способ детектирования и/или количественного анализа с использованием планарной хроматографии и устройство для его реализации

Формула изобретения

1. Способ детектирования и/иди количественного анализа с использованием планарной хроматографии, включающий хроматографическое разделение в камере, содержащей хроматографическую пластину с нанесенным слоем сорбента, и миграцию через него подвижной фазы, отличающийся тем, что прилагают к разделительной камере пониженное давление и создают ступенчатое понижение давления до 1 или 5 мм рт.ст.

2. Устройство для детектирования и/или количественного анализа с использованием планарной хроматографии, включающее камеру разделения, содержащую хроматографическую пластину с нанесенным слоем сорбента, средства для герметичного закрывания названной пластины и средство для снижения давления в камере разделения, отличающееся тем, что средство для снижения давления соединено со средством регулирования градиента пониженного давления, выполненного с возможностью конечного понижения давления до 1 или 5 мм рт.ст., при этом средство для герметичного закрывания пластины представляют собой гидрофобную мембрану, не проницаемую для используемых растворителей.

3. Устройство по п. 2, отличающееся тем, что средством для снижения давления является вакуумный насос.

4. Устройство по п.2 или 3, отличающееся тем, что мембрана изготовлена из пенополиэтилена с закрытыми ячейками.

5. Устройство по любому из пп.2 - 4, отличающееся тем, что включает несколько хроматографических пластинок, разделенных соответственно подходящей мембраной.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение касается устройства для осуществления плоскостной или планарной хроматографии, использующего пониженное давление в качестве принципа форсирования потока.

Тонкослойная хроматография (ССМ), называемая также плоскостной или планарной хроматографией, представляет собой метод разделения смесей, основанный на дифференциальной миграции или распределении компонентов этих смесей между двумя фазами - подвижной и неподвижной.

Первые опыты тонкослойной хроматографии были практически реализованы на кремниевых пластинках с размером зерна порядка 15 мкм и толщиной порядка 1 мм.

Качество разделения компонентов хроматографируемых смесей может быть улучшено при уменьшении размеров частиц и/или толщины пластины сорбента. При этом получают пластины с улучшенными характеристиками разделения, называемые HPLC (High Performance Thin Layer Chromatography). Такое усовершенствование влечет за собой и появление весьма существенного недостатка, который заключается в увеличении времени, необходимого для установления уровня концентрации, эквивалентного заданной теоретической величине. Это происходит из-за уменьшения диаметра частиц сорбента.

Для устранения этого недостатка предложено несколько способов, один из которых состоит в том, чтобы форсировать поток элюента путем использования насосов и увеличить, таким образом, скорость его прохождения через пластину сорбента.

Такое техническое решение в свою очередь обладает следующими недостатками:

- адсорбент на пластине хроматографирования не накрыт герметичным образом специальной мембраной, что влечет за собой ограничение в миграции растворителя;

- растворитель имеет возможность двигаться над адсорбционным слоем, то есть в пространстве между упомянутой выше мембраной и слоем адсорбента, а не в этом слое адсорбента.

Для сглаживания проявлений недостатков этого метода и, в частности, ограниченных дистанций миграции элюента, группа венгерских специалистов разработала новый метод жидкостной планарной или плоскостной хроматографии, названный OPTLC (Overpressured Thin Layer Chromatography). Этот метод описан в частности в следующих статьях: Е. Тигак и др. ("Журнал Хроматографии", 1979 г. , N 174, стр. 75-81; "Журнал Хроматографии", 1981 г., N 211, стр. 45-51; "Журнал Хроматографии", 1989 г. N 471, стр. 375-387); Г.Ф. Гаук и др. ("Журнал Хроматографии", 1983 г. N 262, стр. 113-120); З. Виткевич и др. ("Журнал Хроматографии", 1986 г. N 373, стр. 111-140). Описание метода приводится также в заявках на французские патенты N 2483248, N 2495779, N 2575810 и N 2580406. Основная характеристика этого метода заключается в том, что слой адсорбента на хроматографической пластине полностью закрыт гибкой мембраной, которая герметизирована, и подвижная фаза или элюент вводится в тонкий слой неподвижной фазы под давлением с помощью насоса.

