способ получения белков hcv, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, асиалогликопротеин (варианты), композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе (варианты), способ очистки асиалогликопротеина и способ понижения содержания или элиминации hcv

Формула изобретения

1. Способ получения белков HCV, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, включающий выращивание хозяйской клетки, трансформированной структурным геном, кодирующим белок HCV, в подходящей культуральной среде, экспрессию указанного структурного гена, выделение белка HCV из указанной культуры клеток, отличающийся тем, что белок HCV представляет собой асиалогликопротеин, выбранный из группы, состоящей из E1, E2 или их агрегатов, причем экспрессию проводят в условиях, ингибирующих сиалирование, выделение осуществляют путем контактирования упомянутой клеточной культуры с белком, связывающим маннозу, специфичным для гликопротеинов с терминальными маннозными остатками и выделяют часть клеточной культуры, которая связывается с белком, связывающим маннозу.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гликопротеин экспрессируют в дрожжевой клетке.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дрожжи представляют собой мутант, дефицитный по гликозилированию.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что асиалогликопротеин экспрессируют в клетке млекопитающих.

5. Способ по любому из п.1 или 4, отличающийся тем, что условия, ингибирующие сиалирование, включают экспрессию асиалогликопротеина на уровне, достаточном, чтобы ингибировать транспорт гликопротеинов из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи.

6. Способ по любому из п.1 или 4, отличающийся тем, что условия, ингибирующие сиалирование, включают присутствие достаточного количества модулятора кальция, чтобы вызвать высвобождение протеинов в эндоплазматический ретикулум хозяйской клетки.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что упомянутый модулятор кальция выбирают из группы, состоящей из тапсигаргина или EGTA [этиленгликоль-бис(бета-аминоэтиловый эфир) N, N, N", N"-тетрауксусная кислота].

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве упомянутого белка, связывающего маннозу, используют лектин.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что лектином является GNA.

10. Способ по любому из пп.1 - 9, отличающийся тем, что упомянутый белок, связывающий маннозу, иммобилизуют на носителе.

11. Способ по любому из пп.1 - 10, отличающийся тем, что упомянутое контактирование включает инкубирование композиции, содержащей упомянутый асиалогликопротеин, на колонке, содержащей лектин, связывающий маннозу, иммобилизованный на носителе, в течение по крайней мере одного часа и выделение, заключающееся в элюции асиалогликопротеина маннозой.

12. Асиалогликопротеин, продуцируемый по любому из пп.1 - 11, причем упомянутый асиалогликопротеин экспрессируют из E1 и/или E2 HCV.

13. Асиалогликопротеин по п.12, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин экспрессируют из E1-района HCV.

14. Асиалогликопротеин по п.12, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин экспрессируют из E2-района HCV.

15. Асиалогликопротеин по п.12, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин представляет собой агрегат E1/E2.

16. Композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе, отличающаяся тем, что включает асиалогликопротеин по любому из пп.12 - 15.

17. Способ очистки асиалогликопротеина, включающий контактирование композиции, содержащей асиалогликопротеин, с белком, связывающим маннозу, и выделение части композиции, которая связывается с белком, связывающим маннозу, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин представляет собой асиалогликопротеин вируса гепатита C (HCV), выбираемый из асиалогликопротеина, экспрессируемого из E1-района HCV, асиалогликопротеина, экспрессируемого из E2-района HCV, и их агрегатов.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в качестве белка, связывающего маннозу, используют лектин, выбираемый из Con A и GNA.

19. Способ по любому из пп.17 - 18, отличающийся тем, что белок, связывающий маннозу, иммобилизуют на носителе.

20. Способ по любому из пп.17 - 19, отличающийся тем, что упомянутое контактирование включает инкубирование композиции, содержащей упомянутый гликопротеин на колонке, содержащей иммобилизованный на носителе лектин, связывающий маннозу, в течение по крайней мере одного часа и выделение включает элюцию упомянутого асиалогликопротеина маннозой.

21. Асиалогликопротеин HCV, продуцируемый по любому из пп.17 - 20, причем упомянутый асиалогликопротеин выбирают из E1, E2 или их агрегата.

22. Асиалогликопротеин HCV по п.21, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин представляет собой E1.

23. Асиалогликопротеин HCV по п.21, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин представляет собой E2.

24. Асиалогликопротеин HCV по п.21, отличающийся тем, что упомянутый асиалогликопротеин представляет собой агрегат E1/E2.

25. Композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе, содержащая асиалогликопротеин по любому из пп.21 - 24.

26. Способ понижения содержания или элиминации HCV в плазме, сыворотке или других биологических жидкостях, отличающийся тем, что контактируют биологическую жидкость с белком, связывающим маннозу, специфичным для гликопротеинов с маннозой на конце, и отделяют биологическую жидкость от белка, связывающего маннозу.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к общим областям экспрессии рекомбинантного белка и вирусологии. Более конкретно, изобретение относится к гликопротеинам, пригодным для диагностики, лечения и профилактики инфекции вирусом гепатита С и к способам получения таких гликопротеинов.

Прототипы изобретения

Гепатит не-А не В (ГНАНВ) является трансмиссивным заболеванием (или группой заболеваний), по-видимому, вирусной этиологии, отличающимся от других форм поражения печени, связанного с вирусом, таких как вызванные вирусом гепатита А (ВГА), вирусом гепатита В (ВГВ), вирусом гепатита дельта (ВГД), цитомегаловирусом (ЦМВ) или вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ). Эпидемиологические данные наводят на мысль, что ГНАНВ может быть трех типов: эпидемического типа, передающегося с водой, типа, передающегося через кровь или с инъекциями, и типа, спорадически появляющегося у населения. Количество вызывающих его возбудителей неизвестно. Однако недавно были выделены новые виды вирусов, вирус гепатита С (ВГС) как основная (если не единственная) причина передающегося через кровь ГНАНВ (ВВ-ГНАНВ). См., например, EP 0388232 и EP 0320267. Гепатит C является главной формой гепатита, связанного с переливанием крови, во многих странах и регионах, включая Соединенные Штаты, Европу и Японию. Имеются также сведения об участии ВГС в возникновении печеночноклеточного рака. Поэтому существует необходимость в эффективном способе предупреждения и лечения ВГС-инфекции.

Потребность в чувствительных специфических методиках для скрининга и выявления носителей ВГС и зараженных ВГС крови и препаратов крови значительна. Посттрансфузионный гепатит (ПТГ) встречается приблизительно у 10% больных, получавших переливание крови, и ВГС вызывает до 90% этих случаев. Основная проблема этого заболевания в том, что оно часто вызывает хроническое прогрессирующее поражение печени (25-55%).

Лечение больного, так же как предупреждение передачи ВГС с кровью и препаратами крови или при тесном контакте с персоналом, требует доступных диагностических и прогностических средств для обнаружения нуклеиновых кислот, антигенов и антител, связанных с ВГС. К тому же существует также нужда в эффективных вакцинах и иммунотерапевтических лечебных препаратах для предупреждения и/или лечения этого заболевания.

