способ получения иммунорегуляторного глобулина

Формула изобретения

Способ получения иммунорегуляторного глобулина путем фракционного осаждения белков сыворотки крови человека сульфатом аммония, отделение осадка, растворения его в буферном растворе с последующим диализом и стерилизации продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют полиспецифические сыворотки периферической крови женщин, рожавших более двух раз, содержащие анти-HLA-антитела, а к раствору иммуноглобулина после диализа добавляют ЭДТА и глюкозу в конечной концентрации 0,7-0,9 и 2-5% соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к производству препаратов из крови человека. Такие препараты могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний и для предотвращения отторжения органов и тканей при трансплантациях.

В настоящее время для терапии подобных заболеваний используют иммуномодуляторы - вещества, способные изменять функциональные свойства иммунокомпетентных клеток. К ним относятся как иммунодепрессанты (антиметаболиты, алкилирующие агенты, кортикостероиды, некоторые антибиотики и т.д.), так и иммуностимуляторы (пептиды тимуса, интерферон, лимфокины, левамизол и т.д.).

Анализ данных отечественной и зарубежной литературы свидетельствует о возможности модуляции функциональных свойств иммунокомпетентных клеток с помощью антител к антигенам Главного Комплекса Гистосовместимости человека (HLA). При этом в качестве лечебного средства предлагается использовать моноклональные анти-HLA-антитела, полученные биотехнологическими методами (EP N 0068790, кл. A 61 K 39/395, 1986), или высокоактивные моно- и диспецифические сыворотки, а также плазмы аллосенсибилизированных лиц (Левин В.И., Соловей А.Н., Атаманенко Л.Г. и др. // Вестник АМН СССР. - 1988. - N 7. - С. 57 - 62; Савченко Н.Е., Левин В.И., Пилотович В.С. и др. // Клиническая медицина. - 1989. - N 2. - С. 67 - 70; А.С. СССР N 1697817, кл. A 61 K 39/395, 1991).

Однако применение для иммунокоррекции ряда патологических состояний анти-HLA-сывороток и анти-HLA-плазмы ограничено необходимостью длительного и трудоемкого процесса HLA-типирования с целью подбора соответствующих пар донор-реципиент. Кроме того, для этой процедуры можно использовать только сыворотки или плазму с высокой цитотоксической активностью, а также препараты являются достаточно редкими, дорогостоящими и, как правило, применяются в качестве стандартов в иммуногенетических исследованиях. В то же время иммунные сыворотки с широким спектром полиспецифических анти-HLA-антител, но с низкой цитотоксической активностью пока не нашли применения в лечебной практике и, по существу, являются бросовым материалом. Однако иммуноглобулиновый концентрат, полученный из таких сывороток, представляет интерес, как возможный иммуномодулятор, поскольку содержит полиспецифические анти-HLA-антитела, способные изменять функциональные свойства иммунокомпетентных клеток.

Известно много способов получения препаратов иммуноглобулинов из сыворотки крови, а именно: фракционирование сульфатом аммония, этанолом, полиэтиленгликолем, риваноловый способ, гель-фильтрация и т. д. (Скоупс Р. // Методы очистки белков. Москва. "Мир". - 1985. - С. 358).

Наиболее близким к предлагаемому способу и потому выбранным в качестве прототипа является способ получения иммуноглобулиновых препаратов путем фракционирования сыворотки сульфатом аммония (Иммунологические методы. Под ред. Фримеля Х. Москва: "Мир". - 1979. - С. 518), при котором 33%-ное насыщение сыворотки сульфатом аммония дает возможность осадить практически все иммуноглобулины фракции G.

К недостаткам прототипа относится недостаточная стабильность получаемого препарата иммуноглобулинов, т. е. значительное снижение их активности в процессе хранения. Кроме того, далеко не каждый препарат, получаемый данным способом из иммунных сывороток, обладает специфической способностью модулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала стабильных иммунорегуляторных препаратов, которые могут быть использованы в лечебных целях.

