способ получения генетически модифицированных бактерий sorangium / polyangium и рекомбинантная плазмидная молекула днк

Формула изобретения

1. Способ получения генетически модифицированных бактерий Sorangium/Polyangium, восприимчивых к конъюгативному переносу генетического материала микроорганизмов, заключающийся в том, что выделяют генетический материал из бактерий Sorangium/Polyangium или получают генетический материал гомологичного или гетерологичного микробного происхождения или их комбинацию, которые содержат один или несколько участков ДНК, гомологичных или в основном гомологичных соответствующей области хромосомы бактерий Sorangium/Polyangium, при этом генетический материал, не содержащий гомологичных или в основном гомологичных участков соответствующей области хромосомы бактерий Sorangium/Polyangium, искусственно связывают с гомологичными или в основном гомологичными участками ДНК Sorangium/Polyangium, далее клонируют генетический материал в подходящую рекомбинантную плазмидную ДНК Esherichia coli, Preudomonas, Actinomycetes, Sorangium, Polyangium, которые содержат экспрессируемую ДНК, функционально связанную с последовательностями экспрессии, способными функционировать в бактериальных клетках Sorangium/Polyangium

без нарушения функциональной целостности встроенной ДНК, и полученным вектором трансформируют организм-хозяин, затем трансформированные бактериальные клетки культивируют и отбирают позитивные трансформанты по экспрессии селективного маркера.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед культивированием трансформированных бактериальных клеток выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК с клонированным генетическим материалом из организма-хозяина и трансформируют выделенной рекомбинантной плазмидной ДНК организм-донор, способный к конъюгативному переносу в Sorangium/Polyangium, затем переносят рекомбинантную плазмидную ДНК в Sorangium/Polyangium, причем рекомбинантная плазмидная ДНК интегрируется путем гомологичной рекомбинации в сайт, который точно определяется гомологией между встраиваемой ДНК и собственной ДНК бактерий на хромосоме Sorangium/Polyangium независимо от структурных элементом, присутствующих на хромосоме бактерий Sorangium/Polyangium, или от специфических транспозиционных событий.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что генетический материал искусственно связывают (фланкируют) гомологичными или в основном гомологичными участками ДНК.

4. Способ по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что организм-донор и организм-хозяин трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК, которая содержит один или несколько экспрессирующих гомологичных или в основном гомологичных участков ДНК.

5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что степень гомологии между указанными гомологичными участками ДНК и соответствующими областями хромосомы Sorangium/Polyangium составляет 60 - 100%.

6. Способ по любому из пп.1 - 5, отличающийся тем, что указанные гомологичные участки ДНК охватывают по меньшей мере 100 п.о.

7. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что указанные гомологичные участки ДНК охватывают 0,3 - 4,0 т.п.о.

8. Способ по любому из пп.1 - 7, отличающийся тем, что в качестве организма-хозяина для клонирования генетического материала и/или в качестве организма-донора при конъюгативном переносе ДНК используют микроорганизмы группы, включающей Esherichia coli, Preudomonas, Actinomycetes, Sorangium, Polyangium.

9. Способ по пп.1 - 8, отличающийся тем, что в качестве организма-хозяина и/или в качестве организма-донора используют штамм бактерий, дефектный по рестрикции или негативный по рестрикции.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что клонирование генетического материала проводят непосредственно в организме-доноре, способном к конъюгативному переносу.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерии Sorangium/Polyangium непосредственно перед конъюгативным переносом подвергают кратковременному нагреву.

12. Способ по п.1 или 10, отличающийся тем, что нагрев проводят в течение 1 - 120 мин при 35 - 60^oС.

13. Рекомбинантная плазмидная молекула ДНК DSM N 6321, обеспечивающая интеграцию генетического материала в определенный сайт в геноме бактерий группы Sorangium/Polyangium, причем указанная молекула ДНК содержит вставку ДНК размером 3,5 кб.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа нового типа генетической манипуляции миксобактериями, предпочтительно миксобактериями группы сорангиум/полиангиум, в результате чего впервые возможно направленное применение техники рекомбинантных ДНК к этой группе организмов.

В частности, изобретение касается способа переноса ДНК-последовательностей гомологичного или гетерологичного происхождения или комбинации ДНК-последовательностей гомологичного или гетерологичного происхождения в хромосому упомянутых миксобактерий посредством гомологичной рекомбинации, а также с помощью этого способа получаемых генетически модифицированных миксобактерий. Охвачены также рекомбинантные ДНК молекулы, плазмиды и векторы, которые особенно пригодны для применения в способе в соответствии с изобретением, а также генетически модифицированные миксобактерии из группы сорангиум/полиангиум, содержащие эксогенные ДНК гомологичного и/или гетерологичного происхождения.

В случае миксобактерий из группы сорангиум/полиангиум речь идет о высокоспециализированных организмах, которые чаще всего можно обнаружить в конечных пробах, отмершем растительном материале или в навозе животных. Характерным для этой группы микроорганизмов является их способность использовать целлюлозу или содержащие целлюлозу продукты расщепления в качестве единственного C-источника. Другим отличительным признаком этой группы является их способность производства высокоактивных вторичных метаболитов.

Между тем описаны многочисленные штаммы из этой группы, которые в состоянии синтезировать растительно-микробицидные соединения. Особое значение при этом имеют так называемые сорафены, микроциклические соединения, которые обладают благоприятным биоцидным спектром по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, в частности по отношению к фитопатогенным грибам. Эти соединения обладают очень выгодными куративными, системными и, в частности, превентивными свойствами, и могут быть использованы для защиты многих культурных растений (EP 0358 606).

Известны также другие представители из группы миксобактерий, которые могут синтезировать высокоактивные соединения с антибиоцидными свойствами (Райхенбах и др., 1988). Благодаря значению этих соединений возникает большой интерес к тому, чтобы понять гeнетические основы их синтеза и получить, таким образом, возможность в соответствующем случае целенаправленно влиять на них.

Предпосылкой этому является создание способа, который позволяет прямую и предпочтительно целенаправленную генетическую манипуляцию этими организмами при применении техники рекомбинантных ДНК, например путем целенаправленного встраивания новых генов или генных фрагментов или иных ДНК-последовательностей, включая полностью плазмиды, в генофонд миксобактерий.

Отдельные представители из группы миксобактерий были уже ранее предметом исследований в этом направлении. Особый интерес представляет при этом в первую очередь Myxococcus xanthus, уже достаточно хорошо исследованная миксобактерия, для которой уже описаны даже различные способы переноса гена. Так, например, очень интенсивно использовали колифаг P1 сначала для переноса транспозона Тn5 в Myxococcus xanthus хромосому (Кайзер (1984); Кунер и Кайзер (1981)) и позже затем обратного переноса клонированных в Myxococcus xanthus генов на первоначальном E.coli хозяина (О"Коннер и Зусман (1983), Шимкетс и др. (1983)).

Другой способ для переноса гена основан на применении плазмиды RP4, который обладает очень широким кругом хозяев. Бретон и др. (1985) смогли показать, что эту плазмиду можно перенести из E.coli в Myxococcus xanthus и там стабильно интегрировать в хромосому. На основании этих свойств Бретону и др. (1986), а также Бретону и Квеспину-Мишелю (1987) удалось интегрировать чужой ген в хромосу Muxococcus xanthus. Как следует из исследований Яoуа и др. (1987, 1989), наблюдаемая интеграция основана с большой вероятностью на так называемой "сайт-специфической рекомбинации". Она ограничена определенным, пространственно узко ограниченным местом внутри Myxococcus xanthus хромосомы и происходит над одной или нескольких так называемых "горячих точках" на RP4 плазмиде. Кроме того, в процессе исследований, проведенных в рамках изобретения, показано, что обсужденная здесь, ранее известная Mexococcus система на бактериях из группы сорангиум/полиангиум неприменима. Предположительно у этих организмов отсутствуют необходимые для "сайт-специфической рекомбинации" специфические структурные элементы на хромосомах. Кроме того, было обнаружено, что у этих организмов также нет стабильной транспозиции, например при применении транспозона Тn5.

Задачей, которая должна быть решена в рамках изобретения, является создание универсально применимого способа для генетической манипуляции всеми миксобактериями, но, в частности, миксобактериями из группы сорангиум/полиангиум, который свободен от ранее названных ограничений известных способов и который, таким образом, позволяет осуществить не направленный или предпочтительно направленный перенос генетического материала в миксобактериях независимо от вышеуказанных структурных элементов на хромосоме миксобактерии или от специфической осуществленной транспозиции.