ВГС появляется в крови инфицированных лиц в очень небольших количествах по сравнению с другими инфекционными вирусами, из-за чего этот вирус очень трудно обнаружить. Низкая концентрация вируса, возможно, является основной причиной того, что возбудитель ГНАНВ так долго оставался необнаруженным. Даже при том, что в настоящее время его клонировали, ВГС все еще трудно культивировать и размножать. Соответственно очень нужны рекомбинантные способы получения диагностических (терапевтических) профилактических белков ВГС.

Кроме того, очень нужна вакцина ВГС. Однако вырастить ВГС в культуре клеток очень трудно. Поэтому не было возможности вывести ослабленные штаммы вируса при помощи серийных пассажей на культурах ткани/клеток.

Сущность изобретения

При экспрессировании в рекомбинантных системах было обнаружено, что два белка ВГС, Е1 и Е2 проявляются как связанные с оболочкой асиалогликопротеины. Это было неожиданным, потому что гликопротеины обычно не остаются у млекопитающих в форме с маннозой на конце, а подвергаются дальнейшим превращениям с другими углеводами: форма, оканчивающаяся на маннозу, в типичных случаях является только переходной. У Е1 и Е2 (как они экспрессировались в наших системах) этот асиалогликопротеин, казалось, являлся конечной формой. Е1 (1 белок оболочки) является гликопротеином с молекулярной массой около 35 кД, который транслируется с прогнозируемой области Е1 генома ВГС. Е2 (2 белок оболочки) является гликопротеином с молекулярной массой около 72 кД, который транслируется с прогнозируемой области НС1 (неструктурный белок 1) генома ВГС, основываясь на флавовирусной модели ВГС. Так как вирусные гликопротеины часто высокоиммуногенны, Е1 и Е2 являются первыми кандидатами для использования в иммуноанализах и терапевтических/профилактических вакцинах.

Открытие, что Е1 и Е2 несиалилированы, является значительным. Особая форма белка часто подсказывает, какие клетки могут служить подходящим хозяином для рекомбинантной экспрессии. Прокариоты, такие как E.coli, не гликозилируют белки и в общем не подходят для получения гликопротеинов, используемых как антигены, из-за того, что гликозилирование часто является важным для полной антигенности, растворимости и стабильности белка. Низшие эукариоты, такие как дрожжи и грибки, гликозилируют белки, но в целом не способны добавлять к терминальным углеводным комплексам остатки сиаловой кислоты.

Поэтому белки, полученные на дрожжах, могут отличаться по антигенам от своих естественных (нерекомбинантных) аналогов.

Экспрессия в клетках млекопитающих предпочтительна в случаях, когда важна антигенность продукта, так как гликозилирование рекомбинантного протеина должно очень походить на таковое у протеинов природных вирусов.

Новые данные указывают, что при инфицировании вирус ВГС может проникнуть в клетки хозяина либо через асиалогликопротеиновый рецептор, найденный на гепатоцитах, либо через рецептор маннозы, найденный на эндотелиальных клетках печени и макрофагах (особенно на купферовских клетках). Неожиданно было обнаружено, что масса естественных Е1 и Е2 не содержит терминальных остатков сиаловой кислоты, а только гликозилированную сердцевину. Небольшие фракции дополнительно содержат терминальный N- ацетилглюкозамин. Соответственно объектом настоящего изобретения является получение гликопротеинов оболочки ВГС, лишенных всех или почти всех терминальных остатков сиаловой кислоты.

Другим аспектом изобретения является способ получения асиало-Е1 или Е2 в условиях подавления присоединения терминальной сиаловой кислоты, например, путем экспрессии в дрожжах или экспрессии в клетках млекопитающих, используя антибиотики для облегчения секреции или выделения.

Другим аспектом изобретения является способ очистки Е1 и Е2 путем средства к лектинам, которые связывают терминальные остатки маннозы или терминальные N-ацетилглюкозаминовые остатки.

Другим аспектом изобретения является иммуногенная композиция, включающая рекомбинантный асиалогликопротеин, выбранный из группы, состоящей из Е1 и Е2 ВГС в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. По желанию можно включить иммунологический адъювант.

Другим аспектом изобретения является реагент для иммуноанализа, включающий рекомбинантный асиалогликопротеин, выбранный из группы, состоящей из Е1 и Е2 в сочетании с подходящим носителем. Другой реагент для иммуноанализа по этому изобретению состоит из рекомбинантного асиалогликопротеина, выбранного из группы, состоящей из Е1 и Е2 ВГС, в сочетании с подходящей выявляемой меткой.

Еще один аспект изобретения касается димеров и агрегатов более высокого порядка Е1 и/или Е2. Одним из образцов изобретения является комплекс Е2. Другим образом изобретения является гетеродимер Е1:Е2.

Еще одним аспектом изобретения является композиция ВГС-вакцины, состоящая из агрегатов Е1:Е2 и фармацевтически приемлемого носителя.

Еще одним аспектом изобретения является способ очистки комплексов Е1:Е2.

Еще одним аспектом изобретения является способ размножения ВГС в культуре клеток, включающий: (а) предоставление клетки, экспрессирующей рецептор, выбранный из группы, состоящей из рецептора маннозы и рецептора асиалогликопротеина; (б) инфицирование клетки ВГС; (в) выращивание инфицированной клетки. Предпочтительно, чтобы клетка экспрессировала рекомбинантный рецептор.

Способы проведения изобретения

А. Определения.

Термин "асиалогликопротеин" относится к гликозилированному протеину, который в значительной степени освобожден от остатков сиаловой кислоты. Асиалогликопротеины можно получить рекомбинантным способом, либо путем очистки из культуры клеток, либо из естественных источников.

В настоящее время предпочтительны асиалогликопротеины, получающиеся из ВГС, предпочтительно гликопротеины Е1 и Е2, наиболее предпочтительно рекомбинантные Е1 и Е2 (pE1 и рЕ2). Белок, "в значительной степени освобожденный" от сиаловой кислоты, подпадает под это определение, если количество остатков сиаловой кислоты незначительно влияет на связывание гликопротеина с протеинами, связывающими маннозу, такими как GNA. Такая степень сиалилирования в общем достигается, если сиаловая кислота составляет менее 40% общего количества N- связанных углеводов, более предпочтительно менее 30%, более предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% и самое предпочтительное менее 2%.

Термин "Е1" используется здесь для обозначения белка или полипептида, экспрессированного в пределах первых 400 аминокислот полипротеина ВГС, участка, иногда упоминаемого как протеин Е или S. В естественном виде он является гликопротеином в 35 кД, строго связанным с оболочкой. У большинства природных штаммов ВГС протеин Е1 закодирован в вирусном полипротеине после протеина С (сердцевины).