Технический результат, который может быть достигнут при осуществлении изобретения, состоит в получении стабилизированного (т. е. способного храниться без потери активности в течение по крайней мере 6 месяцев) препарата иммуноглобулинов, обладающего специфическими иммуномодулирующим (а именно иммунодепрессивным) действием, которое связано с тем, что препарат содержит полиспецифические анти-HLA-антитела.

Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем фракционирование сыворотки крови человека сульфатом аммония, отделение осадка, растворение его в буферном растворе с последующим диализом и стерилизацией, согласно изобретению в качестве сырья используют полиспецифические сыворотки, полученные из крови женщин, рожавших более 2-х раз, и содержащие анти-HLA-антитела, а к раствору иммуноглобулинов после диализа добавляют ЭДТА и глюкозу до концентрации 0,7 - 0,9 и 2 - 5% соответственно. Концентрация иммуноглобулинов в растворе при этом соответствует оптимальной концентрации общеизвестных иммуноглобулиновых препаратов и составляет 8 - 10%.

Важно отметить, что наиболее подходящим для фракционирования сывороток, содержащих анти-HLA-антитела, оказался способ, включающий сульфат аммония. Другие способы (фракционирование этанолом, полиэтиленгликолем, риваноловый, гель-фильтрация и др.) оказались менее пригодными, поскольку не обеспечивали получение препарата иммуноглобулинов с достаточным уровнем цитотоксической активности анти-HLA-антител.

Однако полученный с помощью фракционирования сульфатом аммония концентрат иммуноглобулинов, содержащий анти-HLA-антитела, при длительном хранении терял значительную часть цитотоксической активности (табл. 5). Именно поэтому необходим был стабилизатор, позволяющий сохранять активность препарата-иммуномодулятора в течение по крайней мере 6 месяцев. В качестве стабилизатора была использована композиция из глюкозы и ЭДТА в концентрации 2 - 5% и 0,7 - 0,9% соответственно.

Таким образом, существенными признаками заявляемого способа являются следующие:

1) Использование в качестве сырья полиспецифических иммунных сывороток с широким спектром анти-HLA-антител, обладающих, как правило, слабым циторедуктивным действием и подготовленных для выбраковки. Такие сыворотки получают из периферической крови женщин, рожавших более 2-х раз;

2) Добавление к диализованному раствору иммуноглобулинов ЭДТА до конечной концентрации 0,7 - 0,9% для повышения стабильности получаемого препарата;

3) Добавление с этой же целью к раствору иммуноглобулинов глюкозы до конечной концентрации 2 - 5%.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от прототипа тремя вышеприведенными признаками. Следовательно заявляемое решение соответствует такому критерию изобретения, как "новизна", поскольку такой совокупности признаков не известно из уровня техники.

При сопоставлении заявляемого решения не только с прототипом, но и с другими решениями в данной области медицины обнаружено следующее.

Известно, что в качестве сырья для получения препарата иммуноглобулинов, содержащих анти-HLA-антитела, используется плазма больных, иммунизированных трансфузиями аллогенных тромбоцитов (Е.А.Зотиков, В.Н.Мигунов, И.М.Позина и др. // Иммунология. - 1994. - N 6. - С. 22 - 24).

Однако использование данного сырья для получения препарата-иммунорегулятора ограничивается тем, что невозможно смешивание индивидуальных образцов плазмы разных пациентов (т.е. получение пула плазмы, содержащего анти-HLA-антитела), поскольку это приводит к ингибированию цитотоксической активности (Е. А. Зотиков, В.Н.Мигунов // Материалы конгресса "Человек и лекарство". - Москва. - 1995. - С. 137). Именно поэтому весьма затруднительно получить достаточное количество препарата.

Напротив, использование в качестве сырья для получения иммунорегуляторного препарата сывороток женщин, рожавших более 2-х раз, позволяет смешивание индивидуальных образцов сывороток и получение пула в достаточном количестве без потери активности анти-HLA-антител.

Известно, что для стабилизации препаратов иммуноглобулинов добавляют ЭДТА в концентрации от 00,5 mM до 5 mM, преимущественно 0,1 - 3 mM, что примерно составляет 0,015 - 1,46% (WO 93/08837, кл. A 61 K 39/395, 1993).

