пептид, обладающий иммуносупрессивным свойством

Формула изобретения

Пептид, обладающий иммуносупрессивным свойством, формулы

H-A-D-Trp-J

где A-D-Glu или D-iGlu; J-OH или замещенный амид (C₁-C₃).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к новым биологически активным веществам, обладающих иммунорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Актуальность разработки новых безвредных иммунорегулирующих пептидов, способных остановить прогрессирующий рост таких заболеваний, как злокачественные новообразования, сепсис, хронические и вялотекущие инфекции, развивающиеся на фоне иммунодефицитных состояний, подтверждается большим количеством исследований, проведенных в этой области.

Наиболее распространенным способом выявления новых пептидов является выделение активных пептидных фракций из суммарных тканевых экстрактов, фракционированию и очистке вплоть до выделения индивидуального вещества и его идентификации (SU N 1600047, SU N1638849, SU N 1737798). В практической медицине широко известны в качестве регуляторов иммунных процессов тимусные экстракты, в частности, тимозин фракция 5 / Goldstein A.L., Guna A., Latz M. M. , Hardy H.A. White A./, тималин /CH, N 6595-86/. Эти экстракты состоят из комплекса веществ полипептидной природы и получение их из природных источников ограничено сложностью производства, малым выходом активных веществ и значительной вариабельностью их физико-химических характеристик и биологических свойств. Кроме того, из-за присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов при их использовании у больных иногда возникают побочные явления. Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания синтетических пептидных препаратов. В настоящее время осуществлен синтез ряда пептидов, обладающих иммунорегуляторными свойствами: SU N 1582393, SU N 1541821, SU N 1518956, EP N 230052, EP N 406931, US N 5021551, US N 5013723. Каждый из полученных синтетических пептидов с ограниченным комплексом необходимых свойств обладает высокой активностью, низкой токсичностью, отсутствием побочных эффектов, которые определяют их возможное применение в медицине.

В настоящем изобретении предлагается новый пептид как средство, обладающее иммуносупрессивным свойством, формулы

H-A-D-Trp-Y,

где

A-D-Glu или D-iGlu;

Y - OH или замещенный амид (C₁-C₃).

Способ получения пептида иллюстрируется следующим примером.

Пример 1.

Получение H-iD-Glu-D-Trp-OH и H-D-Glu-D-Trp-OH

1. Получение Boc-D-Glu-OH

14,7 (0,1 моль) H-D-Glu-OH растворяли 200 мм дистиллированной воды, одномолярным раствором KOH доводили pH до 10,2 и при интенсивном помешивании добавляли раствор 33,0 г (0,3 моль) BOC₂О в диоксане. Следили за величиной pH на pH-стате. После окончания реакции смесь помещали в делительную воронку, экстрагировали из щелочной среды 3 х 150 мм этилацетатом, водную фазу медленно подкисляли 0,2% раствором серной кислоты до pH 3,0 и экстрагировали Boc-D-Glu-OH в органическую фазу (3 х 200 мм). Органический слой промывали 3 х 200 мм насыщенным раствором Na₂SO₄ до нейтральной среды, сушили над Na₂SO₄. Упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Выход: 16,7 г (68%).

2. Получение смеси Boc-D-Glu-D-Trp-OH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH

16,7 г (0,068 моль) Boc-D-Glu-OH растворяли в 200 мл диметилформамида, охлаждали до 0^o и при перемешивании добавляли раствор 20,6 г (0,1 моль) N,N" -дициклогексилкарбодиимида в 100 мл диметилформамида. Смесь перемешивали 4 часа при +4^oC и оставляли на 8 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, осадок промывали 2 х 50 мм диметилформамидом, фильтрат упаривали в вакууме до 1/2 объема и добавляли при охлаждении до +4^oC и интенсивном перемешивании 24,3 (0,1 моль) H-D-Trp-OK. Раствор оставляли постепенно нагреваться до комнатной температуры. Об окончании реакции следили по ТСХ в системе (хлороформ : этилацетат: метанол 6:3:1) до исчезновения пятна внутреннего ангидрида BOC-D-Glu кислоты. Остатки дициклогексинмочевины отфильтровывали, диметилформамид упаривали в вакууме. К маслообразному остатку добавляли 200 мм этилацетата и 200 мл 0,2% раствора серной кислоты. Органический слой отделяли, промывали до нейтральной среды насыщенным раствором Na₂SO₄, сушили над Na₂SO₄, этилацетатный раствор упаривали в вакууме. Полученный маслообразный осадок представлял собой смесь Boc-D-Glu-D-Trp-OH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH. Общий выход масла составил 25,4 г (70%).