Протеин Е1 располагается приблизительно между 192 и 383 аминокислотами на протяжении полипротеина. В термин "Е1" здесь также включаются аналоги и процессированные мутанты, дающие перекрестные иммунологические реакции с естественным Е1.

Термин "Е2" используется здесь для обозначения белка или полипептида, экспрессированного в пределах первых 900 аминокислот полипротеина ВГС, участка, иногда упоминаемого как белок НС1. В естественном виде он является гликопротеином в 72 кД, строго связанным с оболочкой. У большинства естественных штаммов ВГС протеин Е2 следует за протеином Е1.

Протеин Е2 располагается приблизительно между 384 и 820 аминокислотами. В понятие "Е2" здесь также включаются аналоги и процессированные мутанты, дающие перекрестные иммунологические реакции с естественным Е2.

Термин "агрегат" используется здесь для обозначения комплекса Е1 и/или Е2, содержащего более одного мономера Е1 или Е2. В рамках этого определения димеры Е1:Е1 и Е2:Е2 и гетеродимеры Е1:Е2 являются "агрегатами". Композиции изобретения могут также включать более крупные агрегаты с молекулярной массой, превышающей 800 кД.

Термин "частица" используется здесь для обозначения агрегата E1, E2 или E1/E2, видимого при электронной микроскопии и имеющего размеры не менее 20 нм. Предпочтительными частицами являются те, которые имеют приблизительно сферическую форму и диаметр около 40 нм при электронной микроскопии.

Термин "очищенные" здесь применяют по отношению к протеинам в композиции, где заданный протеин составляет не менее 35% всего белкового компонента композиции. Предпочтительно заданный протеин составляет не менее 40%, более предпочтительно не менее 50%, более предпочтительно не менее 60%, еще более предпочтительно не менее 70%, даже предпочтительнее не менее 80%, даже предпочтительнее не менее 90% и предпочтительнее всего не менее 95% всего белкового компонента. Композиция может содержать другие соединения, такие как углеводы, соли, липиды, растворители и т.п., не нарушая определения процента очистки, здесь применяющегося. "Изолированный" асиалогликопротеин ВГС означает композицию асиалогликопротеина ВГС, очищенную не менее чем на 35%.

"Протеин, связывающий маннозу", здесь означает лектин или другой протеин, специфически связывающийся с протеинами с гликозилированием, оканчивающимся на маннозу (например, асиалогликопротеины), например лектины, связывающие маннозу, антитела, специфичные для гликозилирования, оканчивающегося на маннозу, протеин рецептора маннозы (R.A.B. Ezekowitz et al., J. Exp. Med. (1990) 176: 1785-94), протеины рецептора асиалогликопротеина (H. Kurata et al. , J. Biol. Chem. (1990) 265:11295-98), сывороточный протеин, связывающий маннозу (I. Schuffenecker et al., Cytogenet, Cell Genet. (1991) 56:99-102; K. Sastry et al. , J. Immunol. (1991) 147:692-97), сывороточный протеин, связывающий асиалогликопротеин и т.п. Лектины, связывающие маннозу, включают, например, GNA, конканавалин А (КонА) и другие лектины со сходными связывающими свойствами.

Термин "лектин GNA" относится к агглютинину растения Galanthus nivalus, продажному лектину, который связывает гликопротеины, оканчивающиеся маннозой.

"Рекомбинантным" гликопротеином здесь называется гликопротеин, экспрессированный с рекомбинантного полинуклеотида, в котором структурный ген, кодирующий гликопротеин, экспрессируется под контролем регулирующей последовательности, не примыкающей в естественных условиях к структурному гену или в котором структурный ген модифицирован.

Например, можно создать вектор, в котором структурный ген E1 помещен под контроль функционального фрагмента промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы дрожжей (ГАФДГ). В настоящее время предпочтительным промотором для использования с дрожжами является гибридный промотор АДГ2/ГАФ, описанный в патенте США N 4.880.734, для которого используется фрагмент промотора ГАФДГ в сочетании с активационной обратной последовательностью, полученной от алкогольдегидрогеназы 2. Модификации структурного гена могут включать замещение различных кодонов вырождающимися кодонами (напр., для того, чтобы извлечь пользу из кодонов, предпочитаемых хозяином, элиминировать или создать области расщепления рестрикционного фермента, управлять образованием шпильки и т. д. ) и замещение, вставку или удаление ограниченного числа кодонов, кодирующих различные аминокислоты (предпочтительно не более 10%, более предпочтительно менее 5% от размера естественной аминокислотной последовательности подлежат изменению) и т. п. Таким же образом "рекомбинантным" рецептором назван протеин рецептора, экспрессированный с рекомбинантного полинуклеотида, в котором структурный ген, кодирующий рецептор, экспрессируется под контролем регуляторных последовательностей, не примыкающих в естественных условиях к структурному гену или в котором структурный ген модифицирован.

Термин "изолированный полипептид" относится к полипептиду, в значительной степени свободному от других компонентов вируса ВГС, в особенности от полинуклеотидов. Полипептидная композиция является "существенно свободной" от других компонентов, если вес полипептида в композиции составляет не менее 70% веса полипептида и другого компонента, с ним соединенного, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно около 90% и самое предпочтительное 95% или более.

Например, композиция, содержащая 10 мгк/мл E1 и только 3 мгк/мл других компонентов ВГС (напр., ДНК, липиды и т.д.), является существенно свободной от "других компонентов ВГС" и, таким образом, является композицией изолированного полипептида в рамках этого определения.

Термин "лидер секреции" относится к полипептиду, который при кодировании на амино-конце белка вызывает после трансляции секрецию белка в среду культуры клетки хозяина. Лидер секреции, как правило, получается из используемой клетки хозяина.

Например, в число лидеров секреции, подходящих для использования на дрожжах, входит лидер альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae (см. патент США N 4.870.008).

Термин "низший эукариот" относится к клеткам хозяина, таким как дрожжи, грибы и т. п. Низшие эукариоты являются, как правило, (но не обязательно) одноклеточными. Предпочтительными эукариотами являются дрожжи, особенно виды, относящиеся к Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula и т.п. Saccharomyces cerevisrae, S. carlsbergensis и K. lactis являются наиболее часто использующимися дрожжевыми хозяевами и общепринятыми грибковыми хозяевами.

Термин "высший эукариот" относится к клеткам хозяина, полученным от высших животных, таких как млекопитающие, рептилии, насекомые и т.п.

В настоящее время предпочтительны высшие эукариотные клетки хозяина, полученные от китайского хомячка (напр., CHO - клетки яичника китайского хомячка), обезьян (напр., клетки COS), человека и насекомого (напр., Spodoptera frugiperda). Клетки хозяина могут быть представлены в виде суспензии, или культуры в матрасе, культур ткани, культур органов и т.п.