Устройство для практической реализации этого метода описано, в частности, в заявке на патент N 2483248 или в заявке на патент N 2580406. В этом устройстве тонкослойная хроматографическая пластина, помещенная на подставку из стекла или пластмассы, имеющую нижнюю часть и верхнюю часть, полностью покрыта в своей верхней части пластиковой мембраной (мембраной давления), специально приспособленной для надежного контактирования с поверхностью упомянутой выше хроматографической пластины из соображений создания давления газа, не мешающего нормальному прохождению процесса хроматографии, в пространстве между упомянутой выше мембраной и верхней частью блока подставки описываемого здесь устройства.

Устройство подвода газа для создания давления над мембраной и датчик этого давления (например, манометр) в комбинации со специальным шприцем для введения в хроматографическое устройство растворителя и выходным устройством для введения исследуемого образца подлежащей разделению смеси под давлением располагаются в верхней части упомянутой выше блок-подставки данного устройства хроматографии. В этом устройстве внешнее давление на мембрану во всех случаях должно превышать давление, под которым на неподвижную фазу подается элюент (растворитель). Таким образом, создается своего рода избыточное давление. Верхняя и нижняя часть упомянутой выше блок-подставки скрепляются друг с другом при помощи специальных зажимов.

Хроматографическое устройство подобного рода и способ, практическую реализацию которого это устройство обеспечивает, представляют целый ряд преимуществ и, в частности, позволяет оптимизировать некоторым образом условия разделения компонентов смеси, регулируя соответствующим образом расход элюента. В то же время процесс хроматографирования с использованием тонкослойной хроматографической пластины типа OPTLC обладает и некоторыми недостатками, среди которых можно отметить:

- необходимость специальной подготовки хроматографических пластин перед их использованием для создания четырех надежно герметичных соединений или стыков;

- наличие парообразной фазы на уровне расположения слоя адсорбента в процессе движения элюента. Действительно, в присутствии такой парообразной фазы может иметь место нежелательная модификация селективности (то есть способности к разделению) подвижной фазы или элюента, особенно в случае использования смеси различных растворителей для образования этой подвижной фазы. При этом также происходит уменьшение длины траектории или пробега растворенных веществ (R_f) на величину от 20 до 40% и уменьшение максимального значения этого параметра R_f, за пределами которого никакое разделение компонентов смеси невозможно, до величины, заключенной в диапазоне от 0,6 до 0,8 (образование виртуального фронта). Следствием наличия парообразной фазы на уровне расположения адсорбционного слоя оказывается и расслоение или нарушение равновесия смеси подвижной фазы, а также возможныe и нежелательные модификации ее состава.

Наиболее близким к предложенному изобретению является патент US 4469601, B 01 Q 15/08, 1984 г., в котором описано устройство, содержащее камеру, хроматографическую пластину, покрытую слоем сорбента, средства для снижения давления и средство для герметичного закрытия хроматографической пластины.

Итак, предлагаемое изобретение имеет целью создание устройства планерной хроматографии в форсированном потоке, которое наилучшим образом отвечает потребностям практики и превосходит по своим характеристикам используемые в настоящее время подобные хроматографические устройства с применением избыточного давления, в частности, в том, что оно не требует никакой предварительной подготовки хроматографической пластины (неважно - жесткой или гибкой) и исключает распространением упомянутой выше парообразной фазы. Предлагаемое хроматографическое устройство также выгодно отличается от существующих на сегодняшний день аналогичных устройств особенной простотой использования.

Объектом предлагаемого изобретения является устройство планерной хроматографии с распространением подвижной фазы в форсированном потоке, отличающееся тем, что оно содержит камеру распространения, связанную со средствами создания пониженного давления в упомянутой выше камере, причем эта камера содержит по меньшей мере одну хроматографическую пластину, покрытую соответствующим слоем адсорбента, и средства для герметического укрытия упомянутой выше хроматографической пластины или пластин.

