способ изготовления фильтра для табачного дыма, фильтр, сигарета, способ фильтрования табачного дыма

Формула изобретения

1. Способ изготовления фильтра для табачного дыма, содержащего волокнистую матрицу, обогащенную биологическим веществом, отличающийся тем, что он предусматривает пропитку фильтрующего материала одним или более биологическими веществами, содержащими комплекс железа с порфириновым кольцом и железо, стереоспецифически связанное с белковыми молекулами, и фильтрацию пропитанного материала для удаления любых неабсорбированных биологических веществ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологическое вещество используют в концентрации 1 - 10 мг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе с pH 7,4.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что пропитку фильтрующего материала биологическим веществом проводят в течение 30 мин при комнатной температуре.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрующий материал содержит активированный уголь, обогащенный биологическим веществом.

5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что биологическое вещество включает в себя гемоглобин и/или лизат эритроцитов.

6. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что биологические вещества выбирают из ионов железа Fe²⁺, стереоспецифически связанных с одним или несколькими материалами, выбранными из трансферина, каталазы, протопорфирина, цитохрома С и хлорофилла.

7. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что указанную обогащенную волокнистую матрицу вводят в конструкцию фильтра табачного дыма, в которой она граничит с волокнистой матрицей, не обогащенной биологическим веществом.

8. Фильтр, полученный способом по любому из пп.1 - 7.

9. Сигарета, отличающаяся тем, что снабжена фильтром, полученным способом по любому из пп.1 - 7.

10. Способ фильтрования табачного дыма, предусматривающий обеспечение фильтра, получаемого способом по любому из пп.1 - 7, и пропускание через него табачного дыма.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что фильтр задерживает 15 - 90% NO, 10 - 90% CO, 40 - 90% свободных радикалов, 10 - 90% альдегидов, 10 - 90% канцерогенных нитрозосоединений, 15 - 90% H₂O₂ и 50 - 95% микроэлементов, содержащихся в табачном дыме до его прохождения через фильтр.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что фильтр задерживает 85 - 90% NO, 80 - 90% CO, 60 - 90% свободных радикалов, 60 - 90% альдегидов, 60 - 90% канцерогенных нитрозосоединений, 60 - 90% H₂O₂ и 70 - 95% микроэлементов, содержащихся в табачном дыме до его прохождения через фильтр.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам предотвращения вдыхания вредных материалов, а именно: окислов азота, свободных радикалов, альдегидов, перекиси водорода, моноокиси углерода, микроэлементов и канцерогенных летучих нитрозосоединений, во время курения сигарет, то есть таких материалов, которые до настоящего времени неудовлетворительно задерживаются применяемыми сигаретными фильтрами (см. , например, PCT/ 82/02820, кл. A 24 D 3/14, 1982, в которой описан сигаретный фильтр, содержащий волокнистую матрицу, обогащенную биологическим веществом).

Во многих публикациях в международных журналах высказывается предположение, что сигаретный дым разделяется на две фазы: а) твердая фаза (смола) и б) газовая фаза. Такое разделение производят с использованием типичного фильтра из кембриджскго стекловолокна, который задерживает 99,9% частиц с размерами более 0,1 мкм. Смола сигаретного дыма содержит в исключительно высоких концентрациях очень стойкие свободные радикалы, которые можно классифицировать по меньшей мере на четыре различные категории.

Частичные хиноны в равновесии с хиноном и гидроксихинонами рассматривают как свободные радикалы, обладающие большинством интересных химических свойств. Хиноновая система восстанавливает молекулярный кислород с образованием высшего окисла O₂, который затем при самопроизвольной дисмутации образует перекись водорода H₂O₂. С каждой затяжкой в газовой фазе вдыхают более 10¹⁵ органических радикалов с периодом полураспада менее 1 с. Однако парадоксально то, что несмотря на столь незначительный период полураспада, такие радикалы в газовой среде способны сохранять высокий уровень активности в течение более 10 мин. В самом деле, по мере приближения к снабженному фильтром концу сигареты концентрация этих радикалов значительно возрастает. Объяснение этому парадоксу следует искать в сохранении устойчивости ситуации благодаря непрерывному образованию свободных радикалов (Pryor, W.A., Stone., Ann. N.Y. Acad.Sci. 686: 12-28, 1993).

В газовой фазе сигаретного дыма самым важным свободным радикалом является окись азота (NO), которая в процессе курения принимает участие в последовательности реакций, в результате которой образу.тся двуокись азота, изопреновые радикалы, перекисные и алкоксильные радикалы. Сигаретный дым включает в себя также существенное число альдегидов, которые вносят свою лепту в его вредные токсические эффекты. Было показано, что незначительные количества альдегидов, экстрагированных из сигаретного дыма, вызывают как катаболизм белка, так и окисление тиоловых групп белков плазмы. Эти свойства, приписываемые альдегидам, являются результатом реакций между карбонильной группой альдегидов и -SH- и - NH₂ группами белков плазмы. Так, например, акролеин, содержащийся в сигаретном дыме, быстро реагирует -SH группами с образованием карбонильных соединений (Alving, K., Forhem, C. и Lundberg, J.M., Br. J. Pharmacol. 110: 739-746). В смоле сигаретного дыма находятся микроэлементы, например железо, медь, марганец и кадмий, которые вовлекаются во многие реакции с образованием свободных радикалов и обуславливают образование очень активных вторичных радикалов (например, перекисных радикалов, алкоксирадикалов, высших окислов, цитотоксичных альдегидов и т.п.). Попадание таких микроэлементов в легкие во время курения сигарет ведет к ряду окислительно-восстановительных реакций как в легочных жидкостях, так и в альвеолярных макрофагах, в результате чего образуются очень активные гидроксильные радикалы (OH-). Эти гидроксильные радикалы образуются главным образом в присутствии железа вследствие реакции Фентона. Медь также способна образовывать в легких гидроксильные радикалы благодаря реакции с перекисью водорода. В низких концентрациях (10^-7 м) марганец усиливает деятельность растворимой гуанилатциклазы эндотелиальных клеток легкого, вызывая образование окиси азота и высшего окисла благодаря механизму позитивной ответной реакции (Youn, Y. K. , Lalonde, C. и Demling, R., Free Rad. Biol. Med. 12: 409-415, 1992). Во время сгорания табака образуется моноокись углерода. Некоторое количество моноокиси углерода задерживается в легких даже после выдоха, что приводит к усилению деятельности растворимой гуанилатциклазы после ее взаимодействия с гемовым остатком энзимов эндотелиальных клеток и других клеток легочной ткани. Повышенное содержание циклического ГМФ внутри клеток в сочетании с механизмом позитивной ответной реакции усиливает образование окиси азота и высшего окисла (Watcon, A., Joyce, H., Hopper, L. и Pride, N. B. , Thorax 48: 119-124, 1993). Газообразная окись азота, которая может продуцироваться клетками многих типов, включая сюда эндотелиальные клетки сосудов и сетчатые эндотелиальные клетки, вызывает расслабление гладкой мышцы (Lowenstein, C.J., Dinerman, J.L., Snyder, S.H., Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). Существуют также экзогенные источники окиси азота, которые аналогично вышеуказанным считают ответственными за повреждение кровеносных сосудов и других тканей. Было с уверенностью установлено, что вторичные и третичные амины способны вступать в реакцию с нитритом и другими агентами нитрозирования с образованием N-нитрозоаминов (Lowenstein, C.J., Dinerman, J.L., Snyder, S.H., Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). С 1974 г. результаты ряда исследований продемонстрировали, что во время сбора урожая, обработки табака и курения алкалоиды подвергаются нитрозированию до специфических для табака N-нитрозаминов (CTHA). Из идентифицированных в табаке и/или его дыме CTHA N-нитрозононикотин (NHH), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (НПБ) и 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол (НАПБ) являются сильными канцерогенами для животных. NHH индуцирует образование опухоли легких у мышей, опухоли трахей у хомяков и опухолей носовой полости и пищевода у крыс. НПБ индуцирует новообразование в легких у мышей, хомяков и крыс, а также новообразования в печени, носовой полости и поджелудочной железе у крыс. Тампонада слизистой оболочки рта с использованием смеси NHH и НПБ вызывает у крыс образование опухолей в полости рта и легких. Типичное количество как НПБ, так и NHH у большинства сигарет составляет 200 нг/сигарету (Hecht, S. S. , Spratt, T.E. и Trushin, N. Carcinogenesis, 9: 161-165, 1988).