Термин "модулятор кальция" относится к соединению, способному секвестрировать или связывать ионы кальция в эндоплазматическом ретикулуме или изменять концентрацию ионов кальция в ЭПС путем действия на белки, регулирующие обмен кальция (напр., белки кальциевого туннеля, кальциевые насосы и т.д.). В число подходящих модуляторов кальция входит, например, тапсигаргин, EGTA (этиленгликоль-бис[бета-аминоэтиловый эфир] -N,N,N",N"-тетрауксусная кислота). В настоящее время предпочтительным модулятором является тапсигаргин (см. , напр., O. Thastrup et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87:2466-70).

Термин "иммуногенный" относится к способности вещества вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ либо в одиночку, либо в связанном с носителем состоянии в присутствии адъюванта или без него. "Нейтрализация" относится к иммунному ответу, блокирующему инвазивную способность частично или полностью инфекционного возбудителя. "Вакцина" является иммуногенной композицией, способной осуществить защиту от ВГС, частичную или полную, применимо для лечения индивидуума.

Термин "биологическая жидкость" относится к жидкости, полученной из организма, такой как сыворотка, плазма, слюна, желудочный сок, слизь и т.п. В общем биологические жидкости подлежат скринингу на присутствие частиц ВГС. Некоторые биологические жидкости используются как источник других продуктов, таких как свертывающие факторы (напр., фактор VIII:C), сывороточный альбумин, гормон роста и т.п. В таких случаях важно, чтобы источник биологической жидкости был свободен от загрязнения вирусом, таким как ВГС.

Б. Общий способ.

Область E1 генома ВГС описывается в EP 388.232 как область "E", тогда как E2 описывается как "HCl". Область E1 включает приблизительно 192 - 383 аминокислоты на протяжении вирусного полипротеина. Область E2 включает приблизительно 384 - 820 аминокислоты. Полные последовательности прототипов этих протеинов (штамм ВГС-1) доступны специалисту (см. EP 388.232), так как являются общими способами клонирования и экспрессирования протеинов. Оба E1 и E2 могут экспрессироваться с полинуклеотида, кодирующего первые 850 - 900 аминокислот полипротеина ВГС: посттрансляционное процессирование в большинстве эукариотных клеток хозяина расщепляет первоначальный полипротеин на C, E1 и E2. Можно процессировать 5" конец кодирующей области для того, чтобы уменьшить количество образующегося протеина C.

Экспрессию асиалогликопротеинов можно получить множеством способов. Например, можно получить экспрессию в низших эукариотах (таких как дрожжи), которые в норме не добавляют остатки сиаловой кислоты к гликозилированным протеинам. В дрожжевых экспрессионных системах в настоящее время предпочтительно пользоваться лидером секреции, таким как лидер альфа-фактора S. cerevisiae, так, чтобы протеин экспрессировался после трансляции в питательную среду. Также в настоящее время предпочтительно пользоваться мутантами с дефицитом гликозилирования, таким как pmrl, так как эти мутанты обеспечивают только гликозилирование сердцевины и часто секретируют гетерологичные белки с высокой эффективностью (H.K.Rudolph et al., Cell (1989) 58:133-45). Альтернативно можно использовать другие виды дрожжей, такие как Pichia pastoris, который экспрессирует гликопротеины, содержащие 8 - 9 остатков маннозы в виде, напоминающем, как считают, тип гликозилирования сердцевины, наблюдающийся у млекопитающих и S. cerevisiae.

Альтернативно можно вызвать экспрессию в клетках млекопитающих и блокировать терминальное гликозилирование (добавление сиаловой кислоты). Рекомбинантные конструкции будут предпочтительно включать сигнал секреции для страховки, что протеин направлен в эндоплазматический ретикулум. Транспорт в аппарате Гольджи, по-видимому, блокируют сами E1 и E2: высокий уровень экспрессии E1 и E2 в клетках млекопитающих, кажется, прекращает секрецию всех белков клетки в эндоплазматическом ретикулуме или в аппарате Гольджи. Можно дополнительно использовать мутант с дефектом гликозилирования. См., например, P. Stanley, Ann. Rev. Genet. (1984) 18:525-52. В случае гликозилирования или транспорта мутант экспрессирует E1 и E2 с сиалилированием, тогда терминальный остаток сиаловой кислоты можно удалить обработкой нейраминидазой.

Дрожжи в дальнейшем нужно стимулировать кальциевым модулятором, для того чтобы получить секрецию протеина в эндоплазматический ретикулум. В число подходящих модуляторов входят тапсигаргин и А23817 (см., напр., O. Thastrup et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87:2466-70). Например, можно экспрессировать большое количество E1 или E2 внутриклеточно в клетках млекопитающих (напр., клетки CHO, COS, HeLa и т.п.) путем трансфекции вектором рекомбинантного вируса коровьей оспы. Выждав, пока протеин экспрессируется и накопится в эндоплазматическом ретикулуме, клетки обрабатывают кальциевым модулятором в концентрации достаточно большой, чтобы вызвать выделение содержимого ЭПС. Затем белок возвращается из питательной среды, которая замещается для следующего цикла.

Дополнительно может оказаться выгодным экспрессировать процессированную форму протеина оболочки. E1 и E2 оба, по-видимому, обладают резко гидрофобным доменом, который, очевидно, удерживает протеин внутри эндоплазматического ретикулама и препятствует эффективному выделению. Поэтому можно по желанию убрать части последовательности, обнаруженные в одной или нескольких областях аминокислот 170-190, 260-290 или 330-380 у E1 (нумерация от начала полипротеина) и 660-830 у E2 (см., например, pисунок 20-1 в EP 388.232). Похоже, что по крайней мере один из этих гидрофобных демонов образует трансмембранную область, которая не является существенной для антигенности протеина и поэтому может быть удалена без ущерба. Какую область лучше удалить, можно определить немногими экспериментами по удалению, проведенными обычным образом. Удаление гидрофобного 3"-конца у E2 приводит к секреции части экспрессированного E2 с сиалилированием секретированного протеина.

Для получения экспрессии можно использовать любой из ряда векторов. Низшие эукариоты, такие как дрожжи, обычно трансформируются плазмидами методом преципитации фосфата кальция или подвергаются трансфекции рекомбинантным вирусом. Векторы могут независимо размножаться в клетке хозяина или могут интегрироваться в геном клетки хозяина. Высшие эукариоты могут трансформироваться плазмидами, но обычно они инфицируются рекомбинантным вирусом, например рекомбинантным вирусом коровьей оспы. Коровья оспа особенно предпочтительна, так как инфицирование коровьей оспой останавливает экспрессию белков клетки хозяина. В настоящее время в число предпочтительных клеток хозяина включают линии клеток HeLa и плазмоцитомы. В представленной системе это означает, что E1 и E2 накапливаются как главные гликозилированные разновидности в ЭПС хозяина.