В соответствии с предпочтительным способом практической реализации предлагаемого изобретения упомянутые выше средства создания пониженного давления соединены со средствами регулирования градиента понижения давления.

В соответствии с предпочтительным вариантом упомянутого выше способа практической реализации предлагаемого изобретения упомянутые выше средства создания пониженного давления представляют собой вакуумный насос.

Средства регулирования градиента уменьшения давления могут быть представлены, например, золотником или клапаном с соответствующими характеристиками. В качестве такого средства может быть использован также клапан с микрометрическим винтом, соединенным с шаговым двигателем. Отметим, что такой способ практической реализации средств регулирования градиента уменьшения давления не является ограничительным.

В соответствии с другим, выгодным в некоторых отношениях способом практической реализации упомянутого выше хроматографического устройства средства для герметического перекрытия хроматографической пластины образованы гидрофобной или водоотталкивающей мембраной, не проницаемой для растворителей, используемых в составе подвижной фазы.

В соответствии с предпочтительным техническим решением этого способа практической реализации упомянутого выше хроматографического устройства упомянутая выше мембрана выполнена из полиэтиленового пенопласта с закрытыми ячейками.

Упомянутая выше мембрана из полимерного материала имеет размеры, либо одинаковые с размерами накрываемой ею хроматографической пластины, либо немного меньше, чем размеры этой пластины.

Это хроматографическое устройство в соответствии с предлагаемым изобретением совершенно неожиданным образом создает гомогенное или однородное разрежение или понижение давления на уровне камеры распространения и, следовательно, на уровне адсорбционного слоя. Это обстоятельство приводит к тому, что упомянутая выше мембрана из полимерного материала достаточно плотно и равномерно прижимается к хроматографической пластине.

Устройство планарной хроматографии в соответствии с предлагаемым изобретением представляет целый ряд преимуществ по сравнению с методом, упомянутым выше, и независимым OPTLC. Кроме простоты использования устройство в соответствии с предлагаемым изобретением обеспечивает следующие преимущества:

- вакуум или разрежение, создаваемое в камере распространения с помощью, как уже было сказано, всего лишь одного вакуумного насоса позволяет одновременно:

- достаточно однородным или гомогенным образом прижать мембрану из полимерного материала к хроматографической пластине;

- обеспечить миграцию или движение подвижной базы в результате "вытягивания" с постоянной скоростью, а не в результате "проталкивания", как это имеет место в хроматографических системах с избыточным давлением. Упомянутое выше обстоятельство обеспечивает преимущество, заключающееся в возрастании чувствительности хроматографического устройства и в сокращении времени миграции подвижной фазы (получение конечных результатов хроматографического исследования через существенно более короткое время, чем в случае использования известных в настоящее время аналогичных хроматографических устройств);

- обеспечить практическое использование любых имеющихся в наличии хроматографических пластин.

Совокупность характеристик, присущая хроматографическому устройству в соответствии с предлагаемым изобретением, позволяет, кроме того:

- исключить распространение на уровне хроматографической пластины упомянутой выше парообразной фазы;

- обеспечить дегазацию хроматографической пластины.

Такое устройство, исключая распространение упомянутой выше парообразной фазы, позволяет обеспечить распространение подвижной фазы в соответствии с линейным законом и предлагает существенноe улучшение характеристики разделения компонентов смеси, как показывает применение формулы Z = kt, где параметр Z представляет собой дистанцию миграции или распространения, k - некоторый постоянный коэффициент и t - время миграции или распространения.

При этом обеспечиваются следующие преимущества хроматографического устройства в соответствии с прилагаемым изобретением:

- существенное удлинение дистанции, на которой происходит разделение компонентов исследуемой смеси;

- обеспечение возможности оптимизации упомянутого выше вытягивания подвижной фазы путем регулирования градиента уменьшения давления или регулирования градиента разрежения при постоянной температуре, но при соблюдении гомогенности на уровне адсорбционного слоя хроматографической пластины, при выполнении соотношения типа P = f(t).