Проведенное авторами изобретения в настоящее время исследование, касающееся влияния сигаретного дыма на легочную ткань, позволило установить, что окись азота вступает в реакцию с высшим окислом с образованием радикала пероксинитрита (ONOO^-) с сильной окислительной способностью, который вызывает в ключевых биомокулелах вторичные вредоносные реакции. Как метаболическое, так и поражающее действие окиси азота на клетки было изучено в лаборатории авторов изобретения in vitro и в экспериментах с живыми существами.

Окись азота в присутствии кислорода окисляется до двуокиси азота (NO₂). Скорость такого окисления зависит от концентрации кислорода и квадрата концентрации окиси азота. Цитотоксичность двуокиси азота очевидна, а в водных растворах она превращается в нитрит и нитрат. Более того, окись азота образует с микроэлементами и/или металлобелками, например с гемоглобином, комплексы (Wink, D.A., Darbyshire, J.F., Nims, R.W., Saavedra, J.E. и Ford, P.E., Chem. Res. Toxicol., 6: 23-27, 1993).

Токсичность высших окислов некоторых типов объясняется тем, что окись азота реагирует с этими высшими окислами с образованием вредного соединения ONOO^-. ONOO^- является необычно стойким соединением, принимая во внимание его сильный окислительный потенциал (+1,4 В). В процессе его разложения оно образует сильноокислительные производные, включая сюда гидроксильную группу, двуоокись азота и нитрониевый ион. Таким образом, любая модификация в процессе образования тканями окиси азота и высшего окисла может привести к образованию вторичных сильноокислительных радикалов (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., Cancer Mol. Biol., 1: 77-86, 1994). Наконец ONOO^- и его сложные эфиры (RO-ONO или RO-ONO₂) проявляют тенденцию к инактивации ингибиторов альфа-1-протеиназы (Иа1П). Это может быть подтверждено тем фактором, что а) одна перекись водорода не вызывает быстрой инактивации Иа1П, но действует только в присутствии окиси азота, в результате чего образуется ONOO^- и происходит быстрая инактивация Иа1П, б) растворы трет.бутилпероксинитрила (R-O-O-NO₂) или ONOO^- сам вызывает инактивацию Иа1П и в) амины и аминокислоты защищают Иа1П-протеиназу от быстрой инактивации (Moreno, J. J. Pryor, и W.A., Chem. Res. Toxicol. 5: 425-431, 1992). Помимо свободных радикалов, содержащихся в сигаретном дыму, активированные альвеолярные макрофаги составляют другой важный источник продуцирования курильщиками свободных радикалов. Альвеолярные макрофаги, актикированные сигаретным дымом, испытывают респираторный импульс, что приводит к увеличению образования кислородсодержащих свободных радикалов (главным образом O₂-, NO и H₂O₂). У курильщиков, по-видимому, имеется увеличенное число как альвеолярных макрофагов, так и циркулирующих нейтрофилов. Кислородсодержащие свободные радикалы сигаретного дыма также участвуют в развитии рака легких. Вдыхаемый сигаретный дым оказывает на легочные клетки усиленную окислительную нагрузку, приводящую к снижению концентрации внутриклеточных антиоксидантов. Через образование гидроксильных групп перекись водорода вступает в реакцию с ДНК клеток и вызывает разрыв двойной нити. Поскольку этот разрыв может быть предотвращен присоединением каталазы, это косвенно подтверждает повреждающее действие перекиси водорода и гидроксильных групп на клеточную ДНК (Leanderson, P., Ann N.Y. Acad. Sci. 686: 249 - 261, 1993). Более того, перекись водорода способна вызывать преобразование в трахейном эпителии легкого, и с ней связано развитие бронхогенной карциномы у курильщиков. Таким образом, вредная для здоровья роль перекиси водорода (содержащейся в сигаретном дыму), которую она играет в легочных клетках и в развитии рака легких занимает прочное положение в сознании. Смола сигаретного дыма содержит как семихиноновые радикалы, так и железо, образующие, таким образом, систему для продуцирования гидроксильных радикалов. Различные микроэлементы, содержащиеся в смоле сигаретного дыма (железо, медь, марганец, кадмий) могут оказывать как внутриклеточное, так и внеклеточное действие. Fe²⁺ в ходе протекания хорошо известной реакции Фентона

Fe²⁺ + H₂O₂ ---> Fe³⁺ + OH + OH^-

благодаря гидроксильным группам вызывает множество окислительных реакций. Аналогичным образом продуцирование гидроксильной группа может быть достигнуто посредством Co²⁺. Mn²⁺ является характерным стимулятором активности растворимой гуанилатциклазы. Содержащийся в сигаретном дыму Cd²⁺ исключительно токсичен для легких. Курильщики содержат в своих легких Cd²⁺ в концентрации, которая, по-видимому, вдвое превышает обычную. Полагают, что Cd²⁺ вытесняет Zn²⁺, который в обычном состоянии присутствует в эндотелии легочных сосудов (Kostial, K. , в работе "Trace Elements in Human and Animal Nutrition" (под редакцией W. Mertz), издание пятое, том 2: 319 - 345, издательство Academic Press, Inc., Орландо, штат Флорида, 1986). Альдегиды, содержащиеся в сигаретном дыму, вступают в реакцию с группами -SH и -NH₂ белков, становясь в конечном итоге инертными. Кротоновый альдегид (,- ненасыщенный альдегид), содержащийся в сигаретном дыму, снижает концентрацию -SH групп и повышает концентрацию карбонилсодержащих белков (Stadtman, E.R., Science, 257: 1220 - 1224, 1991).