Так как pE1 и pE2 будут преобладающими гликопротеинами с маннозным окончанием, их легко выделить в чистом виде из клетки при помощи лектинов, таких как агглютинин Galanthus nivalus (GNA), который связывает терминальные остатки маннозы.

Протеины, которые в естественном виде экспрессируются как гликопротеины с маннозным окончанием, в физиологии млекопитающих встречаются относительно редко. В большинстве случаев гликопротеин млекопитающих имеет маннозное окончание только в транзиторной межуточной форме, образующейся в процессе гликозилирования. То, что белки оболочки ВГС, рекомбинантно экспрессированные, содержат оканчивающийся на маннозу гликозильный остаток или (в меньшей степени) N-ацетилглюкозамин, означает, что белки ВГС и цельные вироны можно отделять и частично очищать от эндогенных протеинов при помощи лектинов, специфичных для терминальной маннозы или N-ацетилглюкозамина. Рекомбинантные протеины кажутся аутентичными и считаются в сущности идентичными белкам оболочки, обнаруживаемым в зрелом свободном вириoне или форме протеина, связанной с оболочкой клетки. Поэтому можно использовать лектины, такие как GNA, для протеинов с маннозным окончанием и WGA (агглютинин семян пшеницы) и их эквиваленты для протеинов с N-ацетилглюкозаминовым окончанием. Можно пользоваться лектинами, фиксированными на твердой фазе (напр., колонкой лектин-сефароза), чтобы отделить E1 и E2 от нaдосадочной жидкости культуры клеток или от других жидкостей, например, для очистки во время получения антигенов для вакцины или для использования в иммуноанализе.

Альтернативно можно предоставить подходящий лектин для выделения E1, E2 или вирионов ВГС из жидкости или тканей лиц с подозрением на ВГС инфекцию. Так как гликопротеины с маннозным окончанием относительно редки, такая процедура должна служить очистке белков, присутствующих в пробе, существенно ослабляя интенсивность фона. После связывания лектинами протеин ВГС может быть обнаружен при помощи анти-ВГС антител.

Если присутствуют цельные вирионы, можно альтернативно обнаружить нуклеиновые кислоты ВГС при помощи методик полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) или другими способами накопления нуклеиновых кислот, направленными на сохранение областей генома ВГС (например, некодирующей области 5"). Этот способ позволяет изолировать и дать характеристику различных штаммов ВГС, независимо от отклонений или вариантов антигенности, например, в случаях, когда новый штамм не дает перекрестной иммунной реакции со штаммом, применявшимся для получения антител. Есть много других способов использовать преимущества уникального распознавания гликопротеинов с маннозным окончанием при помощи отдельных лектинов.

Например, можно инкубировать пробы, предположительно содержащие вирионы или протеины ВГС, с биотин- или авидинмеченными лектинами, и осаждать протеинлектиновый комплекс при помощи авидина или биотина. Можно также использовать сродство лектина к протеинам ВГС, чтобы нацелить соединения на вирионы с терапевтической целью, например, конъюгировав антивирусное соединение с GNA. Альтернативно можно использовать подходящие лектины для того, чтобы удалить гликопротеины с маннозным окончанием из сыворотки или плазмы, снизив или исключив, таким образом, риск загрязнения ВГС.

В настоящее время предпочтительно изолировать асиалогликопротеины E1 и/или E2 из неочищенных лизатов клеток путем инкубирования с иммобилизированным протеином, связывающим маннозу, особенно с лектином, таким как Кон А или GNA. Клетки лизируются, например, механическим разрушением в гипотоническом буфере, потом лизат центрифугируют, чтобы приготовить постнуклеарный лизат, и еще раз центрифугируют, чтобы получить неочищенную фракцию микросомальных мембран. Неочищенная фракция мембран последовательно солюбилизируется в буфере, содержащем детергент, такой как тритон X-100, NP40 или им подобный. Этот экстракт с детергентом в дальнейшем очищают от нерастворимых частиц центрифугированием, и образовавшийся осветленный лизат инкубируют в хроматографической колонке, содержащей иммобилизированный протеин, связывающий маннозу, предпочтительно GNA, фиксированный к твердой подложке, такой как агароза или сефароза, в течение времени, достаточного для связывания, обычно на 16-20 ч. Затем суспензию пропускают через колонку до тех пор, пока E1/E2 начинают появляться в элюенте, затем инкубируют в колонке в течение времени, достаточном для связывания, обычно около 12-24 ч. Связанный материал затем промывается дополнительным количеством буфера с детергентом (например, тритоном X-100, NP40 или им подобным) и элюируется маннозой для того, чтобы получить очищенный асиалогликопротеин.

При элюции предпочтительно элюировать только до тех пор, пока в элюенте не начнет появляться протеин, в этот момент элюирование останавливается, и колонка уравновешивается в течение 2-3 ч, прежде чем приступить к элюированию протеина. Полагают, что это дает достаточно времени для того, чтобы прореагировали оставшиеся крупные белковые агрегаты. В случаях когда E1 и E2 экспрессируются вместе в естественном виде (т.е. без процессирования домена связи с оболочкой), существенная часть асиалогликопротеинов появляется в виде агрегатов E1: E2. При исследовании под электронным микроскопом значительная часть этих агрегатов выглядит как частицы почти сферической формы диаметром около 40 нм, что соответствует предполагаемым размерам интактного вируса. Эти частицы кажутся самоорганизующимися вирусными субъединицами.

Ожидается, что эти агрегаты должны образовывать четвертичную структуру, очень схожую со структурой аутентичных частиц вириона ВГС, и поэтому ожидается, что они будут служить как высокоиммуногенная вакцина.

Комплексы E1/E2 могут быть далее очищены гель-хроматографией на основной среде, например, фрактогель-ДЭАЭ или ДЭАЭ-сефароза. При помощи фрактогель-ДЭАЭ гель-хроматографии можно получить комплексы E1/A2, очищенные приблизительно до 60-80%. E1 можно далее очистить обработкой лизинпротеазой, потому что у E1 есть 0-1 Лиз остаток. Обработка комплекса лизинпротеазой разрушает E2 и позволяет легко отделить E1.

Тканевая специфичность ВГС вместе с наблюдением, что гликопротеины оболочки ВГС имеют маннозные окончания, наводят на мысль, что вирус использует рецептор маннозы или асиалогликопротеиновый рецептор (АСГР) для того, чтобы проникнуть в клетку хозяина. Маннозные рецепторы обнаружены на макрофагах и клетках синусоидов печени, тогда как АСГР обнаружен на паренхиматозныx гепатоцитах. Поэтому должно быть возможным выращивать ВГС на клетках хозяина, экспрессирующих один или оба эти рецептора. Можно либо использовать первичные культуры клеток, которые естественно экспрессируют этот рецептор, в условиях, сохраняющих рецептор, или можно ввести в другую линию клеток, такую как HeLa, CHO, COS и т.п., вектор, способствующий эксперссии этого рецептора.

