используемый в препаратах этого изобретения, может быть водой, спиртами, такими как этиловый, н-пропиловый или изопропиловый, бутиловый спирт или их смесь. Растворитель может включать консервант, такой как м-крезол или бензиловый спирт.

На фиг. 1 показана фотография кристаллов чГР, полученных в присутствии фосфатного буфера (без добавления гистидина) (увеличение 400X); на фиг. 2 показана фотография кристаллов чГР, соответствующих этому изобретению, образованы в присутствии гистидинового буфера (увеличение 400X).

Изобретение объясняется более детально в нижеследующих примерах, которые иллюстрируют изобретение. Они не должны рассматриваться как ограничивающие объем этого изобретения, который определяется прилагаемый формулой изобретения.

Пример 1. Снижение дезамидирования.

Скорость дезамидирования определялась при 37^oC для препаратов чГР содержащих 4 МЕ и 12 МЕ при pH 6,5 в His буфере по сравнению с фосфатным буфером при том же самом pH.

Препарат чГР, содержащий 4 МЕ, имеющий состав А, получали путем растворения 13,3 мг чГР в 10 мМ гистидинового буфера, приготовленного путем растворения 15,5 мг гистидина в 10 мл деионизированной воды, содержащей 0,9% бензилового спирта, и добавления 0,1 N соляной кислоты до pH 6,5. Препарат, содержащий 12 МЕ, получали путем растворения 40 мг чГР в тех же самых составляющих, которые установлены выше.

Препарат чГР, содержащий 4 МЕ, имеющий состав В, получали путем растворения 13,3 мг чГР в 10 мл 10 мМ раствора двузамещенного фосфата натрия, полученного путем растворения 17,8 мг двузамещенного фосфата натрия в 10 мл деионизированной воды, содержащей 0,9% (объем/объем) бензилового спирта, и добавления 0,1 N фосфорной кислоты до pH 6,5. Препарат, содержащий 12 МЕ, готовили путем растворения 40 мг чГР в тех же компонентах, которые представлены выше.

Состав А: 10 мМ His; 0,9% бензиловый спирт; HCl до pH 6,5.

Состав B: 10 мМ динатрий-фосфата; 0,9% бензиловый спирт; фосфорная кислота до pH 6,5.

Препараты исследовались с помощью ИО-ВЭЖХ на содержание дезамидо-чГР непосредственно после воспроизведения и через 7 дней хранения при 37^oC. Результаты видны из нижеследующей табл. 1.

Из цифр, приведенных в табл.1, видно, что дезамидирование чГР значительно снижается при 37^oC в гистидиновом буфере по сравнению с фосфатным буфером.

Пример 2.

Снижение дезамидировния в присутствии гистидина или производных гистидина.

Скорость дезамидирования оценивалась при 25^oC для препаратов чГР, содержащих 6 МЕ чГР при pH 6,5 и при pH 7,3 в 5 мМ, 10 мМ и 10 мМ His буфере по сравнению с 8 мМ фосфатным буфером при том же самом pH. Кроме того, испытывались производные гистидина His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Phe, His-Ser, метиловый эфир гистидина, гистидинол, имидазол, имидазол-4-уксусная кислота и гистамин.

Препараты чГР получали путем растворения 20 мг чГР в 10 мл гистидинового буфера желаемой концентрации, приготовленного растворением 7,8 мг, 15,5 мг, и 155,2 мг соответственно гистидина в 10 мл деионизированной воды, содержащей 0,9% (объем-объем) бензилового спирта, и добавления 0,1 N соляной кислоты по устанавливаемой pH.

Препараты чГР, приведенные в нижеследующей таблице 2, хранили при 25^oC и анализировали на содержание дезамидопроизводных через 14 и 30 дней с помощью ИО-ВЭЖХ. Результаты видны из нижеследующей табл. 2.

Из табл. 2 видно, что дезамидирование чГР снижается примерно на 20% при добавлении гистидина по сравнению с фосфатным буфером с pH 6,5 и 7,3. Кроме того, снижение pH с 7,3, который является обычным pH коммерческих препаратов чГР, до 6,5, само по себе дает снижение скорости дезамидирования на 50%.

Гистидинол, по-видимому, не стабилизирует препараты при условиях испытания, и добавление гистидина в больших количествах не увеличивает, но несколько снижает желаемый эффект.

Сравнимые результаты, как видно, получаются при использовании гистидиновых аналогов, таких как имидазол, гистамин и имидазол-4-уксусная кислота, так же как метиловый эфир гистидина, дающего рост образования только 3,1% дезамидо-чГР через 30 дней хранения при 25^oC, давая возможность срока существования препарата в 3-4 месяца.

Давление Asp или Glu увеличивает скорость дезамидирования по сравнению с фосфатом при pH 6,5.

Добавление дипептидов типа His-X демонстрирует положительный эффект для His-Gly и His-Ala, тогда как His-Ser снижает устойчивость к дезамидированию.