Сегодня применение сигаретных фильтров настоятельно рекомендуется. Первичной целью добавления фильтров к сигаретам является достижение максимальной степени задержания вредных соединений, присутствующих как в газовой, так и твердой фазах сигаретного дыма. Эпидемиологическое изучение курильщиков показало, что независимо от того, вводили ли сигаретный дым в организм в газовой фазе, твердой фазе или в комбинированной фазе, наблюдалась зависящая от дозы реакция (Surgeon General of the U.S. Public Health Service. The health consequences of using smokeless tobacco, N.H. Publ. N 86: 2874, Бетезда, штат Мэриленд, 1986 г.). Было доказано, что уже сама по себе модификация сигареты является практическим шагом к решению проблемы снижения содержания вредных соединений в сигаретном дыму. Этого первоначально достигали с использованием обычных фильтров, а затем изменением состава табака в процессе химической обработки. В процесс изготовления сигарет изменения были также внесены с использованием пористой бумаги или бумаги, изготовленной из табачных листьев. За последние 15 лет было сделано множество попыток сделать курение менее вредным для здоровья путем уменьшения количества дыма на сигарету, изменения диаметра сигареты и применения перфорированных фильтров. Перфорированные фильтры позволяют разбавлять сигаретный дым воздухом в степени, достигающей 50%. В сочетании с перфорированными фильтрами используют также активированный уголь. Это содействует резкому снижению содержания в дыме смолы и никотина. К таким техническим приемам прибегают, в частности, в таких промышленно развитых странах, как Австрия, Канада, Франция, германия, Швеция, Англия и США. Средний выход смолы и никотина в дыму американской сигареты был снижен соответственно с 38 и 2,7 мг в 1955 г. до 13 и 1 мг в 1991 г. В странах Европейского сообщества эта тенденция к снижению выхода смолы и никотина в сигаретном дыму все еще продолжается. В январе 1993 г. верхний допустимый предел для смолы составил 15 мг, а к началу января 1998 г. он должен быть снижен до 12 мг. Тем не менее в других странах выход смолы в сигаретном дыму составляет 22 мг (Mitacek, E.J., Brunneman, K.D. Pollednak, A.P., Hoffman, D. u Suttajit, M., Prev. Med. 20: 764 - 773, 1993). Изменения, внесенные в процесс изготовления сигарет, привели к удалению из сигаретного дыма некоторых конкретных токсических веществ; более конкретно были внедрены фильтры из ацетата целлюлозы, что обеспечило, таким образом, частичное удаление полулетучих фенолов и летучих N-нитрозаминов (Brunneman, K. D. , Hoffman, D., Recent. Adv. Tobacco Res. 17: 71 - 112, 1989). Количество моноокиси углерода селективно снижают применением перфорированных фильтров. Концентрацию канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) селективно снизили использованием табака, обогащенного нитритом. Однако снижение ПАУ в табаке с использованием высоких концентраций нитрита привело к нежелательному повышению концентрации канцерогенных N-нитрозаминов, поэтому оказалось необходимым уменьшать содержание ПАУ другими средствами [Hoffman, D. , Hoffman, I., Wynder, E. L., Lung Cancer and the Changing Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-compounds, Tobacco Smoke and Mycotoxins. (под редакцией O"Neil, I.K., Chen., J. и Bartsch, H.), том 105: 449 - 459, 1991 г.]

Из вышеизложенного ясно, что существует необходимость в создании фильтра, способного задерживать вредные окислы азота, свободные радикалы, перекись водорода, альдегиды и концерогенные нитрозосоединения, которые ответственны за вредные эффекты сигаретного дыма на дыхательную и сердечно-сосудистую системы. Для идентификации вредных соединений, содержащихся в сигаретном дыму, авторы изобретения провели химические и биологические эксперименты. Проведенные химические эксперименты включают в себя следующее:

а) Идентификация и количественное определение NO и NO_x с помощью нового химического и биологического метода (этот метод был разработан в лаборатории авторов изобретения).

б) Идентификация свободных радикалов с применением методов хемолюминесценции в зависимости от люцигенина.

в) Идентификация альдегидов и хинона путем стимулирования энзиматической системы люциферин-люциферазы (этот метод также был разработан в лаборатории авторов изобретения).

г) Идентификация и количественное определение микроэлементов с применением метода окисления люциферина люциферазой в присутствии АТФ (этот метод был разработан в лаборатории авторов изобретения).

д) Идентификация и количественное определение перекиси водорода с использованием метода хемолюминесценции в зависимости от изолюминолмикропероксидазы.

е) Идентификация и количественное определение ONOO^- спектрофотометрическим анализом и по методу усиленной люминолом хемолюминесценции.

ж) Идентификация канцерогенного нитрозосоединения усиленной люминолом хемолюминесценции.

Проведенные биологические эксперименты охватывают следующее:

а) Идентификация окиси азота с использованием изолированной активности растворимой гуанилатциклазы в качестве функционального параметра.

б) Идентификация ONOO^- путем расчета окислительной нагрузки на эритроциты человека, вызванной ONOO^-.

в) Идентификация моноокиси углерода с использованием изолированной активности растворимой гуанилатциклазы в качестве функционального параметра.

Более того, авторы изобретения в лабораторных условиях провели нижеследующие эксперименты:

а) Изоляция альвеолярных макрофагов из легких крыс.

б) Расчет окислительной нагрузки на альвеолярные макрофаги, индуцированной гидроперекисью трет-бутила (ГПтБ).

в) Определение NO/NO₂- /ONOO^-, продуцированных альвеолярными макрофагами.

г) Определение перекиси водорода, продуцированной альвеолярными макрофагами.

д) Влияние экзогенной перекиси водорода на продуцирование окиси азота альвеолярными макрофагами.

На добровольцах провели эксперименты in vivo для определения нижеследующих соединений:

а) Определение окиси азота в воздухе, выдыхаемом обычными людьми.

б) Определение окиси азота в воздухе, выдыхаемом курильщиками.

в) Определение окиси азота в выдыхаемом сигаретном дыму.

г) Определение ONOO^- в выдыхаемом сигаретном дыму.

д) Определение свободных радикалов в выдыхаемом сигаретном дыму.

е) Определение альдегидов в выдыхаемом сигаретном дыму.

Для определения NO, NO_x, а) содержавшихся в сигаретном дыму, б) выделенных альвеолярными макрофагами после введения сигаретного дыма и в) содержавшихся в сигаретном дыму, выдыхаемом добровольцами, авторами изобретения была сконструирована и изготовлена камера диаметром от 2,5 см, образованная твердыми стержнями из прозрачного плексигласа, с одного конца каждого из которых на механическом токарном станке выполнили отверстия для создания идентичных конических полостей в каждом из таких плексиглазовых стержней. Далее их открытые концы подвергали дополнительной механической обработке и полировке, выполнив соединение между сопряженными коническими элементами, которое позволило очень плотно подгонять и соединять друг с другом обе конические полости. Между соединяемыми элементами в качестве прокладки проложили квадрат из тонкого листового тефлона (политетрафторэтилена толщиной 0,0015 дюйма, 0,038 мм), после чего элементы прижали друг к другу с помощью винтов с накатанными головками. По две трубчатые детали, обеспечивающие доступ с любой из сторон мембраны, позволяли в ходе протекания биологических реакций вводить внутрь, извлекать или модифицировать с любой из сторон мембраны биологически активные образцы и реакционно-способные вещества (фиг. 1).

A) Определение окиси азота хемолюминесценцией.

В соответствии с литературными рекомендациями [Deliconstantion, G., Villiotou, V., Fassitsas, C., (1992) J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65] и [Deliconstantinos, G. , Villotou, V., Stavrides, J.C., (1994) в работе "Biology of Nitric Oxide", под редакцией Feelish M., Busse, R., Moncanda, S. , Portland Rress, в печати] готовили стандартный раствор окиси азота. Реакционный раствор содержал сбалансированный солевой раствор Хэнка (ССРХ) с величиной pH 7,3; 500 мкМ перекиси водорода; 30 мкМ люминола, а его общий объем составлял 500 мкл. Содержание склянки подвергали интенсивному перемешиванию, а выделявшийся материал фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953.

Б. Химическое определение NO/NO^-₂.

Химическое определение окиси азота было основано на диазолизации сульфаноламида окисью азота при кислой величине pH и последующем окислении скополетина, которое может быть определено флуореметрическим путем согласно описанному выше (Deliconstantion, G., Villiotou, V., Fassitsas, C.J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65, 1992). Альвеолярные макрофаги в ССРХ (по 10⁶ клеток/мл) смешивали со 100 мкл реагента, который состоял из 20% сульфаниламина в 20% ортофосфорной кислоты и 25 мкМ скополетина. За затуханием флуоресценции следили при комнатной температуре (22^oC) с помощью спектрофотометра флуоресценции Aminco SPF-500. За флуоресценцией следили непрерывно в течение всего времени до тех пор, пока можно было измерять тангенс угла наклона линии (приблизительно 8 мин). Далее результаты измерения тангенса угла наклона трансформировали в нмоли окиси азота с помощью стандартной кривой, построенной для различных концентраций чистой окиси азота. Нитрит (NO₂-), конечный продукт синтеза окиси азота определяли на основе его накопления в супернатантах культивированных клеток по его реакции с реактивом Грисса.

В. Спектрометрическое определение пероксинитрита (ONOO^-).