Также известно, что для целей стабилизации в препараты иммуноглобулинов добавляют глюкозу в концентрации 0,2 - 2% (пат. США N 4692331, кл. 424/85; 530/387, 1980).

Для стабилизации препарата иммуноглобулинов, содержащего анти-HLA-антитела и полученного из сывороток много рожавших женщин, был использован ЭДТА в концентрации 0,7 - 0,9% (как в заявке WO 93/08837) в сочетании с глюкозой в концентрации 2 - 5%. Более низкие концентрации глюкозы (менее 2%, как в пат. США N 4692331) в сочетании с ЭДТА не обеспечивали стабильности полученного препарата в процессе хранения, что возможно объясняется меньшей устойчивостью анти-HLA-антител по сравнению с другими иммуноглобулинами.

Таким образом, в результате сочетания трех существенных признаков возникает способ, который позволяет получить совершенно новый препарат иммуноглобулинов, обладающий высоким модулирующим действием на функциональную активность иммунокомпонентных клеток (за счет присутствия широкого спектра анти-HLA-антител) и, кроме того, стабильный при длительном хранении.

Все это позволяет считать, что предлагаемое изобретение соответствует такому критерию, как "изобретательский уровень".

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Пример 1.

К 10 мл сыворотки, содержащей анти-HLA-антитела, добавляют 5 мл насыщенного раствора сульфата аммония (4,06 М), после 60-минутного инкубирования при t 2 - 4^oC осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 5 мл 0,2 М фосфатного буфера (pH 7,2). Осаждение повторяют 3 раза. Для освобождения от сульфата аммония раствор глобулинов диализуют против 0,02 М фосфатного буфера (pH 7,2) в течение 48 часов при t 2 - 4^oC.

К полученному раствору иммуноглобулинов добавляют глюкозу в конечной концентрации 2% и ЭДТА в конечной концентрации 0,7% для обеспечения стабильности, предотвращения агрегации и сохранения активности анти-HLA-антител.

Конечная концентрация ингредиентов в растворе составляет:

белок - 8%

глюкоза - 2%

ЭДТА - 0,7%

Полученный препарат стерилизуют, пропуская через миллипоровые фильтры, разливают в стерильные флаконы, хранят при t -40^oC, либо подвергают лиофилизации по стандартному режиму.

Пример 2.

Раствор иммуноглобулинов из сыворотки получают в соответствии с примером 1. К полученному раствору иммуноглобулинов, где белок присутствует в концентрации 9%, добавляют для обеспечения стабильности глюкозу в конечной концентрации 3% и ЭДТА в конечной концентрации 0,8%. Конечная концентрация ингредиента в растворе составляет:

белок - 9%

глюкоза - 3%

ЭДТА - 0,8%

Полученный препарат стерилизуют как в примере 1.

Пример 3.

Раствор иммуноглобулинов получают в соответствии с примером 1. К полученному раствору иммуноглобулинов с 10% концентрацией белка добавляют для обеспечения стабильности глюкозу в конечной концентрации 5% и ЭДТА в конечной концентрации 0,9%.

Конечная концентрация ингредиентов в растворе составляет:

белок - 10%

глюкоза - 5%

ЭДТА - 0,9%

Полученный препарат стерилизуют как в примере 1.

Предлагаемый способ позволяет получать стабилизированный препарат иммуноглобулинов, содержащий полиспецифические анти-HLA-антитела и обладающий иммуномодулирующим действием - "Иммунорегуляторный глобулин" (ИРГ).

Характеристика полученного препарата

1. Иммуномодулирующую активность полученного препарата ИРГ на клетки крови человека оценивают с помощью набора стандартных тестов:

А. Метод Е-розеткообразования (Е-РОК);

Б. Метод хемилюминесцентного анализа (ХЛА);

В. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

А. Оценка состояния рецепторного аппарата Т-лимфоцитов методом Е-розеткообразования.

Известно, что Т-лимфоциты несут на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана. Благодаря наличию таких рецепторов Т-лимфоциты способны вступать в реакцию с эритроцитами барана и образовывать так называемые розетки.