Линейный способ изменения давления в соответствии с соотношением вида P = a(t) + b характеризуется наилучшим распространением подвижной фазы в адсорбционном слое и, следовательно, наилучшим разделением компонентов исследуемой смеси. Скорость миграции элюента или подвижной фазы оказывается зависимой от изменения приложенного давления (градиента изменения этого давления), и в этом случае на упомянутую выше скорость миграции оказывают влияние только удельная плотность и вязкость подвижной фазы, а также температура в камере распространения.

В соответствии с другим в определенных отношениях выгодным способом практической реализации упомянутого выше хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением это устройство может иметь в своем составе несколько хроматографических пластин, отделенных друг от друга соответствующими мембранами, что позволяет обеспечить в одном устройстве одновременный анализ нескольких параметров одной и той же смеси и/или разделение большoго количества растворенных веществ подвижной фазы в одном и том же ее распространении в данном хроматографическом устройстве упомянутого выше типа.

Объектом предлагаемого изобретения является также способ детектирования планaрной хроматографии в камере хроматографического распространения, содержащей соответствующую хроматографическую пластину, покрытую подходящим для данного конкретного случая исследования слоем адсорбента.

Этот способ отличается тем, что миграция или распространение подвижной фазы через неподвижную или стационарную фазу хроматографического устройства осуществляется с помощью вытягивания путем приложения к упомянутой выше камере распространения гомогенного пониженного давления или разрежения на уровне упомянутого выше слоя адсорбционного материала.

В соответствии с предпочтительным вариантом практического применения упомянутого выше способа упомянутое выше разрежение или пониженное давление практически реализуется в форме поддержания определенного градиента давления.

Помимо уже перечисленных выше особенностей предлагаемое изобретение содержит и другие характерные признаки, которые можно будет легко уяснить из приведенного ниже описания одного из способов практической реализации предлагаемого изобретения.

Предлагаемое изобретение поясняется более подробно при помощи приведенного ниже дополнительного описания, которое опирается на примеры практической реализации способа плоскостной хроматографии в соответствии с предлагаемым изобретением и на подробное описание устройства в соответствии с предлагаемым изобретением, использующее ссылки на приведенные в приложении чертежи, среди которых:

на фиг. 1 - общий вид предпочтительного способа практической реализации предлагаемого изобретения, плоскостного хроматографического устройства;

на фиг. 2 - поперечный разрез устройства, представленного на фиг. 1;

на фиг. 3 - вид, иллюстрирующий способ функционирования хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением;

на фиг. 4 - кривая, показывающая характер зависимости дистанции, проходимый растворителем подвижной фазы, от давления;

на фиг. 5 - схема хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением, иллюстрирующая один из возможных способов его функционирования и содержащая средства регулирования градиента уменьшения давления или разрежения.

Само собой разумеется, что приведенные в приложении чертежи и соответствующие им части приведенного ниже описания предлагаемого изобретения даны здесь исключительно в качестве иллюстративного примера практической реализации объекта данного изобретения и ни в коем случае не являются ограничительными.

Прежде всего в приведенном ниже описании будет даваться ссылка на фиг. с 1 по 4, которые иллюстрируют один из возможных, но не единственный способ практической реализации хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением.

На фиг. 1 представлен общий вид предпочтительного способа практической реализации хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением, содержащего камеру хроматографического распространения 10, ограниченную в представленном здесь варианте практической реализации стенками 11 и 12. Нижняя стенка камеры (стенка 12) предпочтительно связана со скобой 13, которая позволяет получить камеру распространения различных размеров в зависимости от конкретной потребности. Упомянутая выше камера распространения 10 связана со средствами обеспечения необходимого разрежения в ней. Эти средства не представлены на фиг. 1, но присоединяются к этой камере распространения при помощи отверстия 14.

В представленном на фиг. 1 варианте практической реализации устройства в соответствии с предлагаемым изобретением камера распространения 10 содержит хроматографическую пластину 20, покрытую слоем соответствующего адсорбента для осуществления процесса хроматографии в созданном таким образом тонком слое, и мембрану 30 из полимерного материала, которая герметичным образом и равномерно прижимается к упомянутому выше слою адсорбента при создании в камере распространения пониженного давления.