ONOO^- синтезировали, титровали и хранили в соответствии с ранее описанным [Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., в работе "Biology of nitric oxide" (под редакцией Fellisch, M., Busse, R., Moncanda, S.) Portland Press (в печати)]. Вследствие нестабильности ONOO^- при величине pH 7,4 УФ-спектрограмму фиксировали непосредственно после смещения перекиси водорода с раствором окиси азота. Концентрацию ONOO^- определяли на основе величины эпсилон-302 нм для 1670 м^-1см^-1. УФ-спектрограмма показана после вычитания базальной УФ-спектрограммы для соответствующих концентраций перекиси водорода.

Г. Расчет свободных радикалов.

Расчет свободных радикалов производили с использованием хемолюминесценции, индуцированной люцигенином/ДАМЦО (1,4-диазадицикло-(2,2,2)-октаном в соответствии с ранее изложенным (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis., 1: 22-27, 1993). Реакционная смесь содержала ССРХ с величиной pH 7,4; 30 мкМ люцигенина; 100 мкМ ДАМЦО. Содержание склянки подвергали интенсивному перемешиванию, а выделявшийся материал фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953. Использовали поглотители кислородсодержащих свободных радикалов (ПОД, маннит, гистидин, метионин).

Д. Расчет микроэлементов и альдегидов.

Испытания были основаны на катализируемом люциферазой окислении D-люциферации в присутствии АТФ-магниевой соли в соответствии со схемой реакции



Микроэлементы Cd²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ повышают активность люциферазы, и максимальная хемолюминесцентная реакция возрастает пропорционально концентрации микроэлементов вплоть до 10 мкг. Такие реакции проводят в ССРХ с величиной pH 7,4 при общем объеме 0,5 мл.

Для расчета альдегидов использовали ту же энзиматическую систему люциферин/люцифераза, но без АТФ. Альдегиды вступают в реакцию с этой энзиматической системой, производя хемолюминесценцию в отсутствии АТФ. Испытуемые реактивы брали из комплекта для АТФ анализа (Calbiochem-Novabiochem CA, U.S. A).

Е. Изолирование альвеолярных макрофагов.

Крыс убивали внутривенной инъекцией пентобарбитала натрия, вскрывали грудную клетку, легкие перфузировали для освобождения от крови свободным от Ca²⁺ холодным (4^oC) физиологическим раствором, содержавшим фосфатный буфер (РФБ: pH 7,4), и удаляли в неповрежденном виде из полости грудной клетки. Повторным извлечением ткани через шприц и затем ее пропусканием через установленные последовательно, в порядке уменьшения размера ячеек, сетки из нержавеющей стали с числом отверстий на дюйм соответственно 32, 62 и 68 в условиях постоянного потока сбалансированного солевого раствора Финкельштейна (ССРФ; с величиной pH 7,4) готовили гомогенат легкого крысы. Конечную суспензию альвеолярных макрофагов отстаивали, фильтровали и центрифугировали при 300g в течение 10 мин до образования в пробирке осадка клеток. Осадок из клеток, который содержал более 98% макрофагов, промывали и повторно суспендировали в растворе Рингера. Далее эту процедуру повторяли дважды. На каждую крысу приходилось приблизительно по 1010⁸ изолированных макрофагов. Жизнеспособность определяли по методу исключения с трипаном голубым.

Ж. Идентификация нитрозосоединений.

Нитрозосоединения идентифицировали по медленному выделению окиси азота (NO) после их обработки перекисью водорода. Реакционный раствор содержал 1 мкМ диметилнитрозамина и/или диэтилнитрозамина; 500 мкМ перекиси водорода, 30 мкМ люминола в ССРХ при величине pH 7,4, а его общий объем составлял 0,5 мл. Содержимое склянки подвергали интенсивному перемешиванию, а выделявшийся материал фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953. Для идентификации образования ONOO^- использовали 100 мМ маннита; 100 мМ ДМСО и 3,0 мМ цистеина.

З. Изолирование альвеолярных макрофагов.

Крыс убивали внутривенной инъекцией пентобарбитала натрия, вскрывали грудную клетку, легкие перфузировали для освобождения от крови свободным от Ca²⁺ холодным (4^oC) физиологическим раствором, содержавшим фосфатный буфер (РФБ; pH 7,4), и удаляли в неповрежденном виде из полости грудной клетки. Повторным извлечением ткани через шприц и затем ее пропусканием через установленные последовательно, в порядке уменьшения размера ячеек, сетки из нержавеющей стали с числом отверстий на дюйм соответственно 32, 62 и 68 в условиях постоянного потока сбалансированного солевого раствора Финкельштейна (ССРФ; с величиной pH 7,4) готовили гомогенат легкого крысы. Конечную суспензию альвеолярных макрофагов отстаивали, фильтровали и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин до образования в пробирке осадка клеток. Осадок из клеток, который содержал более 98% макрофагов, промывали и повторно суспендировали в растворе Рингера. Далее эту процедуру повторяли дважды. На каждую крысу приходилось приблизительно по 1010⁸ изолированных макрофагов. Жизнеспособность определяли по методу исключения с трипаном голубым.

И. Окислительная нагрузка на альвеолярные макрофаги, индуцированная гидроперекисью трет.бутила (ГПтБ).

Продуцирование кислородсодержащих свободных радикалов альвеолярными макрофагами, индуцированное 2,5 мМ ГПтБ, определяли с использованием метода люминольной хемолюминесценции. Хемолюминесцентную реакцию фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953 согласно изложенному ранее (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis., 1: 22-27, 1993).

К. Определение перекиси водорода (H₂O₂).

Готовили изолюминол/микропероксидазную смесь (100 нМ бората натрия, 1 мМ изолюминола, 0,01 мМ микропероксидазы в 70% воды и 30% метанола при величине pH 8). 50 мкл этого реактива смешивали с изолированными альвеолярными макрофагами (10⁶ клеток) в ССРХ при общем объеме 0,5 мл. Данные хемолюминесцентной реакции конвертировали в нмоли перекиси водорода с использованием стандартной кривой, построенной для различных концентраций чистой перекиси водорода.

Л. Получение и очистка растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) для определения моноокиси углерода.

рГЦ из эндотелиальных клеток человека очищали ГТФ-агарозной хроматографией. Цитозоли (10 мг белка) вводили в ГТФ-агарозную колонку (1,8 х 9 см) после предварительного приведения в состояние равновесия 25 мМ трис-HCl буфером с величиной pH 7,6, содержащим 250 мМ сахарозы и 10 мМ MnCl₂. Затем рГЦ элюировали из колонки 5 мл уравновешивающего буфера плюс 10 мМ ГТФ.

М. Определение циклического ГМФ.

Концентрацию цГМФ определяли радиоиммунным анализом после ацетилирования образцов уксусным ангидридом (Deliconstantinos, G., и Kopeikina, L., Anticancer Res. 9: 753-760, 1989). Реакционная смесь содержала 50 мМ триэтаноламина/HCl, 5 мМ креатинфосфата; 3 мМ хлорида магния; 1 мМ изобутилметилксантина; 0,6 ед. креатинкиназы; 1 мМ ГТФ и растворимую гуанилатциклазу (1 мкг белка) при общем объеме 150 мкл. Добавлением ГТФ инициировали реакции и инкубировали 10 мин при 37^oC. Питательную среду аспирировали и цГМФ экстрагировали добавлением охлажденной льдом 0,1М соляной кислоты. По истечении 10 мин образцы переносили в новую чашку Петри, сушили и для определения цГПФ вновь восстанавливали влагосодержание добавлением 5 мМ ацетата натрия (при величине pH 4,75). Образовавшуюся цГМФ определяли с использованием комплекта для цГМФ анализа (AmerSham).