Клонирование рецептора маннозы и его трансфекция и экспрессия в фибробластах были продемонстрированы M.E. Taylor et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:12156-62.

Клонирование и секвенирование АСГР описаны K. Drickamer et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:770-78 и M. Spiess et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 82: 6465-69; трансфекция и экспрессия функционального АСГР в НТС гомозитных типирующих клетках крыс описана M. McPhaul и P. Berg, Pros. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8863-67 и M. McPhaul и P. Berg, Mol. Cell Biol. (1987) 7: 1841-47.

Таким образом, возможна транcфекция одного или обоих рецепторов в подходящие линии клеток и использование получившихся клеток в качестве хозяина для размножения ВГС в культуре. Серийные пассажи ВГС в такой культуре должны привести к возникновению ослабленных штаммов, подходящих для использования в качестве живой вакцины. Можно либо использовать первичные культуры клеток, которые естественным образом экспрессируют этот рецептор, создавая условия, при которых рецептор сохраняется, или можно произвести трансфекцию другой линии клеток, такой как HeLa, CHO, COS и т.п., вектором, обеспечивающим экспрессию рецептора.

Клонирование рецептора маннозы и его трансфекция и экспрессирование в фибробластах были показаны Taylor et al. (см. выше), тогда как трансфекция и экспрессия функционального АСГР в гомозиготных типирующих клетках крыс описана McPhaul et al. (см. выше).

В настоящее время предпочтительно пользоваться бессмертной линией клеток, трансфицированных одним или обоими рекомбинантными рецепторами.

Иммуногенные композиции можно приготовить известными способами. Настоящие композиции включают иммуногенное количество полипептидa, например, композиции частиц E1, E2 или E1/E2, обычно соединенного с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно далее включающие адъювант.

Если желателен "коктейль", комбинация полипептидов ВГС для повышения эффективности, можно, например, смешать вместе антигены E1 и E2. Агрегаты вирусоподобных частиц E1/E2 представят, как ожидается, особенно полезный вакцинный антиген. Иммуногенные композиции можно вводить животным, чтобы вызвать образование антител или получить источник антител, или создать защитный иммунитет у животного.

Фармацевтически приемлемые носители включают любой носитель, который сам не вызывает образования антител, опасных для индивидуума, получающего композицию. Подходящими носителями обычно являются крупные, медленно разрушающиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полилактокислоты, полигликолевые кислоты, полимеры аминокислот, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам.

В число предпочтительных адъювантов, усиливающих эффективность композиции, входят, но ими не ограничиваются гидроксид алюминия (алум), N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr - MDP), найденный в патенте США N 4.606.918, N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor - MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1"-2"- дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE) и RIBI, который содержит три компонента, извлеченныx из бактерий, монофосфорил-липид A, димиколат трехалозы и скелет клеточной стенки (MPL + IDM + CWS) в 2%-ной эмульсии сквален/твин 80.

Дополнительно можно использовать такие адъюванты, как стимулон (Cambridge Bioscience, Morcester, MA). Далее в препаратах, не предназначенных для людей, и в исследовательских целях можно пользоваться полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) и неполным адъювантом Фрейнда (НАФ).

Иммуногенные композиции обычно будут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, этанол и т.д. Дополнительно в число таких наполнителей могут быть включены вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие средства, буферные вещества для поддержания pH и т.п.

Типичные иммуногенные композиции готовятся в форме, пригодной для инъекций, либо как жидкий раствор, либо как эмульсия, также можно приготовить сухие формы, пригодные для растворения в жидком наполнителе с образованием раствора или суспензии перед инъекцией. Препараты также могут быть эмульгированы или инкапсулированы в липосомы для усиления адъювантного эффекта.

Иммуногенные композиции, используемые как вакцины, включают иммунологически эффективное количество полипептида ВГС, а также другие вышеупомянутые компоненты по потребности.

"Иммунологически эффективное количество" означает, что введение такого количества индивидууму либо однократно, либо как одна из нескольких последующих доз эффективно для лечения, как определено выше. Это количество варьирует в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, которому оно вводится, таксономической группы индивидуумов, подвергающихся воздействию (например, человекообразные приматы, приматы и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом, штамма ВГС, вызвавшего инфекцию, и других, имеющих значение факторов.

Ожидается, что это количество будет колебаться в довольно широких пределах, которые можно определить при обычных испытаниях.

Эти самособирающиеся агрегаты E1/E2 могут также служить носителями вакцины для гетерологичных (не-ВГС) гаптенов таким же образом, как поверхностный антиген гепатита B (см. европейскую патентную заявку 174.444). При таком применении агрегаты E1/E2 представляют иммуногенный носитель, способный стимулировать иммунный ответ на гаптены или антигены, конъюгированные с агрегатом.

Антиген можно конъюгировать либо обычными химическими способами, либо можно клонировать его в ген, кодирующий E1 и/или E2, с локализацией, соответствующей гидрофильной области белка.

Иммуногенные композиции принято вводить парентерально, обычно путем подкожных или внутримышечных инъекций. Дополнительные прописи, подходящие для других способов введения, включают прописи для перорального введения и суппозиториев. Лечебная дозировка может быть введена однократно или в несколько приемов по схеме. Вакцину можно вводить в соединение с другими иммунорегулирующими средствами.

B. Примеры.

Данные ниже примеры представлены в качестве дальнейшего руководства для практического специалиста и не должны рассматриваться как какие-либо ограничения изобретения.

Пример 1. (Клонирование и экспрессия).

(A)

Векторы строили из плазмид, содержащих 5"-часть генома ВГС, как описано в EP 318.216 и EP 388.232. Кассета ВГС (S/B) содержит фрагмент ДНК Stul-BgLII, кодирующий 5" конец полипротеина от Мет₁ до Лей₉₀₆, начиная с нуклеотида-63, относящегося к Мет₁. Сюда входят белок сердцевины (С), протеин E1 (также иногда упоминаемый как S), протеин E2 (также упоминаемый как HCl) и 5" часть области HC2a. После экспрессии этого конструкта его разделяют протеолизом на отдельные белки C, E1 и E2.

Кассета ВГС (A/B) содержит фрагмент ДНК ApaLI-BgLII, кодирующий 5"-конец полипротеина от Мет₁ до Лей₉₀₆, начиная с нуклеотида-6, относящегося к Мет₁. Сюда входят белок сердцевины (С), протеин Е1 (также иногда упоминаемый как S), протеин Е2 (также упоминаемый как НC1) и 5" - часть области НС2а.

После экспрессии этого конструкта отдельные протеины С, Е1 и Е2 получают протеолитической обработкой.