Это может быть решено в соответствии с изобретением, например, тем, что получают генетическую конструкцию, в частности плазмидные векторы, которые благодаря своему специфическому строению могут прикрепляться к любому месту внутри хромосомы и которые не связаны, как при ранее известных способах, с определенным заданным функциональной организацией хромосомы миксобактерий или примененной плазмиды ("горячие точки") местом интеграции на геноме или зависят от транспозиции интегрированного транспозонса.

Изобретение касается, таким образом, в первую очередь способа генетической манипуляции бактериями из отряда миксобактерий, но, в частности, миксобактерий из группы сорангиум/полиангиум, который отличается тем, что генетический материал гомологичного или гетерологичного происхождения или комбинацию генетического материала гомологичного, а также гетерологичного происхождения переносят в клетки миксобактерии путем гомологичной рекомбинации произвольно, или при соответствующем знании структурной или функциональной организации бактериального генома целенаправленно интегрируют в точно определенный сайт благодаря существующей между переносимой ДНК и собственной бактериальной ДНК гомологии в хромосому указанных миксобактерий независимо от вышеуказанных структурных элементов на миксобактериальной хромосоме или от специфической осуществленной транспозиции.

Способ в соответствии с изобретением генетической манипуляции бактериями из отряда миксобактерий отличается, в частности, тем, что а) генетический материал гомологичного или гетерологичного происхождения, который естественно содержит один или несколько отрезков ДНK, которые являются гомологичными или по крайней мере в основном гомологичными соответствующей области на миксобактериальной хромосоме или б) генетический материал, который естественно не содержит гомологичных или по крайней мере в основном гомологичных соответствующей области на миксобактериальной хромосоме отрезков и который поэтому искусственно связывают с помощью известной техники рекомбинантных ДНК с такими гомологичными или в основном гомологичными ДНК-отрезками, в клетку миксобактерии вводят и путем гомологичной рекомбинации интегрируют в точно определенный благодаря гомомологии, существующей между вводимой ДНК и собственно бактериальной ДНК, сайт на хромосоме указанной миксобактерии, независимо от вышеуказанных структурных элементов на миксобактериальной хромосоме или от специфической осуществленной транспозиции.

Интеграции генетического материала в бактериальные хромосомы способствует гомологичная рекомбинация с помощью одного или нескольких ДНК-отрезков внутри вносимой ДНК, которые являются гомологичными или по крайней мере в основном гомологичными соответствующей области на хромосоме миксобактерии. Они, таким образом, не связаны с определенными хромосомальными структурами и могут встраиваться в принципе в любой произвольный сайт на бактериальной хромосоме.

Применяемые в рамках способа в соответствии с изобретением гомологичные отрезки ДНК не должны, таким образом, обладать 100%-ной идентичностью с соответствующими отрезками на миксобактериальной хромосоме, чтобы можно было осуществить необходимую рекомбинацию. Часто достаточно, если эти отрезки ДНК в основном являются гомологичными соответствующим областям бактериального генома, т. е. если они имеют степень гомологичности от 60 до 100%, предпочтительно от 80 до 100% и особенно предпочтительно от 90 до 100%.

Под "гомологичными" отрезками ДНК следует в дальнейшем понимать также такие отрезки, которые не имеют 100%-ной идентичности соответствующим областям на миксобактериальной хромосоме, но которые по крайней мере "в основном гомологичны".

Гомологичные отрезки ДНК могут быть выделены при этом либо из целевого организма самого, либо из других организмов, например, после фрагментации соответствующего генома. При знании последовательности образцов ДНК, предусмотренных соответственно для интеграции в миксобактериальную хромосому, соответствующие фрагменты ДНК, которые являются гомологичными, или по крайней мере в основном гомологичными этим хромосомным отрезкам, само собой разумеется, получаются также синтетическим путем.

В случае применяемых в рамках изобретения ДНК-отрезков гомологичного происхождения речь идет при этом либо о ДНК-отрезках известной последовательности, либо о полученных случайно, например, после рестрикционной обработки гомологичной ДНК.

При знании структурной и функциональной организации соответствующей части бактериального генома способ в соответствии с изобретением открывает, таким образом, впервые возможность целенаправленной, предсказуемой модификации существующего в миксобактериальном геноме гена (in situ-модификация) путем обмена природных или искусственно модифицированных генов, фрагментов генов или иных естественных ДНК-последовательностей с гомологичными ДНК-отрезками внутри бактериального генома. Кроме того, способ в соответствии с изобретением делает возможной целевую идентификацию функции отдельного гена внутри всего генома миксобактерии с помощью целевого исключения гена ("gene disruption") или путем комплементации генов, которые были до этого инактивированы путем применения другого способа, в частности способа мутaгенеза.

Наряду с целенаправленной и, таким образом, очень эффективной in situ-модификацией собственно бактериальных генов (целевой мутагенез) способ в соответствии с изобретением открывает ряд других возможностей применения, как, например, встраивание дополнительных копий генов в области с известной высокой степенью экспрессии, а также элиминирование и, таким образом, исключение нежелательных генов. Кроме этого, могут найти применение следующие дополнительные возможности:

- встраивание сильных и регулируемых промоторов перед собственно бактериальными генами с интересующими функциями,

- клонирование генов различного происхождения в миксобактериях, в частности, в миксобактериях из группы сорангиум/полиангиум,

- клонирование и экспрессия генов различного происхождения,

- обратный перенос внесенной ДНК в другие микроорганизмы, как, например, в E.coli для дальнейшей обработки;

- использование гетерологичной ДНК вектора, во-первых, в качестве радиоактивного зонда для знания соседнего с местом интеграции миксобактериального фрагмента и, во-вторых, в качестве матрицы для ампфликации в рамках удлинения цепи с использованием полимеразы.

Другим предметом изобретения является способ получения генетически модифицированных бактерий из отряда миксобактерий, в частности, бактерий из группы сорангиум/полиангиум, который отличается тем, что а₁) генетический материал гомологичного или гетерологичного происхождения или комбинация генетического материала гомологичного или гетерологичного происхождения, который содержит естественно один или несколько отрезков ДНК, которые являются гомологичными или по крайней мере в основном гомологичными соответствующей области на миксобактериальной хромосоме, или а₂) генетический материал, который естественно не содержит гомологичных или по крайней мере в основном гомологичных соответствующей области на миксобактериальном хромосоме отрезков и поэтому искусственно с помощью известной техники рекомбинантных ДНК связанный с такими гомологичными или в основном гомологичными отрезками ДНК, вводят в клетку миксобактерии и там путем гомологичной рекомбинации интегрируют в точно определенный благодаря существующей между вводимой ДНК и собственно бактериальной ДНК гомологии сайт на хромосоме названных миксобактерий независимо от вышеуказанных структурных элементов на миксобактериальной хромосомы или от осуществленной транспозиции, и б) позитивные трансформанты с помощью известных способов отбирают и культивируют в качестве чистой культуры.

Изобретение делает возможной в первую очередь целенаправленную генетическую манипуляцию с геном миксобактерий, в частности из группы сорангиум/полиангиум, причем интеграция генетического материала может происходить в зависимости от соответствующей выбранной цели либо с помощью гомологичного отрезка ДНК известной последовательности, либо с помощью произвольно выбранных гомологичных отрезков неизвестной последовательности.

Изобретение охватывает также рекомбинантные молекулы ДНК, которые являются генетическим материалом, таким как, например, гены или фрагменты генов или иные естественные последовательности ДНК, который кодирует новые и ценные желательные свойства и с помощью гомологичной рекомбинации произвольно либо при знании структурной или функциональной организации бактериального генома также целенаправленно интегрируют в точно определенный благодаря существующей гомологии между вносимой ДНК и собственно бактериальной ДНК в бактериальный геном, а также способ получения упомянутых рекомбинантных молекул ДНК.

Кроме того, изобретение касается потомства упомянутых модифицированных миксобактерий, а также мутантов и вариантов их, которые содержат упомянутые рекомбинантные ДНK-молекулы.

В дальнейшем тексте описания применяют ряд выражений, которые употребительны в технологии рекомбинантных ДНK, а также в бактериальной генетике.

Чтобы обеспечить ясность и единообразие описания и формулы изобретения, а также объемы, которыe охватывают эти выражения, приводим следующие определения:

Ген(ы) или ДНК гетерологичного происхождения.

Последовательность ДНК, которая кодирует специфический продукт или продукты или выполняет биологическую функцию и которая переносится от другого вида как таковая; упомянутая ДНК-последовательность обозначается также как чужой ген или чужая ДНК или экзогенная ДНК.

Ген(ы) или ДНК гомологичного происхождения.