Целью изобретения является разработка и применение способов, при осуществлении которых используют биологические вещества, вступающие в специфические реакции и обеспечивающие поглощение нижеследующих материалов:

а) NO и NO_x;

б) моноокиси углерода;

в) перекиси водорода;

г) свободных радикалов;

д) альдегидо-хинонов;

е) канцерогенных нитрозосоединений и

ж) задерживающие микроэлементы: кадмий, медь, марганец, железо и тому подобное, которые вдыхают при курении.

Сущность изобретения в значительной мере основана на знании того, что:

а) имеется выбор соответствующих поглотителей, подобных гемоглобину или лизатам эритроцитов, или любому веществу, которое содержит стереоспецифически связанное железо;

б) существует выбор поглотителей, которые содержат порфириновое кольцо с железом (например, протопорфирин);

в) существует выбор поглотителей, включающих в себя порфириновое кольцо, которое устраняет необходимость в присутствии железа;

г) имеется выбор поглотителей, которые содержат порфириновое кольцо в комплексе с другими металлами, например с Mg²⁺, Cu²⁺,

д) должен быть разработан биотехнический способ обогащения обычных материалов, используемых в настоящее время для изготовления сигаретных фильтров, которые в результате должны содержать вышеупомянутые биологические вещества-поглотители.

Основная идея настоящего изобретения заключается в концентрации, согласно которой пропитка обычно применяемых сигаретных фильтров и/или фильтров, содержащих активированный уголь, может быть обогащена биологическими веществами, характеризующимися присутствием металлических ионов Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, образующих комплекс с порфириновым кольцом, а также Fe²⁺, стереоспецифически связанного с белковыми молекулами, благодаря чему обеспечивается задержание вредных соединений, содержащихся в сигарете, до вдыхания курильщиком сигаретного дыма. Этот факт является основной характеристикой настоящего изобретения и составляет неоспоримое нововведение с большой вероятностью промышленного применения.

Настоящее изобретение создавали, следуя путем, который позволил бы ему найти применение на уровне промышленного производства.

Готовили раствор 1 мг/мл гемоглобина и/или лизата эритроцитов в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РФБ) с величиной pH 7,4 и его добавляли к 100 мг активированного угля. Смесь инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и фильтровали через фильтровальную бумагу S & S Carl Schleicher & Schuell Co U.S.A. По данным спектрофотометрического анализа фильтрата рассчитывали количество неабсорбированного гемоглобина. Уголь, обогащенный гемоглобином, оставляли сохнуть при комнатной температуре. 200-миллиграммовое количество угля, обогащенного гемоглобином, в виде прокладки помещали между двумя обычными фильтрами таким образом, что весь сигаретный дым, который через них аспирировали, входил в контакт с активными группами молекул (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂) (фиг. 2). После этого такие совместимые материалы были готовыми к использованию для изготовления новых сигаретных фильтров, которые авторы изобретения с данного момента называют биологическими фильтрами.

В другом варианте гемоглобин может быть заменен биологическими веществами, характеризующимися присутствием металлических ионов Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, образующих комплекс с порфириновым кольцом, а также Fe²⁺, стереоспецифически связанного с белковыми молекулами, в частности такими, как трансферин, каталаза, протопорфирин, цитохром C, хлорофилл.

В другом варианте готовили раствор 5 мг/мл гемоглобина и/или лизата эритроцитов в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РФБ) с величиной pH 7,4 и его сканировали при 25^oC с использованием самопишущего спектрофотометра Acta Beckman. Пики поглощения наблюдали соответственно при 540 и 575 нм (Smith, R.R., Kruszyma, H.J. Pharmacol. Exper. Ther. 191, 557-563, 1974). Обычно применяемые сигаретные фильтры пропитывали этими растворами и сушили на воздухе при 25-35^oC. После этого такие совместимые материалы были готовыми к использованию для изготовления новых сигаретных фильтров, на которые авторы изобретения с данного момента ссылаются как на биологические фильтры. Эти новые биологические фильтры обеспечивают прохождение вдыхаемого дыма в полном контакте с активными группами молекул гемоглобина и/или лизатов, находящихся в фильтре, без изменения физических свойств или вкуса сигаретного дыма. По эстетическим причинам видимый конец биологического фильтра можно нарастить небольшим участком (3 мм) обычного фильтра.

В соответствии с применяемыми для промышленного изготовления альтернативными способами предусмотрено нижеследующее.

Готовили раствор 5 мг/мл протопорфирина в растворе с фосфатным буфером (РФБ) с величиной pH 7,4 и его сканировали при 25^oC с использованием самопишущего спектрофотометра Acta Beckman. Возбуждение протопорфирина ультрафиолетовым облучением (498-408) вызывало оранжево-красную флуоресценцию с длиной волны в диапазоне 620-630 нм. Здесь обычные фильтры пропитывали (вымачивали) вышеуказанным раствором и сушили нагретым воздухом (25-35^oC).

В другом варианте раствор 5 мг/мл трансферина в РФБ с величиной pH 7,4 сканировали с использованием самопишущего спектрофотометра Acta Beckman. Трансферин с трехвалентным железом проявлял характерный спектр 470 нм. Для пропитки используемых в настоящее время обычных фильтров применяли вышеописанные способы.

В альтернативном варианте готовили раствор 5 мг/мл катализы в РФБ с величиной pH 7,4. Осуществляли вышеописанный способ изготовления биологического фильтра.

В еще одном варианте готовили раствор цитохрома C 5 мг/мл в РФБ с величиной pH 7,4. Осуществляли вышеописанный способ изготовления биологического фильтра.

В другом варианте готовили раствор 5 мг/мл хлорофилла в РФБ с величиной pH 7,4. Осуществляли вышеописанный способ изготовления биологического фильтра.

По другому варианту вышеупомянутые биологические вещества помещали в виде прокладки между двумя обычными фильтрами в твердой форме таким образом, что весь аспирированный через фильтр сигаретный дым входил в контакт с активными группами молекул (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂).

Различные биологические вещества, использованные для обогащения обычных фильтров, проявляют способность задерживать токсические соединения (окись азота, моноокись углерода, свободные радикалы, перекись водорода, альдегиды, а также микроэлементы и нитрозосоединения), содержащиеся в сигаретном дыму, в различной степени, как это видно из таблицы, приведенной ниже.

Определяли степень задержания очень вредных для здоровья веществ сигаретного дыма и 20 мл сигаретного дыма, профильтрованного через биологический фильтр, сопоставляли с 20 мл дыма, профильтрованного через обычный фильтр. Только 1 мл сигаретного дыма, аспирированного через обычный фильтр, сравнивали с 40 мл сигаретного дыма, аспирированного через биологический фильтр. Оказалось, что способность удерживать микроэлементы у биологического фильтра в 40 раз выше, чем у обычных фильтров.

В нижеследующем подробном описании экспериментальной части типичные результаты представлены таким образом, чтобы понятнее была активность биологических веществ.

а) Идентификация окиси азота, содержащейся в сигаретном дыму, с использованием метода хемолюминесценции.

Окись азота идентифицировали с применением метода улучшенной люминолом хемолюминесценции, описанного в экспериментальном разделе. На фиг. 3 и 4 проиллюстрирован типичный эксперимент с идентификацией и расчетом окиси азота, а также с ее поглощением после прохождения сигаретного дыма через биологический фильтр. Как оказалось, гемоглобином задерживалось свыше 90% окиси азота. Эффективность биологического фильтра при задержании и нейтрализации окиси азота, которая вовлекалась в токсичные реакции как в легочных клетках, так и в легочных жидкостях, в особенности когда она участвовала в образовании обладающего сильной окислительной способностью ONOO^-, очевидна.

б) Идентификация свободных радикалов, содержащихся в сигаретном дыму, с использованием метода хемолюминесценции.