3. Получение Boc-D-Glu-D-Trp-OH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH

25,4 г (0,048 моль) смеси растворяли в 200 мл муравьиной кислоты, перемешивали при 40^oC в течение 1 часа и упаривали в вакууме до маслообразного состояния.

Разделение и очистку пептидов проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Сефадексом SP-PEA в градиенте 0,01-0,2 М пиридинацетатного буфера. Выход: 5,7 г (35%) H-iD-Glu-D-Trp-OH и 5,7 г (35%) H-D-Glu-D-Trp-OH.

В результате изучения физико-химических свойств пептида были получены следующие его характеристики:

Первичная структура - H-iD-Glu-D-Trp-OH

Брутто формула - C₁₆H₂₀N₃O₅

Молекулярный вес - 334,35

Внешний вид - белый с желтоватым оттенком или серый порошок.

Растворимость - легко растворим в воде, умеренно в спирте, практически нерастворим в хлороформе.

УФ-спектр в области 250-300 нм имеет максимум 2802 мм, плечо 2872 нм.

Значения R_f1 = 0,30 в системе (хлороформ-метанол-32% уксусная кислота = 60:45:20) и R_f2 = 0,52 ( в системе бутанол - пиридин-вода-уксусная кислота = 5:5:4:1).

Биологическая активность нового пептида H-A-D-Trp-Y, где A-D-Glu или D-iGlu, Y-OH или замещенный амид (C₁-C₃).

Пример 2.

Действие на популяцию гемопоэтических клеток-предшественников. В качестве теста использовали образование стволовыми кроветворными клетками колоний на селезенках облученных мышей.

а) Обработка пептидом H-D-Glu-D-Trp-Y клеток интактного костного мозга in vitro.

Клетки интактного костного мозга инкубировали с пептидом в различных концентрациях (0,0025-10 мкг/мл) в течение 1 часа при 37^oС. Затем суспензию без отмывки вводили облученным в летальной дозе мышам-репиентам. Через 8 суток животных умерщвляли и проводили подсчет колоний на селезенках. В таблице 1 приведены результаты.

Как видно из данных инкубация клеток костного мозга с пептидом в диапазоне концентраций 0,0025 - 0,01 мкг/мл приводит к снижению выхода колоний примерно на 30-40%, препарат в концентрациях 0,02 - 10 мкг/мл подавляет рост колоний более, чем на 60%. Группе мышей наряду с клетками костного мозга, обработанными пептидом (0,02 мкг/мл), были введены тимоциды. В данном случае зарегистрирована отмена подавления роста колоний пептидом, что свидетельствует о действии пептида не непосредственно на кроветворные клетки-предшественники, а на клетки-регуляторы, участвующие наряду с ними в селезеночном колониеобразовании.

б) Обработка пептидом H-D-iGlu-D-Trp-Y клеток интактного костного мозга in vitro.

Обработку проводили аналогично примеру 2(а). В таблице 2 приведены результаты.

Как видно пептид способствует более, чем двухкратному снижению выхода селезеночных колоний.

в) Обработка пептидом H-D-Glu-D-Trp-Y клеток интактного костного мозга in vivo.

Пептид в различных концентрациях вводили внутрибрюшинно (в/б) интактным мышам. Через 2 часа, 1 или 2-е суток их умерщвляли, готовили суспензии клеток костного мозга и вводили летально облученным (8,5 Гр) мышам. Группе реципиентов наряду с костным мозгом вводили тимоциты. Через 9 суток подсчитывали количество колоний на селезенках. Подобрана оптимальная доза пептида (0,02 мкг/мл), с которой проводятся все дальнейшие эксперименты. В таблице 3 приведены результаты.

Как видно из данных пептид, введенный мышам-донорам костного мозга, способствует снижению количества экзоколоний на селезенках и уменьшению размеров пула KOE-C. Наибольший ингибирующий эффект проявляется через 2 суток после введения пептида, дополнительное введение реципициентам тимоцитов отменяет его. Проанализирована также клеточность костного мозга, тимуса и селезенки у мышей после введения пептида. Установлено, что количество клеток в костном мозге мышей несколько снижено по сравнению с контрольным уровнем, относительное на мг веса органа количество клеток в тимусе остается неизменным, а в селезенке уменьшается (контроль - 28,010⁷3,0, пептид - 18,210⁷).

г) Обработка пептидом H-D-iGlu-D-Trp-Y клеток интактного костного мозга in vivo.

Обработку проводили аналогично примеру 2(в). В таблице 4 приведены результаты.

Как видно из данных ингибирующее влияние пептида на популяцию KOE-C костного мозга и их колониеобразующую активность проявляется уже через 2 часа после инъекции пептида мышам и сохраняется 2 суток. Тимоциты полностью отменяют эффект пептида.

Пример 3.