Стенки 11 и 12 скреплены между собой при помощи любых подходящих для этого средств.

Хроматографические пластины 20 в предпочтительном варианте практической реализации устройства в соответствии с предлагаемым изобретением представляют собой, но не ограничительным образом стеклянные пластины, предварительно обмазанные силикагелем (MERCK, "KIESELGEL" G 60 F 254).

Полимерная мембрана 30 в предпочтительном варианте практической реализации устройства в соответствии с предлагаемым изобретением представляет собой, но не ограничительным образом, мембрану из гидрофобного или водоотталкивающего полиэтилена с закрытыми ячейками ("RECTIGEL" Франция, размером 180х120х3 мм), которая оказывает легкое давление на поверхность упомянутой выше хроматографической пластины 20. Таким образом, при осуществлении процесса хроматографии единственным путем продвижения для растворителя подвижной фазы является внутренность упомянутого выше адсорбционного слоя.

Эта полиэтиленовая мембрана имеет следующие физико-химические характеристики:

Способность к поглощению воды, % - 0

Огнеопасность - Не воспламеняется

Объемная масса, кг/м³ - 30

Коэффициент усушки, % - 1

Стабильность (в течение 72 ч):

При высокой температуре (110^oC) - Без изменений

При пониженной температуре (-18^oC) - Без изменений

При воздействии ультрафиолетового излучения (350 нм, 32^oC) - Без изменений

В таблице приводятся характеристики поведения этой полиэтиленовой мембраны при воздействии различных растворителей, вообще используемых в процессах аналитической токослойной хроматографии (ССМ).

На фиг. 2 представлен поперечный разрез хроматографического устройства в соотношении со способом практической реализации, показанным на фиг. 1, в закрытом положении.

На фиг. 3 представлен перспективный вид хроматографического устройства в соответствии со способом практической реализации, показанным на фиг. 1.

Функционирование хроматографического устройства, показанного на фиг. 3, осуществляется следующим образом.

После осаждения анализируемого образца смеси на адсорбционный слой хроматографической пластины 20 эта пластина вводится в камеру распространения 10 таким образом, чтобы та ее часть, которая содержит осажденный анализируемый образец, находилась со стороны (сторонa A хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением), противоположнoй отверстию 14 (сторона B хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением). Затем сторону A хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением, герметично закрытую при помощи средств закрытия 15, погружают в резервуар 50, содержащий подвижную фазу 51 (соответствующий растворитель). После этого камеру распространения данного хроматографического устройства подключают к вакуумному насосу посредством отверстия 14.

При такой схеме построения это хроматографическое устройство позволяет создать равномерно или гомогенно распределенное пониженное давление в упомянутой выше камере распространения, а точнее, на уровне адсорбционного слоя хроматографической пластины. Это дает возможность практически осуществить тонкослойную хроматографию при пониженном давлении или разрежении, называемую еще вакуумной плоскостной хроматографией (английская аббревиатура VPC), или просто вакуумной хроматографией (французская аббревиатура CSV).

На фиг. 5 представлен еще один возможный способ практической реализации хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением. Устройство, показанное на фиг. 5, содержит средства регулирования градиента понижения давления. Это устройство также содержит камеру распространения 10, такую же, как описанная выше с использованием камеры (фиг. 3), и показанную на фиг. 5 в профиль. Эта камера распространения в представленном на фиг. 5 варианте практической реализации хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением связана со средствами понижения давления через отверстие 14. Эти упомянутые выше средства понижения давления содержат источник вакуума, представленный вакуумным насосом 42. Упомянутый вакуумный насос соединен с камерой распространения 10 посредством трубопровода 44. Упомянутый выше источник вакуума соединен также со средствами регулирования градиента понижения давления, представленного в данном варианте практической реализации микрометрическим винтом 40, связанным с шаговым двигателем 41, который позволяет осуществить регулирование степени закрытия проходного сечения воздухозаборника 43, размещенного в упомянутом выше трубопроводе 44.