Свободные радикалы в сигаретном дыму идентифицировали по хемолюминесцентной реакции, вызванной системой люцигенин/ДАМЦО после ее реакции со свободными радикалами. На фиг. 5 показан характерный пик, взятый в 2-секундном интервале хемолюминесцентной реакции, которая подавлялась на 100% после прохождения сигаретного дыма через биологический фильтр. Задерживание свободных радикалов биологическими фильтрами означает, что это должно привести к снижению окислительной нагрузки в альвеолярных макрофагах, которую вызывал обычный сигаретный дым.

в) Идентификация перекиси водорода, содержащейся в сигаретном дыму, с использованием метода хемолюминесценции.

Перекись водорода рассчитывали по хемолюминесцентной реакции, вызванной системой изолюминол/микропероксидаза. На фиг. 6 представлен характерный пик хемолюминесценции вследствие присутствия перекиси водорода в сигаретном дыму. В присутствии каталазы (100 ед./мл) хемолюминесцентная реакция подавлялась приблизительно на 90%. Когда сигаретный дым проходил через биологический фильтр, наблюдали 80%-ное подавление хемолюминесцентной реакции. Система изолюминол/микропероксидаза является специфической для идентификации перекиси водорода. Свободные радикалы, содержавшиеся в сигаретном дыму, после взаимодействия с изолюминолом вызывали слабую хемолюминесцентную реакцию. Как оказалось, эта слабая хемолюминесценция составляла приблизительно 10% от всей хемолюминесценции, вызванной перекисью водорода в присутствии свободных радикалов, поскольку каталаза подавляла максимальную хемолюминесцентную реакцию вплоть до 90%. Задерживание перекиси водорода очевидно ослабляет как окислительную нагрузку, так и продуцирование окиси азота альвеолярными макрофагами.

г) Идентификация микроэлементов и альдегидов, содержащихся в сигаретном дыму, с использованием энзиматической системы люциферин/люфицераза.

Микроэлементы, содержащиеся в сигаретном дыму, идентифицировали по их способности стимулировать активность люциферазы. На фиг. 7 представлены:

1) хемолюминесцентная реакция, вызванная окислением люциферазы в присутствии АТФ,

2) улучшенная хемолюминесцентная реакция в присутствии ионов Cd²⁺ (0,5 мкг),

3) улучшенная хемолюминесцентная реакция в присутствии ионов Cu²⁺ (0,5 мкг),

4) улучшенная хемолюминесцентная реакция, вызванная сигаретным дымом (1 мл), и

5) подавление хемолюминесцентной реакции (в сравнении с той, что вызвана сигаретным дымом), обусловленной 40 мл сигаретного дыма, когда его пропускали через биологический сигаретный фильтр. Очевидно, что хемолюминесцентная реакция, вызванная микроэлементами, содержавшимися в обычном сигаретном дыму, более чем в 40 раз превышает вызванную после прохождения через биологический фильтр. Задерживание микроэлементов биологическими фильтрами может обусловить как кратковременные, так и долговременные эффекты. Кратковременные эффекты могли бы повлечь за собой подавление окислительно-восстановительных реакций в легких (Fe, Mn), а долговременные эффекты могли бы привести к подавлению вредного воздействия на компоненты и вещества крови (Cd).

Альдегиды, содержавшиеся в сигаретном дыму, идентифицировали и рассчитывали с использованием той же самой энзиматической системы люциферин/люцифераза в отсутствии АТФ. Альдегиды способны вызывать окисление люциферазы. На фиг. 8 представлена хемолюминесцентная реакция, которая могла бы продолжаться в течение более часа. Эта хемолюминесцентная реакция подавлялась на 100%, когда использованный сигаретный дым пропускали через биологический фильтр, из чего можно предположить, что эффективность биологического фильтра при задержании токсичных альдегидов является существенной.

д) Идентификация нитрозосоединений в сигаретном дыму.

Нитрозосоединения, содержавшиеся в сигаретном дыму, идентифицировали оценкой медленного выделения окиси азота из нитрозосоединений после их обработки перекисью водорода. Как показано на фиг. 9, пиковой хемолюминесцентной реакции достигали приблизительно при 900 с. Пропускание сигаретного дыма через биологический фильтр демонстрировало 90%-ное подавление наблюдаемой хемолюминесцентной реакции, а ее пик приходился на момент примерно 1200 с. Представлено также медленное выделение окиси азота нитропруссидом натрия (НПН) после его обработки перекисью водорода. На фиг. 10 проиллюстрировано медленное выделение окиси азота как нитрозосоединениями - диэтилнитрозамином и диметилнитрозамином, так и из гемоглобина, обогащенного нитрозосоединениями из сигаретного дыма, обработанными перекисью водорода. Ясно, что выделение окиси азота нитрозосоединениями сигаретного дыма, которые с гемоглобином образовывали аддукты, следовало тому же шаблону выделения окиси азота такими нитрозосоединениями, как диэтилнитрозамин и диметилнитрозамин. Фиг. 11 показывает выделение окиси азота нитрозосоединениями сигаретного дыма, которые с гемоглобином образовывали аддукты, после облучения аддуктов гемоглобин/нитрозосоединения пучком ультра-фиолетовых лучей (100 мДж/см²) в течение одной минуты. Выделение окиси азота оценивали в присутствии перекиси водорода, получив хемолюминесцентную реакцию при 1 с. Показанный на фиг. 11 постепенный рост обусловлен воздействием перекиси водорода на гемоглобин (реакция Фентона).

е) Продуцирование окиси азота легочными макрофагами.

Эксперименты в лабораторных условиях проводили с помощью особой камеры, которая была создана в лаборатории авторов изобретения и которая показана на фиг. 1. Тефлоновая мембрана, разделявшая две секции камеры, была проницаема для газообразной окиси азота и непроницаема для NO₂- и ONOO^-. Не вызывающие сомнений легочные макрофаги, изолированные согласно изложенному в экспериментальном разделе, суспендировали в ССРХ-буферном растворе (1 10⁶ клеток/мл) и помещали в секцию А этой камеры. В секцию Б камеры помещали 2,5 мл реактива Грисса или сульфаниламид/скополетинового реактива. Окись азота, выделяемая макрофагами в секции А, диффундировала через тефлоновую мембрану в секцию Б и связывалась реактивом Грисса и/или сульфаниламид/скополетиновым реактивом и задерживалась там в связанном состоянии. Это указывало на продуцирование макрофагами газообразной окиси азота. Затем спектрофотометрическими или флуорофотометрическим анализом определяли количество окиси азота, находившейся в секции Б. С использованием реактива Грисса и/или сульфаниламид/скополетинового реактива определяли также количество ONOO^- и NO^-₂ содержавшиеся в секции А камеры. Вышеописанные эксперименты повторяли после обработки макрофагов сигаретным дымом до их введения в секцию А. Результаты, представленные на фиг. 12, показывали, что сигаретный дым уменьшал количество продуцированной окиси азота, но усиливал продуцирование в легочных макрофагах ONOO^-, что косвенно указывало на интенсивное продуцирование как окиси азота, так и O^-₂ которые взаимодействовали с образованием ONOO^-.

Повторение вышеописанных экспериментов с применением биологических фильтров (то есть экспериментов, в ходе которых сигаретный дым аспирировали через биологический фильтр) показывало, что использованные биологические вещества продуцировали те же самые количества NO^-₂ и ONOO^- в секции А и количества окиси азота в секции Б, аналогичные тем, что могли бы продуцировать макрофаги, не образованные сигаретным дымом. В этой ситуации компоненты реактива Грисса использовали также для изучения кинетики нитрозирования полупродуктом (полупродуктами), образовавшимся во время реакции окиси азота/O^-₂ в водном растворе при физиологической величине pH. Добавление 50 мл сигаретного дыма к 100 мМ фосфатного раствора с величиной pH 7,4, содержавшего 25 мМ сульфаниламина и 2,5 мМ N-(1-нафтилэтилендиамин)-дигидрохлорида (НЭДД), обуславливало поглощение при _макс= = 496 мм, указывавшее на характерный азопродукт, который был результатом нитрования. Имеет смысл учитывать значения данных наблюдений в отношении ожидаемой реакционной способности окиси азота в соответствующих физиологических условиях, где максимальные концентрации окиси азота в клеточной микросреде оценивали как находившиеся в интервале 0,5-10 мкМ. В процессе курения сигарет концентрации окиси азота резко возрастали, оказывая вредное действие на легочные клетки.