Вышеприведенные результаты показывают, что скорость дезамидирования снижается при снижении pH и добавлением гистидина в низкой концентрации, предпочтительно примерно 5 мМ - 10 мМ. Скорость дезамидирования может снижаться более чем на 50% при снижении pH и замене фосфатного буфера гистидином.

Использование м-крезола и бензилового спирта в качестве консерванта, по-видимому, не влияет на скорость дезамидирования.

Расщепление (гидролиз пептидных связей) снижается гистидином при pH 6,5 по сравнению с фосфатом.

Пример 3.

Снижение образования сульфоксида.

Изучалась зависимость от pH и типа буфера.

Зависимость от pH:

Препарат:

Коммерческий препарат чГР (Norditropin , 12 МЕ/мл), содержащий бикарбонат, глицин и маннитол + 0,9% бензиловый спирт, доводили до pH 8,3, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5 и 6,0, используя 0,1 N соляную кислоту, и образцы оставляли при 37^oC. Анализ проводили с помощью ВЭЖХ с обращением фазы через 0,7 и 14 дней. Результаты видны из нижеприведенной табл. 3.

Как будет заметно, образование сульфоксида чГР снижается при снижении pH с 8,4 до 6,0.

Тип буфера, pH:

Препарат В-чГР, содержащий 12 мг/мл дистиллированной воды, разводили в пропорции 1+10 различными буферами с концентрацией 15 мМ и дополненными, кроме того, факультативными добавками. Образцы оставляли при 25^oC, и анализ с помощью ВЭЖХ с обращением фазы проводили через 10 и 34 дня. Результаты ВЭЖХ с обращением фазы и факультативные добавки видны из табл. 4, представленной ниже.

При сравнении с фосфатным буфером наблюдается заметное снижение образования сульфоксидного В-чГР в гистидиновом буфере (pH 7,3). Снижение образования сульфоксида наблюдается при понижении pH в His-буфере.

Никакого дальнейшего эффекта не получали при добавлении антиоксидантов или других добавок.

Пример 4.

Кристаллизация чГР в присутствии фосфатного или гистидинового буфера.

Образцы раствора чГР, приготовленного по Dalboege et al Biotechnology (1987), 5, 161-164, в концентрации 6 мг/мл инкубировали в 10 мМ фосфатном или 10 мМ гистидиновом буфере при pH 6,2. К каждому из образцов добавляли этанол до конечной концентрации 7,5% (объем/объем) с последующим добавлением раствора ацетата цинка до конечной концентрации цинка 1,34 моль Zn/моль чГР в случае фосфатного буфера и 5,5 моль Zn/моль чГР в случае гистидинового буфера.

Кристаллы выращивали в суспензии в течение 16 часов, и кристаллизацию контролировали с помощью фазовой контрастной микроскопии. Кристаллы, образованные в гистидиновом буфере, имеют вид хорошо сформированных, одинакового размера, гексагональных, содержащих мало или не содержащих аморфных примесей (фиг. 1). Наоборот, кристаллы чГР, образованные в фосфатном буфере при точно идентичных условиях, показывают значительно более явно выраженный гетерогенный вид с содержанием значительного количества аморфного материала (фиг. 2).

Кристаллам давали расти в течение 5 дополнительных дней. Кристаллы, образованные как в гистидиновом, так и в фосфатном буфере, собирали центрифугированием и эти кристаллы растворяли в 7 М мочевине с последующим анализом на чГР, приведенным в табл. 4а.

Таким образом, гистидиновый буфер обеспечивает лучшие условия для кристаллизации чГР как в отношении выхода кристаллов, так и их качества.

Пример 5.

Стабильность лиофилизированных препаратов, содержащих гистидин и сахарозу или маннит, сравнили с обычным препаратом чГР, содержащим фосфат, глицин и маннитол.

Следующие препараты 1 - 8 были приготовлены путем обессоливания раствора чГР до определенных гистидиновых буферов. После доведения концентрации чГР до 6 МE/мл с помощью различных гистидиновых буферов, растворяли определенные количества маннитола и сахарозы.

Препарат 9 соответствует обычному препарату чГР и используется в качестве препарата для сравнения.

Все растворы чГР 1 - 9 разливали в ампулы по 1 мл и лиофилизировали.

Анализы чГР выполняли после воспроизведения препарата с помощью 0,9% раствора бензилового спирта.

1. чГР 6 ME/мл.

Доведенный до pH 6,5 с использованием HCl

Маннит 33 мг/мл

2. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 6,5 с использованием HCl

Сахароза 62 мг/мл

3. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 7,0 с использованием HCl

Маннит 33 мг/мл

4. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 7,0 с использованием HCl

Сахароза 62 мг/мл

5. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 6,5 с использованием HCl

Маннит 33 мг/мл

6. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 6,5 с использованием HCl

Сахароза 62 мг/мл

7. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 7,0 с использованием HCl

Маннит 33 мг/мл

8. чГР 6 ME/мл

Доведенный до pH 7,0 с использованием HCl

Сахароза 62 мг/мл

9. чГР 6 ME/мл

Na₂HPO₄, 2H₂O 0,59 мг/мл

NaH₂PO₄, 2H₂O 0,53 мг/мл

Маннит 20,5 мг/мл

Доведенный до pH 7,0 с использованием фосфорной кислоты.