Кассета С-Е1 (S/B) (часть StuI-BamHI) содержит 5" - конец от Мет₁ до Лей₃₄₀ (сайт BamHI в гене). Экспрессия этой кассеты приводит к экспрессии С и в какой-то степени усеченного Е1 (Е1"). Часть, срезанная с 3" - конца, является гидрофобной областью, которая считается служащей как сигнал транслокации.

Кассета HCI (В/В) (часть BamHI - BgLII) содержит маленькую часть 3" от Е1 (от Мет₃₆₄), весь Е2 и часть НС2а (до Лей₉₀₆). В этом конструкте фрагмент Е1 служит транслокационным сигналом.

Кассета ТРА-НС1 использует лидер активатора тканевого плазминогена человека (tPA) как транслокационный сигнал вместо 3" - части Е1. Эта кассета содержит усеченную форму Е2 или Гли₄₀₆ до Глу₆₆₁, у которой утрачен гидрофобный конец 3".

Каждая кассета встраивается в вектор pGEM3Z (Promega) с или без синтетической бета-глобиновой некодирующей последовательности для транскрипции и трансляции in vitro, пользуясь экспрессией Т7 и ретикулоцита кролика.

Векторы рекомбинатного вируса коровьей оспы (rVV) готовили встраиванием кассет в плазмиду pSc11 (полученную от Dr.B.Moss, NIH), после чего следует рекомбинация с вирусом коровьей оспы, как описано Charkrabarty et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5:3403-09.

(B)

Альтернативный экспрессирующий вектор получен путем встраивания ВГС (А/В) в pS59 ( полученную от Dr. B.Moss, NIH) между сайтами StuI и SpeI с последующей рекомбинацией с вирусом коровьей оспы, как описано Charkrabarty et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5:3403-09.

(С)

Клетки HeLa собирали центрифугированием в течение 7 мин при 2000 об/мин при комнатной температуре в стерильных центрифужных флаконах емкостью 500 мл (ротор JA-10).

Осадки ресуспендировали в дополнительной культуральной среде (Joklik модифицированная МЕМ Spinner среда + 5% лошадиной сыворотки и гентамицин) ("центрифужная среда") до окончательной концентрации 2 10⁷ клеток /мл. Разрушенная ультразвуком неочищенная масса вируса vv/SC59-ВГС добавлялась к множеству инфекции в 8 бляшкообразующих единиц/клетку, и смесь перемешивали 30 мин при 37^oC. Затем инфицированные клетки переносили в центрифужный флакон, содержащий 8 л центрифужной среды, и инкубировали в течение 3 дней при 37^oC.

Затем культивированные клетки собирали центрифугированием, и осадки ресуспендировали в буфере (10 мМ трис-HCL, pH 9,0 152 мл). Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором 40 мл Dounce (50 ударов) и ядра осаждали центрифугированием (5 мин, 1600 об/мин, 4^oC, ротор JA-20). Ядерные осадки ресуспендировали в трис-буфере (24 мл), регомогенизировали и снова осаждали, собирали все супернатанты.

Собранный лизат разделяли на порции в 10 мл и разрушали ультразвуком 3 х 30 мин в соникаторе в виде винного рога при средней мощности. Обработанный лизат (15 мл) наслаивали на 17 мл подушки из сахарозы (36%) в центрифужных пробирках SW28 и центрифугировали в течение 80 минут при 13500 об/мин при 40^oC для того, чтобы осадить вирус. Осадок вируса ресуспендировали в 1 мл трисбуфера (1 мМ трис-HCL, pH 9,0) и замораживали при -80^oC.

Пример 2. (Сопоставление продуктов in vitro и in vivo).

(A)

Е1 и Е2 экспрессировали оба in vitro и in viro и метилы ³⁵S- Мет применявшиеся векторы, описанные выше, в примере 1. Клетки BSC-40 и HeLa инфицировали векторами rVV для экспрессии in vivo. Питательную среду и лизаты клеток исследовали на рекомбинантные белки. Проводили иммунопреципитацию продуктов человеческой ВГС иммунной сывороткой, тогда как протеины in vitro анализировали прямым методом. Образовавшиеся белки анализировали хроматографией SDS-PAGE.

Ретикулоцитарная экспрессионная система (pGEM3Z с ВГС (S/B) или ВГС (А/В)) продуцировала протеины С, Е1 и Е2 с молекулярной массой приблизительно 18 кД, 35 кД и 72 кД соответственно. Лизаты клеток BSC-40 и HeLa после трансфекции rVV, содержащим ВГС (S/B), ВГС (А/В) или С-Е1 (S/B) давали те же самые протеины. Из-за того что ретикулоцитарная система не обеспечивает эффективного процессирования в аппарате Гольджи и поэтому не представляет сиаловую кислоту, то продукты как полученные in vitro, так и полученные in vivo, проявляют одинаковую подвижность, наводит на мысль, что протеины не сиалилируются in vivo. Только вектор rVV, содержащий ТРА-HС1, вызывает какую-то внеклеточную секрецию Е2 с измененной подвижностью, соответствующей сиалилированию.

(В)

ВГС (S/B) экспрессировали in vitro и инкубировали с набором биотинилированных лектинов: GNA, SNA, PNA, WGA и Koн A.

После инкубации комплексы собирали на авидинакриловых шариках, промывали, элюировали буфером Лэмли для образца и анализировали хроматографией SDS-PAGE. Результаты показали, что Е1 и Е2 фиксированы на GNA и Kон A, что указывает на наличие маннозы. GNA связывается с терминальными группами, тогда как Кон А связывается с любой альфасвязанной маннозой. Отсутствие связывания с SNA, PNA и WGA указывает, что ни один из белков не содержит сиаловую кислоту, галактоза-N-ацетилгалактозамин или N- ацетилглюкозамин.

(С)

Е1 и Е2 с радиоактивной меткой получали в клетках BSC-40 путем инфицирования rVV, содержащим ВГС (S/B) (vv/SCII-ВГС) и производили иммунопреципитацию человеческой ВГС⁺ имунной сывороткой. Половину осажденного материала обрабатывали нейраминидазой в течение ночи, чтобы удалить любую сиаловую кислоту.

После обработки обработанные и необработанные протеины анализировали хроматографией SDS-PAGE. Не наблюдалось значительного различия в подвижности, что указывает на отсутствие сиалилирования in vivo.

(D)

Е1 и Е2 с радиоактивной меткой получали в клетках BSC-40 путем инфицирования rVV, содержащим ВГС (А/В) (vv/SC59-ВГС), и производили либо иммунопреципитацию ВГС⁺ сывороткой человека, либо осаждали биотинилированным лектином GNA, связанным с акриловыми шариками, используя vv/SCII, свободный от ВГС последовательностей в качестве контроля. Преципитаты исследовали хроматографией SDS-PAGE. Данные показали, что Е1 и Е2 были главными разновидностями протеинов с маннозным окончанием в vv/SC 59-ВГС инфицированных клетках. GNA так же эффективно, как антисыворотка человека, осаждал Е1 и Е2 из среды культуры клеток. Наблюдали компонент в 25 кД, но он казался специфическим для клеток, инфицированных коровьей оспой.