ж) Окислительная нагрузка на легочные макрофаги.

Результаты влияния сигаретного дыма на окислительную нагрузку легочных макрофагов проиллюстрированы на фиг. 13. Расчеты окислительной нагрузки с использованием ГПтБ показывали, что сигаретный дым приводил к удвоенной окислительной нагрузке в сравнении с той, что испытывали необработанные макрофаги. Когда сигаретный дым пропускали через биологический фильтр, наблюдаемая окислительная нагрузка оказывалась аналогичной той, что испытывали необработанные легочные макрофаги. Это, таким образом, ясно указывало на устранение окислительной нагрузки, индуцированной воздействием сигаретного дыма на макрофаги. В этом случае сигаретный дым был свободен от веществ, которые оказывали на легочные макрофаги окислительную нагрузку.

з) Перекись водорода, продуцированная легочными макрофагами.

Перекись водорода, продуцированная макрофагами, обработанными сигаретным дымом, провацировала более чем 10-кратное повышение скорости ее продуцирования в сравнении со скоростью продуцирования необработанными макрофагами. Использование биологического фильтра проявлялось в снижении скорости продуцирования перекиси водорода на 90% (фиг. 14) в сравнении с достигаемой в случаях обычных фильтров. Очевидно, что поскольку сигаретный дым индуцировал окислительную нагрузку в макрофагах, он увеличивал продуцирование этими клетками токсичной перекиси водорода.

и) Эксперименты с восстановлением.

Количество циклического ГМФ, образованного окисью азота, выделенного альвеолярными макрофагами, определяли с помощью камеры, показанной на фиг. 1, где растворимую гуанилатциклазу помещали в секцию А, а альвеолярные макрофаги помещали в секцию Б. Количества окиси азота, продуцированной макрофагами, определяли в течение 50-минутного периода с клетками, обработанными и необработанными сигаретным дымом. Макрофаги, обработанные 10 мл сигаретного дыма, выделяли приблизительно в десять раз меньшее количество окиси азота в сравнении с тем, что выделяли необработанные клетки, что указывало, таким образом, на 10-кратное ослабление продуцирования циклического ГМФ. Вышеописанную процедуру повторяли с использованием сигаретного дыма, который пропускали через биологический фильтр. Была показана нестатистически заметная разница в сравнении с необработанными (контрольными) макрофагами (фиг. 15). Когда альвеолярные макрофаги обрабатывали 5 мМ перекиси водорода аккумулирование окиси азота в секции Б возрастало более чем в 5 раз (фиг. 16). Это позволяло предположить, что перекись водорода усиливала продуцирование окиси азота по механизму позитивной ответной реакции. Путь L-аргинина/окиси азота в макрофаги согласуется с концепцией, состоящей в том, что сигаретный дым вызывает выделение NO/ONOO^-.

к) Идентификация моноокиси углерода (CO) в сигаретном дыму.

Присутствие моноокиси углерода в сигаретном дыму определяли с использованием биологического метода, основанного на стимулировании растворимой гуанилатциклазы моонокисью углерода.

Введение ССРХ, насыщенного сигаретным дымом, в секцию А камеры в присутствии высшего окисла с целью нейтрализации окиси азота и введение растворимой гуанилатциклазы в секцию Б приводили к увеличению продуцирования циклического ГМФ вследствие диффузии моноокиси углерода из секции А в секцию Б. Пропускание сигаретного дыма через биологический фильтр уменьшало количество продуцированного циклического ГМФ приблизительно на 80% (фиг. 17). Вышеприведенная величина указывала на то, что вредные вещества NO_x и CO, содержавшиеся в сигаретном дыму, задерживались и нейтрализовались биологическими фильтрами.

Эксперименты in vivo.

а) Вначале авторы изобретения убеждались в присутствии окиси азота и ONOO^- в выдыхаемом сигаретном дыму. У добровольцев, куривших сигареты, снабженные обычными фильтрами, наличие окиси азота в выдыхаемом сигаретном дыму устанавливали после введения выдыхаемого дыма в 50 мл кислого раствора с величиной pH 4. Концентрацию окиси азота рассчитывали по описанному в экспериментальном разделе методу хемолюминесценции, усиленной люминолом, с использованием стандартных кривых, построенных по технической окиси азота. Было установлено, что концентрация окиси азота составляла 0,045 мМ. Эти эксперименты повторяли с использованием биологических фильтров, и концентрация окиси азота во вдыхаемом дыму оказывалась приблизительно на 70% ниже, чем в случае обычного фильтра (фиг. 18). Концентрацию ONOO^- определяли с использованием 1,2 М раствора гидроокиси натрия, который демонстрировал усиление поглощения при 303 нм (фиг. 19) ( 303 нм = 1670 М^-1 см^-1). Проведенные авторами изобретения эксперименты показывали, что в процессе курения выдыхаемый дым содержал большие количества ONOO^- (в результате прохождения 50 мл выдыхаемого дыма через 5 мл 1,2 М гидроокиси натрия образовывался 0,9 мМ раствор ONOO^-). Как установили, соотношение NO/ONOO^- в выдыхаемом дыму составляло 1:20.

Таким образом оказалось, что NO_x при взаимодействии с высшим окислом в легких трансформировались в ONOO^-. Высший окисел образовывался как макрофагами, так и вследствие окислительно-восстановительных реакций, протекавших в легких во время курения. Сигаретный дым, аспирированный насосом, не содержал ONOO^-, однако некоторое количество NO_x вступало в реакцию с высшим окислом или кислородом с образованием нитритных ионов (NO₂-). ONOO^- образовывался, только когда сигаретный дым входил в легкие. Применение биологических фильтров уменьшало выдыхаемые количества NO и ONOO^- на 70%.

б) ONOO^- вступает в реакцию с бикарбонатными ионами эритроцитов человека в соответствии с уравнением реакции

ONOO^-+HCO²₃ ___ HCO₃+NO₂+OH^-.

Бикарбонатный радикал окисляет люминол, а также ароматические и гетероциклические молекулы. В другом варианте ONOO^- способен переокислять бикарбонат до пероксибикарбоната, другого материала с сильным окислительным действием. С другой стороны, пероксид-дисмутаза (ПОД) катализирует нитрование ONOO^- и обширный ряд фенолов, включая сюда тирозин, с образованием белков.

Таким образом, существует несколько потенциальных механизмов, посредством которых бикарбонат и ПОД могли бы оказывать влияние на общую реакционную способность ONOO^- в клетках. Присутствие ONOO^-, образованного в легких вдыхаемым сигаретным дымом, вызывало резкое увеличение окислительной нагрузки в эритроцитах, что определяли по хемолюминесцентной реакции, протекающей в течение 5 с. Тот же самый эксперимент, проводимый с использованием биологического фильтра, обуславливал почти 100%-ное подавление окислительной нагрузки в эритроцитах человека (фиг. 20). Гемоглобин или эритроцитные лизаты, на которые воздействовал ONOO^- (содержавшийся в выдыхаемом сигаретном дыму), обуславливали исчезновение двух пиков при 540 и 575 нМ, которые обычно наблюдали у гемоглобина. Результаты типичного эксперимента, подобного тому, что описан выше, были получены с помощью 12 добровольцев и представлены на фиг. 21. Когда на гемоглобин и/или лизат воздействовали небольшим количество дыма (10 мл), наблюдали смещение пиков с 540 и 575 до 525 и 555 нм, согласующееся с образованием нитрозилгемоглобина. Эти эксперименты повторяли с использованием биологических фильтров. Наблюдаемые пики сохраняли свои характерные длины волн.