Последовательность ДНК, которая кодирует специфический продукт или продукты или выполняет биологическую функцию и происходит из такого же вида, в который переносится упомянутый ген. Обозначается также как экзогенная ДНК.

Гомология ДНК.

Степень соответствия между двумя или несколькими ДНК-последовательностями.

Синтетический(ие) ген(ы) или ДНК.

ДНК-последовательность, которая кодирует специфический продукт или продукты или выполняет биологическую функцию и получен(а) синтетическим путем.

Промотор.

Kонтрольная последовательность экспрессии ДНК, которая обеспечивает транскрипцию каждой произвольной гомологичной или гетерологичной последовательности ДНК в клетке-хозяинe, поскольку упомянутая последовательность гена операбельным путем связана с таким промотором и она в упомянутой клетке-хозяинe является активной.

Терминаторная последовательность.

Последовательность ДНК на конце транскрипционной единицы, которая является сигналом окончания процесса транскрипции.

Сверхпродуцирующий промотор (OPP).

Промотор, который в состоянии оказывать воздействие в клетке-хозяинe на экспрессию каждой функционально присоединенной операбельным путем последовательности(ей) в такой степени (измерена в виде ДНК или количества полипептида), которая явно выше, чем она естественно в клетках-хозяевах, которые не трансформированы упомянутым OPP.

3"5"Нетранслируемый участок.

Направленный вверх или вниз кодирующей ДНК-отрезков, который хотя и транскрибирован в MPHK, но не транслирован в полипептид. Этот участок содержит регуляторную последовательность, как, например, место связывания с рибосомами (5").

Вектор экспрессии ДНК.

Вектор для клонирования, как, например, плазмида или бактериофаг, который содержит все сигнальные последовательности, которые необходимы для экспрессии встроенной в него ДНК в подходящей клетке-хозяине.

ДНК вектора переноса.

Вектор переноса, как, например, плазмида или бактериофаг, который позволяет переносить генетический материал в подходящую клетку-хозяинa.

Гомологичная рекомбинация.

Взаимный обмен фрагментов ДНК между гомологичными ДНК-молекулами.

Мутанты, варианты.

Спонтанно или искусственно при применении известных методов, как, например, УФ-облучения, обработки мутагенными агентами и пр., полученного производного микроорганизма, которое еще имеет признаки и свойства исходного штамма, в соответствии с изобретением, которое получено благодаря трансформации экзогенной ДНК.

В рамках изобретения впервые удалось предложить способ, который делает возможной предпочтительную целенаправленную генетическую манипуляцию с геном бактерий из отряда миксобактерий, в частности бактерий из группы сорангиум/полиангиум так, что генетический материал случайно или при соответствующем знании структурной или функциональной организации бактериального генома направленно может быть интегрирован в точно определенную позицию бактериального генома и там экспрессирован независимо от вышеуказанных структурных элементов на миксобактериальной хромосоме или от специфического осуществления трансмиссии.

Способ в соответствии с изобретением базируется при этом в основном на знании, что можно экзогенный генетический материал встроить с помощью гомологичной рекомбинации в геном миксобактерий, причем наряду с естественными можно применять также искусственно модифицированные и/или синтетические гены или фрагменты генов или иные последовательности ДНК, включая все плазмиды, если они имеют отрезки ДНК или фланкирующие эти отрезки ДНК, последовательности, которые обладают достаточной для рекомбинации гомологией подлежащих переносу отрезков миксобактериального генома.

Применяемые в рамках изобретения гомологичные ДНК-отрезка не должны при этом обладать 100%-ной идентичностью с соответствующими отрезками на миксобактериальной хромосоме, чтобы можно было осуществить необходимый процесс рекомбинации. Чаще всего достаточно, если эти отрезки ДНК являются в основном гомологичными соответствующей области на бактериальном геноме, т.е. если они имеют степень гомологии от 60 до 100%, предпочтительно от 80 до 100% и особенно предпочтительно от 90 до 100%.

Величина упомянутой степени гомологии может варьировать, но самое меньшее должна составлять 100 п.о. Предпочтительными в рамках изобретения являются области гомологии, которые лежат в интервале от 0,3 до 4 кб, но предпочтительно от 1 до 3 кб.

Существенной составной частью изобретения является рекомбинантная ДНК-молекула, которая благодаря своей специфической структуре делает возможным направленное встраивание генов или фрагментов генов, или иных представляющих интерес ДНК-последовательностей, включая все плазмиды, в геном целевой клетки с помощью гомологичной рекомбинации ранее указанным способом.

В частности, изобретение касается рекомбинантных ДНК-молекул, которые позволяют осуществлять целенаправленную интеграцию генетического материала такого, как, например, гены, фрагменты генов или иные ДНК-фрагменты, в определенный сайт генома миксобактерий, в частности миксобактерий из группы сорангиум/полиангиум, и которые отличаются тем, что они содержат подлежащие интеграции ДНК, и упомянутая ДНК обладает в массе гомологией по отношению к соответствующим ДНК-участкам миксобактериального генома или фланкирована такой гомологичной ДНК-последовательностью так, что при трансформации содержащих гомологичные ДНК области клеток миксобактерий имеет место ненаправленная или предпочтительно направленная интеграция упомянутой подлежащей интегрированию ДНК в точно определенное благодаря существующей между переносимой ДНК и собственно бактериальной ДНК гомологии место миксобактериального генома путем гомологичной рекомбинаци независимо от вышеуказанных структурных элементов на миксобактериальном геноме или от специфической прoизошедшей транспозиции.

Упомянутые рекомбинантные ДНК-молекулы можно очень просто получить тем, что подлежащую интегрированию ДНК, которая обладает вышеуказанными свойствами, а) выделяют из подходящего источника, или б) если упомянутая подлежащая интегрированию ДНК не содержит естественно гомологичные и по меньшей мере в основном гомологичные соответствующему участку генома миксобактерий отрезки, их искусственно присоединяют с помощью известной техники рекомбинантных ДНК к соответствующим гомологичным или в основном гомологичным ДНК-отрезкам.

Поскольку в случае ДНК, подлежащей интегрированию, речь идет о способной экспрессироваться ДНК-последовательности, выгодно, если ее операбельным образом соединяют с функциональными в бактериальной клетке экспрессионными сигналами, а также в соответствующем случае фланкируют ДНК-отрезками, которые обладают гомологией по отношению к определенному участку бактериального генома. Эти фланкирующие, гомологичные ДНК-отрезки находятся предпочтительными в виде составной части кольцевой ДНК-молекулы.

В последнем нет необходимости, если упомянутая способная экспрессироваться ДНК-последовательность уже обладает большой гомологией по отношению к соответствующему ДНК-участку бактериального генома, так что прямой обмен этой ДНК-последовательности с упомянутой гомологичной геномной ДНК может быть осуществлен с помощью гомологичной рекомбинации.

Наряду с двунитевой ДНК в способе в соответствии с изобретением можно использовать также однонитевую ДНК, а также частично однонитевую ДНК.

Для применения в способе в соответствии с изобретением следует иметь в виду как гомологичные, так и гетерологичные ген(ы) или ДНК-последовательности, а также синтетический(ие) ген(ы) или ДНК-последовательности с определениями в рамках изобретения.

Подлежащие интегрированию ДНК-последовательности могут быть сконструированы при этом исключительно из геномной, из кДНК или синтетической ДНК. Другая возможность состоит в конструкции гибридной ДНК-последовательности, состоящей как из кДНК, так и из геномной ДНК и/или синтетической ДНК.

В этом случае кДНК происходит из того же самого гена или отрезка ДНК, как и геномная ДНК или как кДНК, так и геномная ДНК могут происходить из различных генов или отрезков ДНК. В каждом случае как геномная ДНК и/или кДНК получены из одинаковых или различных генов или отрезков ДНК.

Если часть ДНК-последовательности содержит более одного гена или ДНК-отрезка, они могут принадлежать либо одному и тому же организму, нескольким организмам, различным штаммам или вариантам такого же типа, или различным видам того же семейства, или происходить из организмов, которые принадлежат более чем к одному семейству той или ной таксономической единице.

Чтобы осуществить экспрессию структурного гена в бактериальной клетке, можно кодирующие последовательности гена в соответствующем случае сначала операбельным путем сочетать с функционально способной в миксобактериальной клетке экспрессионной последовательностью.

Способная экспрессироваться гибридная конструкция гена изобретения содержит, как правило, наряду сo структурным(ми) геном(ами) также экспрессионные сигналы, которые включают как промоторные и терминаторные последовательности, так и предпочтительно другие регуляторные последоватлеьности 3" и 5" нетранслированных районов.