Концентрацию лимфоцитов, выделенных в градиенте фиколлверографина, доводят средой 199 до 2 10⁶ /мл. Трижды отмытые эритроциты барана разводят средой 199 до 0,5% концентрации. В лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл клеточной суспензии, в лунки контроля добавляют 50 мкл среды 199, в опытные лунки 50 мкл исследуемого препарата. После инкубации в термостате при 37^oC клетки трижды отмывают средой 199, добавляют 50 мкл среды и 50 мкл 0,5% раствора эритроцитов барана. Планшет инкубируют в течение 10 минут при t+4^oC. В каждую лунку добавляют 0,0025 мл 3% раствора глютарового альдегида на 10 минут. После центрифугирования при 200 g в течение 5 минут глютаровый альдегид удаляют из лунок путем аккуратного стряхивания, к осадку добавляют 0,1 мл дистиллированной воды и готовят мазки.

После высушивания и фиксации этиловым спиртом мазки окрашивают метиловым зеленым, подсчитывают 200 лимфоцитов. За розеткообразующий считают лимфоцит, присоединивший 3 и более эритроцита.

В табл. 1 представлены данные, характеризующие динамику рецепторного аппарат лимфоидных клеток под влиянием препарата ИРГ. Проведенные исследования показали достоверное снижение содержания Е-РОК в популяции лимфоцитов при воздействии ИРГ.

Инкубация лимфоидных клеток в течение 60 минут с иммуноглобулиновым препаратом, содержащим полиспецифические анти-HLA-антитела, приводила к очевидному ингибированию Е-рецепторов на поверхности лимфоцитов. При уменьшении концентрации белка в препарате (разведение ИРГ в 10 и 100 раз) эта тенденция сохранялась : количество Е-РОК снижалось практически в 2 раза.

Таким образом, ИРГ явно снижает количество рецепторов на поверхности лимфоидных клеток и, следовательно, оказывает выраженное иммуносупрессивное (иммуномодулирующее) действие.

5. Метод хемилюминесцентного анализа.

Метод ХЛА является одним из наиболее чувствительных и информативных способов оценки интегрального состояния клетки путем регистрации возбужденных электронных состояний молекул. Степень хемилюминесценции (ХЛ) пропорциональна скорости образования свободных радикалов и отражает функциональный статус объекта.

Метод нашел применение как простой, удобный и объективный тест отбора различных иммуномодуляторов и их клинической эффективности.

Концентрацию лимфоцитов, выделенных в градиенте фиколлверографина (плотность 1.077) доводят раствором Хенкса до 2 10⁶/мл. ХЛ измеряют на приборе "Хемилюминометр" Московского опытного завода (ПУЛ-1). Ответ регистрируют на цифровой шкале и самописцем. В термостатируемую кювету вносят 200 мкл взвеси лимфоцитов, 50 мкл 10 М раствора люминола и регистрируют спонтанную ХЛ, затем добавляют 50 мкл взвеси зимозана, опсонизированного человеческой сывороткой и регистрируют активированную ХЛ. Оценивают количество импульсов спонтанной (адгезия клеток) и активированной (фагоцитоз) ХЛ.

С целью выявления влияния препарата ИРГ на функцию иммунокомпетентных клеток исследовали ХЛ лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови здоровых доноров.

На фиг. 1 представлена динамика образования свободных радикалов в лимфоцитах (интактных и обработанных препаратом ИРГ) до и после активации клеток опсонизированным зимозаном. Характерно, что как спонтанная, так и активированная зимозаном ХЛ лимфоцитов после воздействия ИРГ, достоверно ниже соответствующих показателей в контрольной группе. Следовательно, сенсибилизация клеток анти-HLA-антителами оказывает выраженное цитотоксическое (т.е. иммунодепрессивное) действие на лимфоциты, подавляя в различной степени образование свободных радикалов, что служит явным признаком угнетения внутриклеточных метаболических процессов.