в) Альдегиды идентифицировали в выдыхаемом добровольцами сигаретном дыму по их характерному хемолюминесцентному пику. Эти эксперименты повторяли с использованием биологических фильтров и наблюдали 90%-ное ослабление хемолюминесцентной реакции в сравнении с максимальной хемолюминесцентной реакцией, которую наблюдали в случае использования обычного фильтра (фиг. 22). Очевидно, что биологические фильтры задерживали и нейтрализовали альдегиды сигаретного дыма, одновременно удерживая окислители, явно подавляя, таким образом, инициирование окислительно-восстановительных реакций в легких, в результате которых могли бы образовываться эндогеные альдегиды.

г) Свободные радикалы идентифицировали в выдыхаемом добровольцами сигаретном дыму по их характерному хемолюминесцентному пику. Эти добровольцы пользовались сигаретами, снабженными обычными и биологическими фильтрами. Им рекомендовали выдыхать 50 мл сигаретного дыма в 50 мл кислого раствора (0,01 н. соляная кислота) с величиной pH 6, а хемолюминесцентную реакцию изучали по истечении 5 и 60 мин. При величине pH 6 ONOO^- самопроизвольно разлагался. В течение 5 мин происходило 160%-ное усиление хемолюминесцентной реакции в выдыхаемом дыму, пропущенном через обычный фильтр, в сравнении с тем, что происходило в сигаретном дыму, пропущенном через биологический фильтр (фиг. 23). Когда насыщенным выдыхаемым дымом кислый раствор оставляли на час, разница между хемолюминесцентными реакциями возрастала со 160 до 250% (фиг. 24). Это согласовывалось с концепцией того, что окислительно-восстановительные реакции благодаря хиноновым радикалам протекают в сигаретном дыму непрерывно и проводят к образованию ряда активированных кислородсодеращих материалов, которые способны наносить биологический вред.

Проведенные авторами изобретения исследования показали, что альвеолярные макрофаги подобно другим клеткам обладают эндогенной NO синтазой и под воздействием сигаретного дыма способны в течение длительных периодов времени выделять NO/ONOO^-.

Более того, после начала выделения этими клетками окиси азота продуцирование окиси азота становится независимым даже после устранения этого стимула. Такая реакция объясняет способность дериватизированной сигаретным дымом окиси азота стимулировать выделение окиси азота и ONOO^- альвеолярными макрофагами в течение периода в несколько часов после устранения стимула. Эта реакция может быть инициирована продуцированием перекиси водорода в легких при стимулировании сигаретным дымом альвеолярных макрофагов. Перекись водорода может стимулировать деятельность NO синтазы легочных клеток по продуцированию окиси азота и ONOO^- в течение периода времени более часа после устранения стимула. Эксперименты авторов изобретения действительно показали, что результатом пропускания сигаретного дыма через биологический фильтр является 90%-ное уменьшение (в сравнении со случаем обычного фильтра) окислительной нагрузки в альвеолярных макрофагах крысы. Образующийся в легких радикал ONOO^- способен воздействовать на ингибитор альфа-1-протеиназы (Иа1П) и инактивировать его. Подавление Иа1П в легких человека часто вызывает эмфизему, в результате которой уменьшается жизненная емкость легких. Статистические данные показывают, что курение провоцирует развитие эмфиземы (Southon, P. A. , Pwis, G., Free Radicals in Medicine Involvement in human Disease Mago Clin. Proc. 63: 390-408, 1988). В экспериментах in vivo, проведенных на 12 добровольцах-курильщиках, когда вдыхаемый сигаретный дым пропускали через биологический фильтр, наблюдали 90%-ное уменьшение количеств выдыхаемых NO/ONOO^-.

Кислородсодержащие свободные радикалы также участвуют в патогенезе IgA-иммунного комплекса, индуцированном альвеолитом. Предварительная обработка животных пероксиддисмутазой, каталазой, связывающим железо в комплекс десфериоксамином или поглотителем гидросильных групп ДМСО подавляет развитие заболевания легких. В противоположность этому легкие достоверно необработанных, контрольных животных характеризуются присутствием увеличенного числа альвеолярных макрофагов. Происходят также интерститиальный отек и кровоизлияние. Более того, в такой модели заболевания легких высокозащищенным оказывается также L-аргинин, как об этом свидетельствуют пониженные сосудистая проницаемость, сосудистое кровоизлияние и повреждение сосудистых эндотелиальных и альвеолярных эпителиальлных клеток. Установление таких фактов позволяет предположить, что макрофаги являются источником повреждения, вызываемого окисью азота, O^-₂, перекисью водорода и гидроксильными группами [Mullingan, M. S., Jonhson, K.J., Ward, P.A. в работе "Biological Oxidants: Generation and Injurious Consequences" (под редакцией Cochrane, C.G. и Gilbrone, M.A.), Jr. Academic Press, 157-172, 1992].

Задерживание и нейтрализация окислителей, содержащихся в сигаретном дыму, биологическими фильтрами может сыграть заметную роль в снижении активности окислительно-восстановительных энзимов, которые непосредственно связаны с окислительной нагрузкой в легочных клетках. Биологические фильтры резко ославляют окислительную нагрузку, вызванную вдыхаемым сигаретным дымом. Окислительная нагрузка в легочных макрофагах и эндотелиальных клетках легочных сосудов может быть индуцирована кислородсодержащими радикалами NO, NO_x и/или альдегидами, содержащимися в сигаретном дыму. Более того, задерживание альдегидов и микроэлементов (в особенности кадмия) биологическими фильтрами может обусловить значительные долговременные эффекты в сохранении антиоксидантов плазмы и в подавлении развития атеросклероза. Гемоглобин содержит несколько нейтрофильных центров, которые вступают в ковалентные реакции с электрофилами. Эти центры индуцируют N-концевые валиновые остатки альфа- и бета-цепи, и N1- и N3-атомы гистидиновых остатков и сульфидрильную группу цистеиновых остатков. Канцерогенное нитрозосоединение 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридин)-1-бутанон (НПБ), содержащееся в табаке, во время горения сигареты переходит в дым, и его содержание в основной струе дыма могло бы варьироваться от 4 до 1700 нг на каждую сигарету. НПБ способен образовывать с гемоглобином аддукты (Hecht, S.S., Karan, S. и Carmella, S.G. , в работе "Human carcinogen expose", под редакцией Garmer, R.C., Farmer, P. B. , Steel, G.I. и Wricht, A.S., издательство IRL Press, сс. 267-274, 1991). Очевидно, что единственный путь избежать связанных с табаком заболеваний состоит в том, чтобы воздержаться от жевания и курения табака. Однако статистика, охватывающая современных курильщиков, указывает на то, что необходимо предпринять серьезные меры для ослабления воздействия табачных канцерогенов и модификации камеры их воздействия. Принципиальными путями достижения этой цели являются: 1) модификация табачной продукции, 2) подавление метаболической активации табачных канцерогенов и их эндогенного продуцирования некоторыми микро- и макропитательными веществами и химиопревентивными агентами и 3) задерживание табачных канцерогенов с использованием особых фильтров, которые должны быть соединены с сигаретным табаком. Изобретение, при осуществлении которого для изготовления биологических фильтров используются биологические вещества, относится, наконец, к открытию того факта, что нитрозосоединения, содержащиеся во вдыхаемом сигаретном дыму, задерживаются этими биологическими веществами, защищая здоровье не только курильщиков, но также и некурящих.