Каждый промотор и каждый терминатор, который в состоянии воздействовать на экспрессию способной экспрессироваться ДНК-последовательности в миксобактериях, можно применять как составную часть гибридной конструкции гена.

Промоторы, которые следует иметь в виду для применения в способе в соответствии с изобретением, являются, например,

- индуцируемый с помощью света промотора миксококус хантус (EP 310619);

- иной миксококус хантус промотора;

- промоторы актиномицетов, в частности стрептомицетов;

- E. coli, промоторы, как, например, Tac(гидрид) - P_L - или Trp-промоторы.

Подходящие последовательности терминации, которые могут найти применение в рамках изобретения, описаны, например, Розенбергом и Коуртом (1979), а также Гентцем и др. (1981).

Образованная таким образом функциональная единица, состоящая из гена и активных в миксобактериальной клетке экспрессионных сигналов, может наконец в соответствующем случае быть фланкирована одним или несколькими ДНК-отрезками, которые в массе обладают гомологией по отношению к соответствующим ДНК-участкам внутри миксобактериальной клетки так, чтобы при трансформации миксобактериальной клетки, содержащей упомянутый гомологичный регион, имела место случайная или предпочтительно целенаправленная интеграция фланкированной о гомологичной ДНК-последовательностью последовательности гена в определенной благодаря имеющейся гомологии между переносимой ДНК и собственно бактериальной ДНК сайт бактериального генома в результате гомологичной рекомбинации. Фланкирующие гомологичные отрезки ДНК находятся при этом в рамках этого изобретения предпочтительно в виде составной части кольцевой ДНК-молекулы.

В случае предпочтительной формы осуществления изобретения переносимую ДНК интегрируют в плазмиду, которая содержит либо уже гомологичные ДНК-отрезки, либо их вводят клонированием в более поздний момент времени.

Если таким образом должны не только отдельные гены или фрагменты генов, но и все плазмидные-ДНК, которые могут содержать упомянутые гены или фрагменты генов, интегрироваться в геном миксобактерий, то достаточно упомянутую гомологичную ДНК-последовательность склонировать в определенном месте плазмидой-ДНК, при этом, однако, по возможности должны оставаться функциональными гены, предусмотренные для экспрессии. Даже в этом случае можно таким образом подлежащую интегрированию ДНК-последовательностью.

Наряду со структурными генами можно применять также любые другие желаемые гены или фрагменты генов или иные полезныe ДНК-последовательности, как, например, соединительные места молекул регуляторов, промоторы, последовательности терминаторов и пр.

В результате выбора подходящей последовательности ДНК гомологичного или гетерологичного происхождения, которые обладают достаточно большой гомологией по отношению к соответствующим отрезкам бактериального генома и, таким образом, делают возможным обмен генетического материала путем гомологичной рекомбинации, впервые стало возможным гены или иные ДНК-последовательности интегрировать направленно в заранее определенный сайт миксобактериального генома и там в соответствующем случае экспрессировать.

Степень необходимой для обмена путем гомологичной рекомбинацией гомологии между гомологичными ДНК-отрезками и соответствующим геномным регионам ДНК зависит от различных параметров и должна поэтому отвечать соответствующим требованиям в зависимости от примененных ДНК-последовательностей. По сегодняшним представлениям исходят из того, что гомологичный регион, который охватывает по меньшей мере 100 п.o. достаточен, чтобы осуществить желаемую рекомбинацию.

Предпочтительным в рамках изобретения является регион гомологичный, который распространяется от 0,3 до 4 кб но предпочтительно от 1 до 3 кб.

Для применения в качестве гомологичных ДНК-отрезков в рамках этого изобретения пригодны в первую очередь ДНК-последовательности гомологичного происхождения, которые получены в результате выделения всей миксобактериальной ДНК и последующего переваривания соответствующими рестрикционными ферментами.

При знании ДНК-последовательности упомянутого гомологичного ДНК-фрагмента его можно получить, само собой разумеется, также и синтетически.

Но, кроме того, можно применять также гомологичные ДНК-отрезки гетерологичного происхождения, которые выделены нe непосредственно из генома целевого организма, а, например, из родственного организма, и обладают таким образом не необходимой 100%-ной идентичностью соответствующим ДНК-регионом о генома целевого организма, а они являются в основном гомологичными, т.е. обладают степенью гомологии от 60 до 100%, предпочтительно от 80 до 100% и особенно предпочтительно от 90 до 100%.

Существенную составную часть изобретения составляет, таким образом, способ целевой генетической манипуляции бактериями из отряда миксобактерий, который отличается тем, что генетический материал гомологичного происхождения или комбинацию генетического материала гомологичного, а также гетерологичного происхождения переносят в клетки миксобактерий и там путем гомологичной рекомбинации направленно интегрируют в точно определенный благодаря существующей гомологии сайт на хромосоме упомянутых миксобактерий.

В рамках изобретения, таким образом, стало впервые возможно с помощью получения соответствующей гибридной конструкции гена вышеописанным способом осуществить направленную модификацию собственных генов бактерий внутри миксобактериального генома или встроить дополнительные гены или иные ДНК-фрагменты в геном миксобактерий. Если интеграцию осуществляют внутри функционального гена или оперона, то это приводит, как правило, к его инактивации и как следствие к фенотипичному дефекту, который можно обнаружить.

В частности, при этом можно поступить так, что клетки миксобактерий трансформируют одной из ранее описанных рекомбинантных ДНК-молекул, при этом содержащиеся в упомянутой рекомбинантной ДНК молекуле гены, гибридные конструкции гена или иные ДНК-фрагменты интегрируют в результате гомологичной рекомбинации случайно или предпочтительно направленно в определенный благодаря существующей гомологии сайт и, таким образом, заранее определяемый сайт бактериального генома.

В случае предпочтительного осуществления изобретения перенос генетического материала в миксобактерии, в частности в миксобактерии из группы сорангиум/полиангиум, проводят не направленно через конъюгативный перенос плазмидной ДНК от донорской клетки в реципиентную клетку сорангиум/полиангиум.

Для получения подходящих плазмид, которые обладают достаточной для интеграции путем гомологичной рекомбинации гомологией с миксобактериальной хромосомой, можно, например, сначала изолировать общую ДНК миксобактерий и ее непосредственно после этого фрагментировать. Эту фрагментацию можно проводить либо механически в результате воздействия режущих сил или предпочтительно при применении подходящего фермента.

Из множества полученных фрагментов затем можно выделить фрагменты подходящей величины и непосредственно после этого клонировать в подходящую плазмиду. Лигирование гомологичных ДНК-фрагментов, а также ДНК фрагментов гомологичного и гетерологичного происхождения в подходящий вектор клонирования осуществляют с помощью стандартных методов, как например, описанных Маниатисом и др. (1982).

При этом, как правило, вектор и подлежащую интегрированию ДНК-последовательность разрезают сначала подходящими ферментами. Подходящими ферментами являются, например, таковые, которые производят фрагменты с тупыми концами, как, например, Smal, Hpal и EcoRv или ферменты, которые образуют липкие концы, как, например, EcoRI, SacI, BamHI, SalI, PvuI и пр.

Как фрагменты с тупыми концами, так и таковые с липкими концами, которые являются взаимно комплементарными, могут соединяться с помощью подходящих ДНК-лигаз снова в единую ДНК-молекулу.

Тупые концы могут также быть получены в результате обработки ДНК-фрагментов, которые обладают липкими концами, с помощью фрагмента Кленова E.coli ДНК-полимеразы в результате заполнения липких концов соответствующими комплементарными нуклеотидами.

С другой стороны, можно также получить искусственно липкие концы, например, путем присоединения комплементарных гомополимерных хвостов к концам желаемой ДНК-последовательности, а также разрезанного вектора при применении терминальной деоксинуклеотид-трансферазы или в результате присоединения синтетических олигонуклеотидных последовательностей (линкера), которые несут место остаточного разреза и последующего разреза соответствующим ферментом.

В принципе для получения и амплификации ранее описанных конструкций, которые содержат ДНК фрагменты гомологичного или комбинацию ДНК фрагментов гомологичного и гетерологичного происхождения, можно применять все доступные векторы клонирования, как, например, плазмидный или бактериофагный вектор, если они имеют репликационные и контрольные последовательности, которые происходят от видов, которые совместимы с клеткой-хозяином.

Вектор клонирования несет, как правило, область начала репликации кроме того, специфические гены, которые приводят к фенотипическим селекционным признакам в трансформированной клетке-хозяине, в частности к устойчивости по отношению к антибиотикам. Трансформированные векторы могут быть селектированы в зависимости от этого фенотипичного маркера после трансформации в клетке-хозяине.