Аналогичные данные получены при изучении ХЛ полиморфноядерных лейкоцитов (интактных и обработанных препаратом ИРГ), вызванной адгезией клеток на пластик и фагоцитозом части опсонизированного зимозана. На фиг. 2 представлены показатели кинетики хемилюминесцентного ответа нейтрофилов в процессе адгезии клеток: в группе контроля пик максимальной ХЛ (2,1 имп/мин) зарегистрирован на 8 минуте с последующим плавным снижением. Для показателей ХЛ нейтрофилов, сенсибилизированных анти-HLA-антителами, характерно отсутствие выраженного максимума хемилюминесцентного ответа и пологое снижение кривой в процессе регистрации - кислородного взрыва" практически до фоновых значений (0,3 имп/мин).

При внесении опсонизированного зимозана пик ХЛ в группе контроля (интактные клетки) наблюдали на 5 мин от начала регистрации процесса фагоцитоза - 10,3 имп/мин - с последующим плавным снижением до первоначальных показателей (0,4 имп/мин) к 30 мин.

Обработка клеток препаратом ИРГ практически полностью подавляла процессы окислительного метаболизма, а, следовательно, и киллинговую активность нейтрофилов.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о наличии высокой модулирующей (а именно супрессивной) активности препарата ИРГ, выражающейся в подавлении функциональной активности процессов иммунокомпетентных клеток человека, что приводит к угнетению процессов клеточного метаболизма.

В. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов с помощью РБТЛ.

Лимфоциты периферической крови способны делиться в ответ на действие поликлональных стимуляторов-митогенов, и этот процесс отражает функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Концентрацию лимфоцитов, выделенных в градиенте фиколлверографина, в стерильных условиях доводят до 2 10⁶/мл средой 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамин, антибиотики (гентамицин). Суспензию разливают по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакций. В лунки контрольных культур добавляют по 130 мкл среды 199, в остальные лунки - по 100 мкл среды и 30 мкл митогена-фитогемагглютинина (ФГА) в оптимальных концентрациях. Каждый вариант культуры занимает по 3 лунки.

Культуры помещают на 48 часов в термостат при 37^oC во влажную атмосферу, содержащую 5% CO₂. После окончания этого срока в каждую лунку вносят 20 мкл раствора H³-тимидина и инкубируют в тех же условиях 24 часа с последующим хранением в течение 24 часов при отрицательной температуре.

Осаждение клеток на стекловолоконные фильтры осуществляют с помощью автоматического сборщика клеток (Harvester). Фильтры высушиваются, затем каждый участок фильтра, на который были осаждены клетки из одной лунки переносится во флакон со сцинтилляционной жидкостью.

Подсчет включения изотопа производят в сцинтилляционном счетчике (импульсы за минуту).

Для определения показателя пролиферативной активности лимфоцитов вычисляется средняя величина включения H³-тимидина в 3-х контрольных, не содержащих митогена, культурах (спонтанная пролиферация - СП), а также средняя величина включения изотопа в 3-х культурах с митогеном (индуцированная пролиферация - ИП).

Учет результатов РБТЛ показал, что спонтанная (нестимулированная) пролиферация клеток в контрольной группе составила в среднем 451,7 (табл. 2). При стимуляции культуры митогеном ФГА в дозе 1 мкг/мл уровень пролиферативной активности Т-лимфоцитов существенно (практически в 3 раза) повышался и составлял 1410,4.

Интенсивность трансформации Т-лимфоцитов в бласты под влиянием препарата ИРГ была несколько ниже по сравнению с контролем - 424,2. Уровень пролиферативного ответа в случае обработки клеток ИРГ и ФГА не превышал 604,7, что практически в 2,5 раза ниже результатов пролиферации лимфоцитов, индуцированной неспецифическим митогеном ФГА.

Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат ИРГ обладает выраженной супрессивной, т.е. модулирующей активностью по отношению к Т-клеточной субпопуляции лимфоцитов периферической крови, что приводит к замедлению активации лимфоцитов, стимулированных митогенами, и угнетению процесса пролиферации клеток.