Лиофилизованные продукты легко растворимы и образуют прозрачные водные растворы.

Количество полимера перед лиофилизацией (ДЛ) и непосредственно после лиофилизации, через 7 месяцев при 4^oC, через 7 месяцев при 4^oC плюс 4 месяца при 37^oC и через 7 месяцев при 4^oC плюс 4 месяца при 25^oC в процентах представлено в табл. 5.

Количество димера в % представлено в табл. 6.

Количество дезамидо-чГР в % представлено в табл. 7, и

Количество сульфоксида в % представлено в табл. 8

Количество дезамидо-чГР и сульфоксида определялось как в примерах 1 - 4.

Количество димера и полимера определялось с помощью p-ВЭЖХ.

Пример 6.

Стабильность лиофилизированных препаратов, содержащих гистидин, маннитол и дисахарид.

Следующие препараты были приготовлены тем же самым способом, который описан в примере 5.

10. чГР 6 ME/мл

Доводили до pH 6,5, используя HCl

Сахароза 21 мг/мл

Маннит 22 мг/мл

11. чГР 6 ME/мл

Доводили до pH 7,0, используя HCl

Сахароза 21 мг/мл

Маннит 22 мг/мл

12. чГР 6 ME/мл

Доводили до pH 7,0, используя HCl

Трегалоза 20 мг/мл

Маннит 22 мг/мл

Количество дезамидо-чГР, полимера в % определяли перед лиофилизацией (ЛД), в момент t = 0, через три месяца хранения при 40^oC и через 6 месяцев хранения при 25^oC.

Результаты видны из нижеследующих таблиц 9 - 11.

Видно, что образцы, содержащие маннит и сахарозу или трегалозу, демонстрируют лучшую стабильность, чем образцы, содержащие только маннит в качестве наполнителя для лиофилизации.

Пример 7.

Состав фармацевтического препарата, содержащего кристаллы чГР

Кристаллы выращивали, как описано в примере 4 и хранили при 4^oC. Кристаллы затем выделяли путем центрифугирования и последующего удаления маточной жидкости. Затем кристаллы лиофилизировали в течение ночи до достижения сухих кристаллов без остатков органического растворителя. Фармацевтическую суспензию сухих кристаллов готовили по следующей прописи:

Кристаллы чГР - 1,3 мг/мл

Гистидин - 1,6 мг/мл

Zn(Ac₂) H₂O - 0,1 мг/мл

Бензиловый спирт - 0,9% (объем/объем)

pH доводили до 6,5, используя HCl

Пример 8.

Пример 7 повторяли за исключением того, что Zn(Ac₂) H₂O не включался, давая суспензию следующего состава:

Кристаллы чГР - 1,3 мг/мл

Гистидин - 1,6 мг/мл

Бензиловый спирт - 0,9% (объем/объем)

pH доводили до 6,2

Пример 9.

Кристаллы обрабатывали тем же самым способом, что и в примере 7, и была создана пропись следующей суспензии:

Кристаллы чГР - 1,3 мг/мл

Гистидин - 1,33 мг/мл

NaCl - 5,7 мг/мл

Бензиловый спирт - 0,9% (объем/объем)

pH доводили до 6,2

Пример 10.

Кристаллы обрабатывали тем же путем, что и в примере 7, и получали следующий раствор:

Кристаллы чГР - 1,3 мг/мл

Гистидин - 1,14 мг/мл

NaCl - 9,0 мг/мл

pH доводили до 6,1

Пример 11.

Аналогичным способом, который описан в примере 1, биосинтетический гормон роста включался в лекарственную форму в концентрации 6 ME/мл в 0,9% бензиловом спирте с pH 6,5 при различных концентрациях гистидина 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 или 100 мМ.

Образцы хранили 7 дней при 37^oC, и анализы на содержание дезамидо-, окисленных форм и димеров и полимеров выполняли тем же самым образом, как описано выше. Результаты видны из таблицы 12, представленной ниже, причем содержание дезамидо-чГР, димеров и полимеров и окисленных форм определяли с помощью ИО-ВЭЖХ, ВЭЖХ с обращением фазы в гель проникающий ГП-ВЭЖХ, и содержание расщепленных форм чГР определялось с помощью ИО-ВЭЖХ.

Количество димера низко, когда концентрация гистидина 1 мМ или выше. В отношении образования дезамидо-соединений дают приемлемые результаты концентрации гистидина до 30 мМ, и в отношении образования окисленных форм предпочтительны концентрации гистидина ниже 20 мМ. Общий оптимум для концентрации гистидина составляет, как видно, 5 мМ.