Селективные фенотипичные маркеры, которые могут найти применение в рамках изобретения, охватывают, например, без ограничения объема изобретения устойчивость против ампициллина, тетрациклина, хлорамфеникола, гигромицина, G418, канамицина, неомицина и блеомицина. В качестве дополнительных селективных маркеров можно, например, назвать недостаточность по определенным аминокислотам.

Предпочтительными в рамках изобретения являются в первую очередь E.coli плазмиды, например, применяемая в рамках изобретения плазмида pSUP2021.

В качестве клетки-хозяина для ранее описанного клонирования в рамках изобретения следует иметь в виду в первую очередь прокариоты, включая бактериального хозяина, как, например, A.tumefaciens, E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescens далее псевдомонады, актиномицеты, сальмонеллы, а также сами миксобактерии.

Особенно предпочтительным хозяином являeтся E.coli, как, например, E. coli штамма HB101 (см. таблицу).

Компетентные клетки E.coli штамма HB101 получают при этом с помощью способа, применяемого обычно для трансформации E.coli (см. "общая техника рекомбинантных ДНК").

После трансформации и последующей инкубации в подходящей среде полученные в результате этого колонии подвергают диффенцильному скринингу путем выделения участков на селективной среде. Непосредственно после этого из таких колоний, которые содержат плазмиды с клонированными ДНК-фрагментами, можно выделить соответствующие ДНК-плазмиды.

Таким образом, получают рекомбинантные плазмиды различной величины. После анализа на устойчивость можно затем плазмиды подходящей величины выбирать для последующего переноса плазмиды ДНК в миксобактериальной клетке. Этот ДНК перенос можно осуществлять при этом непосредственно либо предпочтительно через промежуточного хозяина (донорская клетка) в рамках совместимого переноса.

Существенной составной частью изобретения является поэтому конструкция плазмид, которые наряду с гомологичными отрезками могут содержать также одну или несколько генных конструкций, состоящих из одного или нескольких структурных генов, или иных желательных генов, или генных фрагментов, которые в соответствующем случае операбельным путем соединены со способными быть функциональными в бактериальной клетке экспрессионными сигналами, или иные полезные ДНК-последовательности. Гомологичные ДНК-фрагменты могут при этом полностью состоять из собственных бактериальных (миксобактериальных) геномных отрезков и, таким образом, иметь полностью гомологичное происхождение или могут также наряду с гомологичными отрезками содержать более или менее выраженное количество гетерологичного происхождения. Возможно также применение гомологичных ДНК-отрезков чисто гетерологичного происхождения.

В другой стадии способа можно эти плазмиды применять для того, чтобы ранее описанные генетические конструкции, которые содержат в соответствующем случае структурный ген, который кодирует целевой генный продукт, переносить в миксобактериальную клетку и там интегрировать в бактериальный геном.

Перенос генетических в соответствии с изобретением конструкций в миксобактериальные клетки осуществляют различными типами и способами. Предпочтительным в рамках изобретения является совместимый перенос от донорской клетки в реципиенты миксобактерий.

В рамках этого совместимого переноса можно ДНК, подлежащую переносу, либо сначала, как описано выше, клонировать в обычно применяемом векторе клонирования и непосредственно после этого трансформировать в подходящего промежуточного хозяина, который выполняет роль донорской клетки. Обратный путь через промежуточного хозяина можно избежать, если применяют штамм-хозяин, который пригоден как для клонирования ДНК, так и для использования в качестве донорской клетки в рамках конъюгации.

Промежуточными хозяевами, которые в рамках изобретения могут найти применение в качестве донорских клеток, являются в основном прокариотические клетки, выбранные из группы, состоящей из E.coli псевдомонад, актиномицетов, сальмонелл, а также самих миксобактерий.

Предпосылкой для совместимого переноса плазмидной ДНК от клетки-донора в реципиент является существование функции переноса (tra) и мобилизирующей функции (mob). При этом мобилизирующая функция должна содержать по меньшей мере область начала переноса (oriT) и лежать на плазмиде, подлежащей переносу. Напротив, функция переноса (tra) является локализованной либо на плазмиде, либо на плазмиде-помощнике или является интегрированной в хромосому донорской клетки.

Плазмиды, которые выполняют вышеуказанные предпосылки и поэтому являются предпочтительными в рамках изобретения, попадают в основном в группу совместимости Q P, T, N, W и Coll. Прототипом P-группы плазмид является плазмида RP4. Особенно предпочтительной в рамках изобретения является плазмида pSUP2021, которая содержит 1,9 кб фрагмент плазмиды RP4, который как составная часть mоb-функции (RP4 mob), включает область начала переноса (oriT). Другие плазмиды с mob-функцией (RP4) как, например, pSuP101, pSuP301, pSuP401, pSuP201, pSu202, pSuP203 или pSuP205, а также выделенные из них производные (Симон и др., 1988) могут быть также применены в рамках способа в соответствии с изобретением.

В ходе экспериментов, проведенных в рамках изобретения, оказалось, что выгодно, если в процессе совместимого переноса миксобактериальных реципиентов перед инкубацией со штаммом-донором осуществляют кратковременную термообработку. Предпочтительно, чтобы предварительная инкубация длилась от 1 до 120 мин, особенно предпочтительно от 5 до 20 мин реципиентной клетки при температуре 35-60^oC, предпочтительно при 42-55^oC и особенно предпочтительно при температуре от 48 до 52^oC.

В предпочтительной форме осуществления способа изобретения применяют донорский штамм E. coli который содержит переносные гены от плазмиды RP4, встроенные в хромосомальную ДНК. Предпочтительно в рамках изобретения донорский штамм E. coli (W3101/pME305), который содержит вспомогательную плазмиду pME305, которая обладает функцией переноса (tra) RP4.

С точки зрения техники способа особенно интересны в рамках изобретения штаммы бактерий, которые пригодны в качестве хозяина для клонирования векторов с интегрированными ДНК-последовательностями и для использования в качестве донорских клеток в рамках совместимого переноса. Особенно предпочтительны также штаммы бактерий, которые негативно устойчивы, и, таким образом, не элиминируют переносимую чужую ДНК. Обоим вышеназванным критериям идеально соответствует штамм E.coli E18767/pU78), который, однако, в другом месте назван примером для другого подходящего штамма бактерий и никоим образом не должен ограничивать объем притязаний.

Наряду с ранее описанным совместимым переносом гена от донорской клетки в миксобактериальный реципиент, само собой разумеется, могут найти применение еще другие пригодные способы переноса гена для передачи генетического материала в миксобактерии. Следовало бы назвать в первую очередь перенос гена путем электропорации, в рамках которой к клеткам миксобактерий за короткое время применяют высокой электрической силы поля (Куcпа и Кайзер (1989). Общие условия электропорации прокариотных клеток описаны в патенте США 4910140 детально.

Примеры на осуществление способа, не ограничивающие изобретения.

Общая техника рекомбинантных ДНК.

Так как многие технические приемы рекомбинантных ДНК, применяемые в рамках изобретения, являются для специалистов рутинными, ниже приводится краткое описание употребительных общих технических приемов. Все эти способы описаны Маниатисом и др. (1982), если на них не указано особо.

А. Нарезание рестрикционными эндонуклеазами.

Обычно в реакционной порции буферного раствора, рекомендованного изготовителем, содержится приблизительно 50-500 мкг/мл ДНК, в первую очередь New England Biolabs, Beverly, M. A. und Bohringer, Mannheim (ФРГ). От 2 до 5 единиц рестрикционных эндонуклеаз добавляют к каждому мкг ДНК и реакционную порцию инкубируют при указанной изготовителем температуре от 1 до 3 ч. Реакцию заканчивают через 10 мин нагревания до 65^oC или после экстракции фенолом, осуществленную в результате осаждения ДНК этанолом. Эта техника описана также на стр. 104-106 Маниатисом и др. (1982) -рекомендации.

B. Обработка ДНК-полимеразой для получения тупых концов.

50-500 мкг/мл фрагментов-ДНК добавляют в реакционную массу, которая представляет собой буфер от изготовителя, в первую очередь New England Biolabs, Beverly, M.A. Bohringer, Mannheim.

Реакционная масса содержит все четыре дезоксинуклеотид-трифосфата в концентрации 0,2 мМ. Реакцию осуществляют в течение 30 мин при 15^oC и заканчивают затем после 10-минутного нагревания до 65^oC. Для фрагментов, которые получают с помощью эндонуклеаз, которые дают 5"-выступающие концы таких, как Eco RI и BamHI, употребляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы. Для фрагментов, которые получены с помощью эндонуклеза, которые дают 3"-выступающие концы, как РstI и SacI, употребляют Т4-ДНК-полимеразу. Применение этих двух ферментов описаны на стр. 113-121 Маниатисом и др. (1982) - рекомендации.