Влияние H-A-D-Trp-Y, где A - D-Glu или D-iClu, Y - OH или замещенный амид (C₁-C₃), на восстановление популяции кроветворных клеток-предшественников после цитопений различного происхождения.

а) В качестве агента, вызывающего опустошение костного мозга взято ионизирующее излучение. Мышей-доноров облучали в дозе 4 Гр. Пептид вводили внутрибрюшинно, 10 мкг/кг за 1 час, 2 суток и 1 сутки до облучения. Костный мозг из бедренной кости извлекали у животных на 8 сутки после воздействия ионизирующей радиации, так как именно в этот срок начинается экспоненциальное восстановление как общей клеточной массы, так и численности популяции кроветворных клеток-предшественников в опустошенном в результате облучения костном мозге. В таблице 5 приведены количественные значения ядросодержащих клеток в костном мозге мышей, облученных в дозе 4 Гр и обработанных пептидом.

Установлено, что количество ядросодержащих клеток в костном мозге после инъекции H-D-iGlu-D-Trp-OH превышает контрольные значения при всех трех сроках применения пептида, причем за 2 суток наблюдается максимальный, статистически значимый эффект. Введение пептида H-D-Glu-D-Trp-OH не вызывало изменения значения данного параметра в опытных группах по сравнению с контролем.

Кроме того на 8 сутки регистрируется и резкое статистически достоверное повышение числа кроветворных клеток-предшественников в костном мозге облученных в дозе 4 Гр мышей, получивших пептид за 2 суток до воздействия ионизирующей радиации. Содержание KOE-C в костном мозге мышей, облученных в дозе 4 Гр и обработанных пептидами, представлено в таблице 6.

Проведены исследования восстановления численности кариоцитов и кроветворных клеток-предшественников в костном мозге бедренной кости после облучения в дозе 4 Гр и инъекции пептида в течение 14 суток групп мышей по 6 в каждой. Сроки введения пептида следующие: 1 сутки и 2 суток до воздействия ионизирующей радиации, внутрибрюшинно, 10 мкг/кг. Результаты представлены в таблице 7.

Как показали эксперименты, предварительное введение пептидов за 2 суток до облучения приводит к выраженной интенсификации восстановления клеточности костного мозга, число кариоцитов в этом случае уже к 7 суткам после облучения достигает значений интактного контроля и долее того, в присутствии пептида H-D-iGlu-D-Trp-OH продолжает увеличиваться вплоть до 14 суток.

б) В качестве другого агента, вызывающего опустошение гемопоэтической системы, был выбран цитостатик - цитозар, который вводили раз в сутки трижды строго через 24 часа. Пептид мыши по 12 в каждой группе получали трижды через каждые 2 часа после второй инъекции цитозара внутрибрюшинно, 10 мкг/кг. Животных умерщвляли через 3 часа после последней инъекции цитозара и определяли в костном мозге бедренной кости содержание кариоцитов и количество KOE-C. Результаты представлены в таблице 8.

Установлено, что в присутствии пептида, который не влияет на общее содержание кариоцитов в костном мозге, сохраняется жизнеспособность кроветворных клеток-предшественников почти на 70% больше, чем в контроле.

В итоге исследования по влиянию пептида на восстановление кроветворения после воздействия повреждающих факторов (облучение, цитостатики) позволяют утверждать, что пептид, как иммуносупрессор, способствует интенсивному восстановлению пула кроветворных клеток-предшественников (KOE-C) при инъецировании до воздействия повреждающих факторов, т.е. пептид защищает от повреждения.

Пример 4.

Изучена возможность использовать ингибирующий пролиферацию пептид для предотвращения развития вторичной болезни у летально облученных реципиентов, которым был пересажен аллогенный костный мозг.

При двух различных схемах инъекций пептида установлено почти двукратное увеличение 45-ти суточной выживаемости опытных мышей по сравнению с контролем. Кроме того у мышей, пролеченных пептидом, наблюдалось замедленное развитие вторичной болезни по тесту потери веса примерно на 2 недели, а также на 45-ые сутки у выживших мышей опытных групп вес селезенки превышал значения этого параметра в контроле.

Результаты свидетельствуют о возможности применения пептида в качестве иммунодепресанта.

С целью изучения безопасности пептида проводили изучение его острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ "Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ", М., 1985 г. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении 1000 кратной дозы пептид не оказывал острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть его LD₅₀. Таким образом новый биологически активный пептид не является токсичным.

Согласно настоящему изобретению новый пептид формулы

H-A-D-Trp-Y,

где

A-D-Glu или D-iGlu;

Y - OH или замещенный амид (C₁-C₃),

обладает биологической активностью, описанной в примерах 2-4 и может найти применение в медицине.