Шаговый двигатель 41 в предпочтительном варианте практической реализации хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением является программируемым как на уровне скорости закрытия вакуумного контура (трубопровод 44 и воздухозаборник 43), так и на уровне режима выбора изменения скорости этого закрытия (по линейному закону или по экспоненциальному закону, например, в зависимости от практических потребностей).

Пример 1. Влияние пониженного давления на осуществление процесса хроматографии.

Дистанции, проходимые растворителем (метанолом в данном случае), измерены в различные моменты миграции этого растворителя (Z) и представлены на фиг. 4 в функции времени. Кривая, помеченная знаками (соответствует разрежению 5 мм рт.ст.), содержит две части: переходный период создания давления в 5 мм рт. ст. протяженностью 3 мин, а затем поддержание этого давления на постоянном уровне в 5 мм рт.ст. путем остановки градиента изменения этого давления. Можно констатировать, что линейный градиент понижения давления соответствует линейному изменению дистанции, проходимой растворителем в функции времени. При последующем постоянном давлении проходимая растворителем дистанция изменяется неконтролируемым образом.

Аналогичные констанции могут быть также сделаны относительно кривой, помеченный знаком (разрежение 1 мм рт.ст.). По этой кривой можно видеть, что скорость миграции подвижной фазы в камере распространения при пониженном давлении представляет собой функцию давления (P) и что соотношение между этими параметрами выражается нелинейным законом. Только прогрессивное уменьшение давления P позволяет получать линейное соотношение, если P = f(t). Таким образом, устройство для регулирования градиентов уменьшения давления позволяет получить прогрессивное изменение этого давления P в процессе хроматографического анализа и обеспечить линейность соотношения Z = kt.

Пример 2. Количественный анализ или дозирование пирувата натрия с помощью хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением.

Пять отложений по 5 мл раствора пирувата натрия с концентрацией 1 г/л наносятся на кремниевую хроматографическую пластину без флюоресценции (Merck, Darmstadt, RFA) размером 200х200 мм.

Хроматографическая пластина помещается затем в хроматографическое устройство в соответствии с предлагаемым изобретением так, как уже было описано выше.

Подвижная фаза процесса хроматографии в данном случае состоит из следующих компонентов:

Изопропанол - 70

Деминерализованная вода - 35

Миграция или распространение подвижной фазы осуществляется под небольшим разрежением, соответствующим конечному результату на 1 мм рт.ст., получаемому с градиентом изменения давления на 1 мм рт.ст. за 30 мин.

Проявление осуществляется при помощи способа, описанного в заявке на европейский патент N 909107753.4, путем отвода под давлением в присутствии раствора бромкрезолового пурпурного красителя следующего состава:

Бромкрезоловый пурпурный, мг - 40

Этанол 50%, мл - 100

Концентрированный раствор едкого натра - pH 10

Параллельно осуществляется миграция на пластине тонкослойной хроматографии в тех же эксплуатационных условиях.

В обоих случаях проявляется зона расслоения смеси, но существенно меньшая по ширине в том случае, когда хроматография осуществляется с помощью хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением. Кроме того, пятна или следы пирувата натрия располагаются над зоной расслоения смеси для обычной тонкослойной хроматографии в отличие от хроматографии, осуществляемой с использованием хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением.

Величина параметра упомянутых выше пятен или следов составляет 0,85 в обоих случаях.

Пример 3. Параметр - скорость миграции.

Осуществляется количественный анализ или дозирование пирувата при помощи хроматографического устройства в соответствии с предлагаемым изобретением (см. пример 2). Продолжительность миграции составляет 30 мин (1 мин).

Для процесса хроматографии, осуществляемого в тех же самых эксплуатационных условиях, но с использованием обычного устройства тонкослойной хроматографии продолжительность миграции подвижной фазы составляет 50 мин (2 мин).

Итак, как следует из всего вышеизложенного, предлагаемое изобретение не ограничивается теми способами практической реализации и теми вариантами его применения, которые только что были описаны в разъяснительном плане. Напротив того, предлагаемое изобретение охватывает все возможные варианты практической реализации и применения, не выходящие однако за рамки его характеристик, которые могут быть придуманы специалистом.