C. Агароза-гельэлектрофорез и очистка фрагментов ДНК от геля.

Агароза-гельэлектрофорез проводят в горизонтальном аппарате, как это описано на стр. 150-163 Маниатисом и др. Используемый буфер является описанным там трис-ацетатным буфером. Фрагменты ДНК окрашивают с помощью 0,5 мг/мл бромида этидия, который существует во время электрофореза либо в гелевом или танковом буфере, либо его добавляют после электрофореза, ДНК становится видимой в результате воздействия длинноволновой области ультрафиолетового света.

Если фрагменты нужно отделить от геля, применяют агарозу, которая при низкой температуре становится гелеобразной и может быть получена от Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. После электрофореза вырезают желаемые фрагменты, добавляют в пластиковую трубочку, нагревают приблизительно 15 мин до 65^oC, трижды экстрагируют фенолом и дважды осаждают этанолом. Этот способ несколько изменен по сравнению с описанным Маниатисом и др. (1982).

В качестве альтернативы ДНК можно выделить из агарозы с помощью Geneclеan kits (Bio 101, Inc, La Jolla, CA, USA).

1. Добавление синтетических линкерфрагментов к концам ДНК.

Если хотят добавить новый сайт для эндонуклеазы к концу молекулы ДНК, молекулу сначала обрабатывают в соответствующем случае ДНК-полимеразой, чтобы получить тупые концы, как описано в вышеприведенном пункте. Приблизительно 0,1-1,0 мкг этого фрагмента добавляют приблизительно в 10 нг фосфорилированной линкер-ДНК, полученных из New England Biolabs в объеме от 20 до 30 мкл с 2 мкл Т4 ДНК-лигазы от New England Biolabs и 1 мМ АТР в буфере, рекомендованном изготовителем.

После инкубации в течение ночи при 15^oC реакцию оканчивают после 10-минутного нагревания до 65^oC. Реакционную смесь разбавляют приблизительно до 100 мкл в буфере, который является подходящим для эндонуклеазы, которая разрезает синтетическую линкерпоследовательность. Добавляют приблизительно 50-200 единиц этой эндонуклеазы. Смесь инкубируют от 2 до 6 ч при указанной температуре, затем фрагмент подвергают агароза-гельэлектрофорезу, и очищают, как описано выше. Полученный в результате фрагмент имеет теперь концы, которые были получены с помощью эндонуклеазы. Эти концы являются обычно липкими, так что полученный в результате фрагмент легко может быть соединен с другими фрагментами с такими же липкими концами.

E. Удаление 5"-терминальных фосфатов из ДНК-фрагментов.

Во время стадии клонирования обрабатывают векторную плазмиду фосфатазой (обсуждается на стр. 13 Маниатисом и др.). После разрезания ДНК эндонуклеазой добавляют единицу щелочной фосфатазы из желудка теленка, полученную от Boehringer - Mannheim ДНК инкубируют 1 ч при 37^oC и непосредственно после этого экстрагируют фенолом дважды и осаждают этанолом.

F. Соединение ДНК-фрагментов.

Если нужно соединить фрагменты с комплементарными липкими концами друг с другом, приблизительно 100 нг каждого фрагмента в реакционной смеси 20-40 л приблизительно с 0,2 единицами Т4 ДНК-лигазы N.E. Biolabs в буфере, рекомендованном изготовителем, инкубируют. Инкубацию проводят от 1 до 20 ч при 15^oC. Если ДНК-фрагменты с гладкими концами должны быть соединены, их инкубируют, как описано выше, до тех пор, пока количество Т4 ДНK-лигазы не увеличится до 2-4 единиц.

G. Трансформация ДНК в E.coli.

E. Coli для большинства экспериментов применяют в виде штаммов HB101, W3101 и E1867. ДНК вводят в E.coli способом кальцийхлорида, как описано Маниатисом (1982) на стр. 250-351.

H. Скрининг E.coli на наличие плазмид.

После трансформации полученные в результате колонии E.coli проверяют на наличие целевой плазмиды с помощью быстрого способа выделения плазмид. Два употребительных способа описаны Маниатисом на стр. 366-369.

1. Выделение плазмидой ДНК в большом количестве

Способ выделения плазмид из E.coli в большом масштабе описаны на стр. 88-94 Маниатисом.

Пример 1. Условия культивирования сорангиума.

Sorangium cellulosum вносят в жидкую среду G51b (см. главу "Среды и буферы") при температуре 30^oC. Культуры обдувают воздухом путем встряхивания со скоростью 180 об/мин. В качестве альтернативной среды можно применять также среду G52c.

Для культивирования на твердой среде можно применять описанную там же среду SoIE. Температура инкубирования в этом случае составляет также 30^oC.

Пример 2. Условия культивирования E.coli.

Клетки E. coli культивируют в среде IB (Миллер (1932)) при температуре 37^oC.

Пример 3. Получение устойчивых по отношению к стрептомицину спонтанных мутантов Sorangium cellulosum.

200 мкл культуры Sorangium cellulosum в возрасте 3 дней (штамм дикого типа Soce 26), которые вносят в жидкую среду, помещают на пластину на твердую среду (среда SoIE), которая обогащена на 300 мкг/мл стрептомицина. Время инкубации составляет 14 дней при температуре 30^oC. В случае колоний, выросших на этой среде, речь идет о спонтанных стрептомициноустойчивых мутантах, которые для дополнительного концентрирования и очистки еще раз культивируют на такой же среде (со стрептомицином).

Одну из стрептомициноустойчивых колоний выбирают и получают обозначение SI3. Проба этого мутированного штамма Sorangium cellulosum Soce 26 была заявлена 25.01.1991 при соблюдении соответствующих требований в "Немецкое собрание микроорганизмов и клеточных культур, Gмбх Браунивейг, ФРГ, под номером DSM6380.

Пример 4. Препарация всей ДНК сорангиума.

Для выделения всей ДНК культуру сорангиума, находящуюся в стационарной фазе, центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. Отделенные клетки снова суспендируют затем в STE-буфере (см. "Среды и буферы") и доводят до плотности клеток около 10⁹ клеток/мл.

Непосредственно после 450 мкл этой суспензии смешивают с 200 мкл RLM буфера (см. "Среды и буферы") и 2 мкл диэтилпирокарбоната. Для осуществления основательного и равномерного перемешивания применяют подходящие приборы, как, например, фортекс. После инкубирования в течение 30 мин при 70^oC в инкубатор добавляют 100 мкл ацетата калия (5 моль). Эту добавку инкубируют 15 минут на льду и все 5 мин основательно перемешивают (фортекс). После центрифугирования (15 мин при 10 000 об/мин) отстой непосредственно после этого смешивают для экстракции протеина с 500 мкл смеси фенол /хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1). После нового центрифугирования (15 мин при 10 000 об/мин) верхнюю фазу, которая содержит фракцию ДНК, отбирают и удаляют еще возможно содержащиеся количества фенола диэтиловым эфиром (1 мл). Непосредственно после этого осаждают ДНК добавлением 1 мл этанола. После 30-минутной инкубации при -70^oC общую смесь центрифугируют 15 мин при скоростью 10000 об/мин, осадок промывают 70%-ным этанолом и высушивают в вакууме. Под конец ДНК разбавляют в ТЕР-буфере.

Пример 5. Конъюгативный перенос pSI B55 в Sorangium cellulosum SI3.

5.1. Двухступенчатый способ.

5.1.1. Клонирование сорангиум-ДНК в плазмиду pSuP2021.

Выделенную из штамма сорангиума SI3 в хромосому разрезают ферментом PVUI. Полученные таким образом фрагменты клонируют в плазмиду p.P2021 (Симон и др. (1983)). При этом 0,2 мкг плазмидной ДНК и 1 мг хромосомальной ДНК сначала переваривают с помощью PVUI и непосредственно после этого осаждают этанолом. Осадок отделяют, высушивают и сухой осадок снова суспендируют в 14 мкл бидистиллированной воды. После этого добавляют 2,5 мкл 10-кратно концентрированного лигационного буфера (см. "Среды и буферы"), 2,5 мк/л сыворотки альбумина крупного рогатого скота (0,1%), 2,5 мкл АТР (10 ммоль), 2,5 мл DTT (0,2 моль), 8 мк/л H₂O и 1 мкл 4Т ДНК-лигазы. Всю лигационную смесь инкубируют после этого в течение ночи при температуре около 8^oC,

5 мкл этого лигирующего раствора трансформируют для клонирования рекомбинантных плазмид в штамм E.coli HB101. При этом компетентные клетки E.coli штамма HB101 получают с помощью способов, обычно применяемых для трансформации E.coli (см. "Общая техника рекомбинантных ДНК").