Пример 3. (Очистка при помощи лектина).

(A)

В клетки HeLa S3 инокулировали массу очищенного vv/SC 59-ВГС вируса с высоким титром при множестве инфекции в 5 бляшкообразующих единиц/клетку, и смесь перемешивали 30 мин при 37^oC. Затем инфицированные клетки переносили в центрифужный флакон, содержащий 8 л центрифужной среды и инкубировали 3 дня при 37^oC. Клетки снова собирали центрифугированием и ресуспендировали в гипотоническом буфере (20 мМ HEPES, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 120 мл) на льду. Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором Dounce (50 ударов), и ядра осаждали центрифугированием (5 мин, 1600 об/мин, 4^oC, ротор JA-20). Осадки собирали, ресуспендировали в 48 мл гипотонического буфера, регомогенизировали, рецентрифугировали, снова собирали и замораживали при -80^oC.

Затем замороженные супернатанты размораживали и фракцию микросомальных мембран из постнуклеарного лизата изолировали центрифугированием в течение 20 мин в роторе JA-20 при 13500 об/мин при 4^oC. Супернатант удаляли отсасыванием.

Осадки взбалтывали в 96 мл детергентного буфера (20 мМ трис- HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DDT, 0,5% тритон X-100, pH 7,5) и гомогенизировали (50 ударов). Продукт осветляли центрифугированием в течение 20 мин при 13500 об/мин, 4^oC и собирали супернатанты.

Колонка с GNA-агарозой (1 x 3 см, 3 мг GNA/мл шариков, 6 мл объем сорбента, Vector Labs, Burlingame, CA) предварительно уравновешивалась детергентным буфером. Образец супернатанта вносили в колонку с рециркуляцией при скорости тока 1 мл/мин в течение 16 - 20 ч при 4^oC. Затем колонку промывали детергентным буфером.

Очищенные протеины E1/E2 элюировали альфа-D-маннозидом (0,9 М в детергентном буфере) при скорости тока 0,5 мл/мин. Элюцию останавливали при появлении E1/E2 в элюенте и давали колонке вновь уравновеситься в течение 2-3 ч. Фракции анализировали вестерн-блоттированием и окраской серебром. Пиковые фракции собирали вместе и облучали УФ для инактивации любых остатков вируса коровьей оспы.

(B)

Асиалогликопротеины E1 и E2, очищенные GNA-агарозой, подвергали седиментации в 20 - 60%-ном глицерине. Градиенты разделяли и анализировали протеины методами SDS-PAGE и вестерн-блоттированием. Пятна зондировали GNA для идентификации E1 и E2.

Результаты указывают на присутствие гетеродимера E1:E2, осаждающегося с ожидаемой скоростью (т.е. позиция, характерная для протеина в 110 кД). Также появляются более крупные агрегаты протеинов оболочки ВГС. Также появлялись E2:E2 гомодимеры. Казалось, что E2 преобладал над E1 в более крупных разновидностях, хотя отдельные разновидности E1:E2 также выявлялись.

Более крупные агрегаты осаждались значительно скорее, чем тиреоглобулиновый маркер.

(C)

E1 и E2, очищенные GNA-агарозой, осаждали в градиенте 20 - 60% глицерина с 1 мМ EDTA. Фракции анализировали SDS-PAGE с и без бета-меркаптоэтанола (МЕ). Количество E1 и E2 почти не зависело от присутствия МЕ, что указывало на отсутствие дисульфидных связей между гетеродимерами.

(D)

Комплексы E1/E2 (приблизительно 40% чистоты) анализировали на Coulter DM-4 анализаторе субмикронных частиц. Обнаружен материал в диапазоне 20 - 60 нм.

(E)

Комплексы E1/E2 (очищенные приблизительно на 40%) исследовали под электронным микроскопом с негативным контрастированием фосфорно-вольфрамовой кислотой.

На электронных микрограммах выявлено присутствие частиц сферической формы диаметром около 40 нм. Комплексы E1/E2 инкубировали с ВГС + иммунной сывороткой человека, потом исследовали под ЭМ с негативным контрастированием. Наблюдались комплексы антител, содержащие крупные агрегаты и более мелкие частицы.

Пример 4. (Хроматографическая очистка).

(A)

Очищенный лектином GNA материал, приготовленный, как описано в примере 3, (0,5 - 0,8 мл) разводили в 10 раз буфером A (20 мМ трис-Cl буфер, pH 8,0; 1 мМ EDTA) и наносили на колонку Fractogel EMD DEAE-650 1,8 x 1,5 cм (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, каталожный N 16883), уравновешенную в буфере A.

Фракцию протеина, содержащую E1/E2, элюировали тем же буфером со скоростью 0,2 мл/мин и собирали 1 мл фракций. Фракции, содержащие E1 и E2 (определенные по SDS-PAGE), соединяли и хранили при -80^oC.

(B)

Материал, очищенный вышеуказанным способом (A) по результатам SDS-PAGE, был очищен на 60 - 80%. Идентификация полос предполагаемых E1 и E2 подтверждалась анализом N-терминальной последовательности после осуществления методики переноса. Для этого материала E1/E2, очищенный Fractogel-DEAE, восстанавливали добавлением буфера Лэммли (pH 6,8, 0,06 М трис-Cl, 2,3% SDS, 10% глицерина, 0,72 М бета-меркаптоэтанола) и кипятили 3 мин. Затем пробу загружали в 10%- ный полиакриламидный гель.

После хроматографии SDS-PAGE протеин переносили на 0,2 мкм мембрану из поливинилиден-дифторида (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Полоски, соответствующие предполагаемым протеинам 1 и E2, вырезали из пятна и подвергали N-терминальному аминокислотному анализу, хотя при приготовлении материала не предпринимали особых мер для предотвращения аминотерминального блокирования. Первые 15 циклов показали, что образец E1 имеет последовательность: Тир-Глн-Вал-Арг-Х-Сер-Тре-Гли-Х-Тир-Гис-Вал-Х-Асн-Асп, тогда как последовательность E2 была: Тре-Гис-Вал-Тре-Гли-Х-Х-Ала-Гли-Гис-Х-Вал-Х-Гли-Фен. Эти данные определения аминокислотной последовательности согласуются с тем, что ожидалось по соответствующим последовательностям ДНК.

Продукт E1/E2, очищенный, как описано выше, хромаграфией Fractogel-DEDE, считается агрегированным на том основании, что большое количество E1 и E2 совместно элюируют в область свободного объема хроматографической колонки гель-фильтрации Bio-Sil TSK-4000 SW. Это указывает, что в естественных условиях значительное количество комплекса E1/E2 имеет молекулярную массу не менее 800 кД. Также наблюдалось присутствие материала E1/Е2 с молекулярной массой около 650 кД.