II. Стабильность и лимфоцитотоксическую активность ИРГ оценивают с помощью стандартного лимфоцитотоксического теста.

В лунки микрокамеры под вазелиновое масло раскапывают по 1 мкл HLA-типирующих сывороток, добавляют 1 мкл суспензии лимфоцитов, выделенных стандартным способом и содержащих 210⁶ клеток.

Инкубируют 30 минут при t +37^oC.

По окончании инкубации в каждую лунку добавляют по 5 мкл комплемента и выдерживают в течение 60 минут при t + 37^oC. Для окрашивания живых клеток в каждую лунку добавляют по 3 мкл раствора зозина и через 5 минут фиксируют реакцию 3 мкл формальдегида.

Микрокамеры оставляют для осаждения клеток при комнатной температуре и через 2 часа проводят учет результатов.

Лимфоцитотоксическую активность (силу реакции) сыворотки оценивают на основании подсчета мертвых и живых клеток по 8-балльной системе: 0-10% мертвых клеток - 0 баллов; 11-20% - 2 балла; 21-50% - 4 балла; 51-80% - 6 баллов; 81-100% - 8 баллов.

Результаты, приведенные в табл. 3, свидетельствуют, что лимфоцитотоксическая активность ИРГ превышает активность исходной полиспецифической сыворотки. Сила реакции ИРГ, в основном, оценивается на 6-8 баллов, высокая сила реакции сохраняется и при разведении препарата в 2 и 4 раза. Наоборот, при разведении сыворотки сила ее реакции начинает снижаться и составляет всего 4-2 балла. Необходимо отметить, что цитотоксическое действие препарат ИРГ оказывает на лимфоциты доноров с совершенно различным HLA-фенотипом (в табл. 3 - 15 доноров), что свидетельствует о возможности широкого использования препарата без предварительного процесса HLA-типирования.

Кроме того, в образцах препарата ИРГ и полиспецифической анти-HLA-сыворотки определяли уровень антител как отношение количества положительно отреагировавших образцов к общему числу исследуемых, выраженное в процентах.

Так, уровень антител (табл. 4), определяемых в цельной пробе препарата, составляет 93,3%, в то время как данный показатель соответствующей анти-HLA-сыворотки не превышает 53,3%. Разведение препарата ИРГ в 2 и 4 раза снижает уровень антител до 86,7 и 33,3%. Анализ соответствующих разведений полиспецифической сыворотки показал практически полную потерю активности образцов, особенно при разведении 1:2 (6,7%).

В табл. 5 представлены данные, характеризующие стабильность анти-HLA -антител в процессе хранения в препарате ИРГ при наличии и отсутствии стабилизирующих ингредиентов (ЭДТА и глюкоза). Так, через 6 месяцев хранения в препарате ИРГ, содержащем стабилизатор (в данном случае 3% глюкозы и 0,8% ЭДТА), сила реакции антител оставалась практически неизменной и оценивалась на 6-8 баллов. В то время как при отсутствии стабилизатора через 6 месяцев хранения лимфоцитотоксическая активность препарата не превышала 2-4 балла. Анализ уровня антител (табл. 6) показал, что в препарате ИРГ, содержащем стабилизатор после 6 месяцев хранения отмечено незначительное снижение уровня антител (на 6,6%) по сравнению с исходными данными, в то время как при отсутствии стабилизирующих ингредиентов уровень антител снижался практически на 33,3%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить стабилизированный иммунорегуляторный препарат, представляющий собой концентрат анти-HLA-антител. Этот препарат может быть использован для иммунодепрессивной терапии онкологических, гематологических и аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки, тромбоцитопенической пурпуры, аутоиммунного гломерулонефрита и др.), а также при трансплантации органов и тканей для предупреждения отторжения трансплантата, связанного с иммунологической несовместимостью донора и реципиента.

Учитывая, что предлагаемый способ прост в исполнении, а получаемый с его помощью препарат является стабилизированным иммунодепрессантом, необходимым для лечения многих заболеваний, есть основание полагать, что предлагаемый способ будет использован в производстве препаратов из крови человека, что позволит утилизировать такое ценное сырье, как полиспецифические анти-HLA-сыворотки с низкой цитотоксической активностью, получаемые из крови много рожавших женщин.