После трансформации и последующей инкубации в течение 24 ч на IB-агаре, обогащенном канамицином (25 мкг/мл) и хлорамфениколом (25 мкг/мл) полученные в результате колонии подвергают дифференциальному скринингу с помощью параллельного осуществления на пластинах на ампициллинсодержащей (60 мкг/мл) и свободной от ампициллина среде. Непосредственно после этого могли быть выделены те колонии, которые утеряли благодаря интеграции сорангиум ДНК-фрагментов свою устойчивостью по отношению к ампициллину. Из этих чувствительных к ампициллину колоний затем были выделены плазмиды.

Таким образом получают рекомбинантные плазмиды различной величины. После анализа выбрали три из этих плазмид для дальнейших экспериментов. Эти плазмиды с обозначением pSIB55, pSIB50 и pSIB58 содержали сорангиум-ДНК 1 кб, 3,5 кб или 4 кб.

5.1.2. Конъюгативный перенос плазмиды pSIB55 в Sorangium cellulosum.

Перенос плазмиды pSIB55 в Sorangium cellulosum осуществляют при содействии штамма E.coli W3101 (pME305) (Hoya и др.), который способен на конъюгативный информационный обмен с сорангиумом. Плазмида E.coli pME305 (Релла (1984)) служат при этом для мобилизации pSIB55.

Сначала компетентные клетки штамма E.coli W3101 (pME305) трансформируют с помощью употребительного для трансформации E.coli способа с 5 мл предварительно выделенного pSIB55 плазмид-ДНК. Трансформированные E.coli клетки, таким образом, становятся донором для плазмиды pSIB55.

Для собственно переноса смешивают 15 мл находящегося в стационарной фазе культуры Sorangium cellulosum SI3 (410⁸ клеток/мл до 1-410⁹ клеток/мл) с 10 мл поздней лог-фазы культуры E.coli донорских клеток, которые содержат различное количество клеток. Все вместе центрифугируют затем 10 мин при скорости 4000-8000 об/мин и снова суспендируют в 500 мл G51b- или G51t-среде.

Оказалось эффективным, если реципиентные клетки сорангиума перед конъюгацией с E.coli подвергнуть короткой термообработке на водяной бане. Со штаммом Sorangium cellulosum SI3 можно получить лучшие результаты переноса при 10-минутной обработке при температуре 50^oC. При этих условиях возможна частота переноса 1-510^-5, что по отношению к способу без предварительной термообработки соответствует увеличению на фактор 10.

После переноса на пластины с твердой средой SolE осуществляют двухдневную инкубацию при 30^oC. Клетки затем собирают и снова суспендируют в 1 мл G51b- или G51t-среде. 100 мкл этой бактериальной суспензии наносят на пластины на селективную SоlE-среду, которая содержит наряду с канамицином (25 мкг/л) еще флесмицин (20-35 мкг/л) и стрептомицин (300 мкг/л) в качестве селективных агентов. Контрселекцию штамма-донора E.coli W3101 (pME305) осуществляют с помощью стрептомицина.

В случае колоний, выращенных на этой селективной SoIE среде после инкубирования от 10 до 14 дней, речь идет о трансконъюгантах Soraugium cellulosum которые в результате конъюгативного переноса плазмиды pSIB55 приобрели устойчивость по отношению к флеомицину. Эти устойчивые к флеомицину колонии можно применять для дальнейших молекулярно-биологических исследований. Трансформационная частота переноса плазмиды pSIB55 в сорангиум в среднем составляет 310^-6, считая на реципиентный штамм SI3.

Плазмиды pSIB50 и pSIB58 могут быть трансформированы аналогично в сорангиум.

5.2. Одностадийный способ.

5.2.1. Клонирование сорангиум-ДНК в плазмид pSuР2021.

Клонирование сорангиум-ДНК в плазмиду pSuР2021 можно проводить как описано в примере 5.1.1.

Путем обмена применяемой в 5.1.1 вспомогательной плазмиды pME305 со плазмидой pUZ8 (Хедгес и Матвеев (1979)), которая не несет в противоположность к ранее названной плазмиде устойчивый к ампициллину ген, можно при клонировании в E.coli отказаться от промежуточного хозяина, так как теперь возможно прямое клонирование в донорский штамм E.coli ED8767, предусмотренный для конъюгативного переноса.

В случае плазмиды pUZ8 речь идет о производном широкого круга хозяев плазмиды RP4, которая описана Датта и др. (1971). Модификация по отношению к исходной плазмиде RP4 касается в основном ампициллинустойчивого гена, а также элемента прикрепления 1.21, которые оба делетированы, а также встраивания дополнительного гена, который способствует устойчивости по отношению к иону серебра (см. Яоуа и др. (1987)).

Полученную в соответствии с примером 5.1.1. лигирующую смесь можно поэтому теперь прямо трансформировать в штамм E.coli ED8767. При этом получают компетентные клетки штамма E.coli ED8767 с помощью применяемых обычно для трансформации E.coli способов (см. "Общая техника рекомбинантных ДНК").

После трансформации и последующей инкубации в течение 24 ч на LB-агаре, обогащенном тетрациклином (10 мкг/мл) и хлорамфеноколом (25 мкг/мл), полученные в результате колонии подвергают диффентильному скринингу с помощью параллельного осуществления на пластинах на ампициллинсодержащей (60 мкг/мл) и свободной от ампициллина среде. Непосредственно после этого такие колонии можно выделить, которые благодаря интеграции сорангиум ДНК-фрагментов потеряли свою устойчивость по отношению к ампициллину. Полученные таким образом культуры можно затем использовать прямо в качестве донорских клеток для конъюгативного переноса рекомбинантной плазмиды в клетки Sorangium cellulosum.

Вместо упомянутой лигирующей смеси можно клонировать, само собой разумеется, также полученные в соответствии с примером 5.1.1 рекомбинантные плазмиды pSIB50, pSIB55 или pSIB58 в штамм E.coli ED8767.

5.2.2. Конъюгативный перенос рекомбинантных плазмид в Sorangium cellulosum.

Для собственно переноса смешивают 15 мл находящейся в стационарной фазе культуры Sorangium cellulosum SI3. (1-410⁹ клеток (мл) с 10 мл поздней лог-фазы культуры E. coli ED8767 донорских клеток, которые содержат различное количество клеток. Все вместе затем центрифугируют 10 мин при скорости 4000 об/мин и снова суспендируют в 500 мкл G51c или G51-среде.

Даже в этом случае оказывается выгодным, если клетки-реципиенты сорангиума перед конъюгацией с E.coli подвергают короткое время термообработке на водяной бане. Со штаммом Sorangium cellulosum SI3 можно получить лучшие результаты переноса при 10-минутной термообработке при температуре 50^oC. При этих условиях частота переноса возможна 1-510^-5, что на порядок превышает результаты, полученные в способе без предварительной термообработки.

Дальнейшее культивирование трансформированных клеток сорангиума осуществляют по аналогии со способом, описанным в примере 2.1.2.

С помощью применения рестрикционно-негативного штамма E.coli в качестве донорских клеток, как, например, E.coli ED8767 (Муррей и др. (1977)) можно заметно увеличить частоту переноса по сравнению с ранее описанными способами (на 3 порядка).

Молекулярно-генетический анализ.

A. Доказательство интеграции плазмиды pSIB55 в хромосому Sorangium cellulosum SI3.

Общую ДНК, выделенную из трансформированных клеток сорангиума в соответствии с вышеприведенным описанием (см. пример 4), переваривают с Smal или Sall и наносят на горизонтальный трисацетат (40 ммоль трис-HCl, 20 ммоль ацетата натрия, 2 ммоль ED TAN a2 pH 7,8) гель-агарозы (0,9%). После проведения электрофореза гель сначала на 30 мин вносят в денатурированный раствор (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) и после этого в нейтрализующий раствор (1,5 M NaCl, 0,5 М трис-HCl, 1 ммоль EDTA Na₂, pH 7,2). С помощью "Southern Capillary Blottings" ДНK затем при применении 20-кратно концентрированного буфера SSC (см. "Среды и буферы") трансферируют на нейлоновую мембрану (см. "Amersham Hybond nylon membrane"; Amersham Intenational plc, Amersham place, Amersham, Englaud Hp7 9NA] и там фиксируют путем 6-минутной обработки ультрафиолетом. Остальные подробности этого способа описаны в руководстве "Membran Transfer and Detection Methods"(1985).

ДНК, которую рассматривают как пробу для гибридизации, маркируют с помощью никтранолации (Ригби и др. (1977)). При этом речь идет о 32Р-маркированном, охватывающем 3,5 кб PVUI прикреплении из плазмиды pSIB55. Собственно гибридизацию проводят при применении слегка модифицированного способа по Денхардту (Денхардт (1976)). Применяемый для прегибридизации и гибридизации буфер имеет следующий состав: 6SSC (Маниатис и др. (1982) 5 Денхардт (Маниатис и др. (1982)) + 0,5% SDS + 0,2 мг/мл денатурированный "Salmon sperm" ДНК.

Прегибридизацию проводят при 65^oC и продолжают 3 ч, в то время как собственно реакцию гибридизацию заканчивают через 20 ч. Для гибридизации добавляют 32Р-маркированного 10⁵ спм на 1 см² фильтра, денатурированного, охватывающего 3,5 Kb PVUI фрагмент-плазмида pSIB55. После гибридизации фильтр сначала промывают 215 мин в 2-кратно концентрированном SSC при температуре 65^oC, непосредственно после этого 30 мин в 2 SSC + 0,1% SDS также при 65^oC и, наконец, дополнительно еще раз в 0,5 SSC /15 минут при 65^oC).

Заключительную ауторадиографию проводят при применении рентгеновской пленки (например, FUIV Rays film).

Ауторадиограмма трансконъюгантов не показывает линий, которые получают от pSIB55 плазмидной ДНК, существующей в суперскрученном виде. Напротив, имеют положительный сигнал в хромосомальном регионе мембранного фильтра.

Плазмида pSIB55, переваренная Smal, дает 3 полосы 8,9; 6,7 и 1,6 кб. Гибридизированный образец родительского штамма SI3 после переваривания Smal также показывает три полосы, из которых одна соответствует внутреннему, охватывающему 1,5 кб фрагменту вставки сорангиума, клонированного в плазмиду pSIB55.

Гибридизированный образец ДНК, переваренный Smal, трансконъюгантов показывает 5 линий (8,9 и 6,7 кб линии плазмиды pSIB55, а также SI3 линии), включая все три общие 1,6 кб линии.

После переваривания Smal для плазмиды pSIB55 находят линию 14,1 кб (другой, охватывающий 3,1 кб Sall-фрагмент pSIB55 не гибридизируется с пробой). Гибридизированный образец переваренной Sall SI3 ДНК также показывает линию 4 кб. У трансконъюгантов исчезает 14.1 кб фрагмент плазмиды pSIB55, а также 5 кб фрагмент SI3 после переваривания Sall. Они заменены двумя новыми линиями 11,5 кб и 7,7 кб.

Smal данные показывают, что все pSIB55 фрагменты находятся без повреждений в геноме трансконъюгантов. Таким образом, исключение возможность специфически местной рекомбинации, так как в этом случае должен был бы исчезнуть один из Smal фрагментов.

Результаты Sall переваривания делают, кроме того, ясным то, что плазмида pSIB55 интегрирована в геном сорангиума, а именно в сайт, где находится область ДНК, гомологичная по отношению к pSIB55 (=3,5 кб PVUI фрагмент). Эта интеграция происходит в процессе гомологичной рекомбинации между 3,5 кб вставкой ДНК сорангиума из pSIB55 и таким же участком внутри генома сорангиума.

Среды и растворы буферов.

G51b-Среда (pH 7,4).

Глюкоза 0,2%, крахмал 0,5% (картофельный крахмал, тип норедукс, Италия), пептон (ДИФКО лаборатория, США) 0,2%, пробион S 0,1% (Хехст АГ, ФРГ, Сингл Целл протеин), CaCl₂2H₂O 0,05%, MgSO₄7H₂O 0,05%. Гепес (Флюка) 1,2%.

G51t - Среда (pH 7,4).

Глюкоза 0,2%, крахмал 0,5% (картофельный крахмал, тип норедукс, Италия), триптон (Марко, США) 0,2%, пробион S 0,1% (Сингл Целл протеин, Хехст АГ, ФРГ), CaCl₂ 2H₂O 0,05%, MgSO₄ 7H₂O 0,05%. Гепес (Флюка) 1,2%;

G52c - среда (pH 7,4).

Глюкоза 2,0 г/л, крахмал 8,0 г/л (картофельный крахмал, тип норедукс, Италия), обезжиренная соевая мука 2,0 г/л, Муцедола, Италия, дрожжевой экстракт 2,0 г/л (Фоулд, Шпрингер, Франция), CaCl₂ 2H₂O 1,0 г/л, MgSO₄ 7H₂O 1,0 г/л, Fe-ЕДТА (8 г/л раствор штамма/ 1,0 мл, Гепес (Флюка) 2,0 г/л, дистиллированная вода до 100 мл.

pH-значение перед стерилизацией (20 мин при 120^oC) устанавливают добавлением NaOH до 7,4, pH после стерилизации 7,4.

SoIE-среда (pH 7,4).

Глюкоза 0,35% (добавление осуществляют после стерилизации, pH значение устанавливают перед стерилизацией (20 минут при 120^oC, добавлением NaOH устанавливают 7,4, триптон (Марко, США) 0,05%, MgSO₄ 7H₂O 0,15%, сульфат аммония 0,05% (условия как для глюкозы), CaCl₂ 2H₂O 0,1% (условия как для глюкозы), K₂HPO₄ 0,006% (условия как для глюкозы), дитионит натрия 0,01 (условия как для глюкозы), Fe-ЕДТА 0,0008% (условия как для глюкозы), Гепес (Флюка) 1,2%, отстой стерилизованной стационарной культуры, целлюлозум 3,5% (у/у), агар 1,5%.

LB-среда.

Триптон 10,0 г/л, дрожжевой экстракт 5,0 г/л NaCl 5,0 г/л,

STE-буфер (pH 8,0).

Сахароза 25%, EITANa₂ 1 ммоль, трис-HCl 10 ммоль.

RLM-буфер (pH 7,6).

SDS 5%, EITANa₂ 125 ммоль, трис-HCl 0,5 ммоль.

Tep-буфер.

Трис-HCl (pH 8,0) 10 ммоль 1 ммоль EITANa₂ 1 ммоль RN Азе 10 мг/мл.

Лигирующий буфер.

MgCl₂, 0,1 моль, трис-HCl (pH 7,8) 0,5 моль.

Депонирование.

В рамках предложенной заявки следующие микроорганизмы или плазмиды были отданы на хранение в "Немецкое собрание микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ" в Браунивейг при выполнении соответствующих требований.

Список литературы

1. Breton A.M. et al., J. Bacteriol., 161:523-528 (1985).

2. Breton A.M. et al., J. Biotechnol., 4:303-311 (1986).

3. Breton A.M. und Guespin-Michel J.F., FEMS Microbiol Lett, 40:183-188 (1987).

4. Datta N. et al., J. Bacteriol. 108:1244-1249 (1971).

5. Denhardt D.T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 23:641-646 (1976).

6. Hedges R.W. und Matthew M., Plasmid 2:269-278 (1979).

7. Gentz R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:4926-4940 (1981).

8. Jaoua S. et al., Plasmid 18:111-119(1987).

9. Jaoua S. et al., Plasmid 23:183-193(1990).

10. Kaiser D., Genetics of Myxobacieria, in: "Myxobacteria: Development and Cell Interactions", ed E. Rosenberg, p. 163-184, Springer Verlag, Berlin/New York (1984).

11. Kuner J. M. und Kaiser D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:425-429 (1981).

12. Kuspa A. und Kaiser D., J. Bacteriol. 171:2762-2772 (1989).

13. Maniatis T. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).

14. Miller J.H., "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972).

15. Murray N.E. et al., Mol. Gen. Genet. 150:53 (1977).

16. O"Conner K.A. und Zusman D.R., J. Bacteriol., 155:317-329 (1983).

17. Rella M., Dissertation ETH Zurich, N 7601.SFITZ.

18. Reichenbach H. et al., Trends in Biotechnology, 6:115-121 (1988).

19. Rigby D.W.J. et al., J. Mol. Biol.,113:237-251 (1977).

20. Rosenberg M. und Court D., Ann. Rev. Genetics 13:319-353 (1979).

21. Shimkets L. J. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:1406-1410 (1983).

22. Simon R. et al., Bio/Technol., November 1983:784-791 (1983).