ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, способ их получения

Классы МПК:C07H21/04 с дезоксирибозилом в качестве сахаридного радикала
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Шабарова Зоя Алексеевна,
Кузнецова Светлана Александровна,
Волков Евгений Михайлович,
Каневский Игорь Эрнестович
Приоритеты:
подача заявки:
1992-07-10
публикация патента:

Изобретение относится к биоорганической химии. Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота общей формулы I и II, где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов, R", R", R"" -остатки нуклеиновой кислоты, n = 3-12, могут использоваться для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии. Соединения формулы I и II получают выдержкой эквимолекулярной смеси нуклеиновой кислоты и активного олигонуклеотидного зонда в водном буферном растворе в условиях устойчивости комплементарного комплекса при рН 6,0-9,0. Использование в качестве активных олигонуклеотидных зондов олигодезоксирибонуклеотидов (III-V) позволяет исключить дополнительную стадию введения реакционноспособной группы и повысить селективность образования комплексов I и II. 3 c. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6

Формула изобретения

1. Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота общей формулы

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;

R", R"" - остатки нуклеиновой кислоты;

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

n = 3 - 12.

2. Ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота общей формулы

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;

R", R"", R""" - остатки нуклеиновой кислоты;

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

n = 3 - 12.

3. Способ получения ковалентно-связанных комплексов общих формул I и II, отличающийся тем, что эквимолярную смесь нуклеиновой кислоты и активного олигонуклеотидного зонда общих формул III, IV и V

RO - X - Y (III)

Y - X - OR (IV)

Y - X - OPO - X - Y - (V)

где R, X имеют вышеуказанные значения, а

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

выдерживают в водном буферном растворе, содержащем ионы двухвалентного металла, при рН 6,0 - 9,0 и температуре 0 - 10oC с последующим выделением целевых продуктов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к получению ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, содержащих ковалентную связь в определенном месте нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты (НК), общей формулы:

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где

R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов

R", R"", R""" - остатки нуклеиновой кислоты;

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

которые могут использоваться в качестве новых аналогов субстратов для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии; в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот; а также в других различных молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.

Аналогами сходной структуры являются ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая кислота типа (III):

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где

R - остаток олигодезоксирибонуклеотида;

R", R"" - остатки нуклеиновой кислоты;

B - остатки гетероциклических оснований G, C, A.

Указанные соединения (III) образуются при взаимодействии алкилирующих производных олигонуклеотидов (IV) с комплементарными участками НК по следующей схеме [I]:

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

Недостатком ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК типа (III) является то, что при образовании этих соединений происходит алкилирование гетероциклических оснований, входящих в состав НК, что приводит к повышению лабильности N-гликозидных связей. В результате этого процесса возможно выщепление алкилированных гетероциклических оснований из полинуклеотидной цепи с последующим ее разрушением [2], что ограничивает сферу применения указанных соединений.

Для получения соединений типа (III) проводят реакцию между НК и комплементарным ее участку алкилирующим производным олигонуклеотида в 10 мМ трис HCl (pH 7,6), содержащем 0,1 М NaCl и 1 мМ EDTA, при 10 - 25oC в течение 0,5 - 3 суток. Выходы целевого продукта достигают 70 - 90%. При этом алкилированию подвергаются остатки гетероциклических оснований, отстоящих на 1 - 3 нуклеотида от конца комплементарного дуплекса.

Недостатком описанного способа получения является то, что используемые в реакции алкилирующие производные олигонуклеотидов (IV) обладают высокой реакционной способностью, приводящей к снижению ее селективности [3]. Кроме того, алкилированию подвергаются как остатки гуанина, так и остатки цитидина и аденина полинуклеотидной цепи, что приводит к образованию смеси продуктов ковалентного присоединения алкилирующих производных олигонуклеотидов к НК [4] . Это может затруднять интерпретацию результатов, полученных при использовании такого рода соединений для решения различных молекулярно-биологических задач. Еще одним недостатком является то, что синтез алкилирующих производных олигонуклеотидов представляет собой достаточно трудоемкий многостадийный процесс, требующий использования дорогостоящих и труднодоступных реагентов [5].

Задача изобретения - получение ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК общей формулы

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где

R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов

R", R"", R""" - остатки нуклеиновой кислоты;

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

отличающихся от аналога (III) легкостью получения, более высокой селективностью образования ковалентной связи и возможностью ее избирательного расщепления с образованием исходных соединений, что делает эти соединения более доступными и удобными для практического использования и расширяет сферу их применения, и разработка способа их получения.

Поставленная задача достигается тем, что эквимолярную смесь нуклеиновой кислоты и активного олигонуклеотидного зонда выдерживают в водном буферном растворе в условиях устойчивости комплементарного комплекса при pH 6,0 - 9,0 с последующим выделением образующихся продуктов. Вместо алкилирующих производных олигонуклеотидов используются специально сконструированные олигонуклеотидные зонды, несущие активированную фосфатную группу, связанную с 3"-, 5"- или одновременно с 3", 5"-концами олигонуклеотида через гибкое спейсерное звено (V - VII).

RO-X-Y (V)

Y-X-OR (VI)

Y-X-ORO-X-Y- (VII)

где

R и X те же, что и для соединений (I) и (II)

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

Соединения (V - VII) получают в процессе автоматического синтеза олигонуклеотидов на полимере, содержащем ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522-этилсульфоновые группы, путем постадийных конденсаций стандартных мономерных компонентов амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов, используя наряду с ними диметокситритильные производные O-ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей и 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы, причем эти производные добавляют либо (и) вначале постадийной конденсации, либо (и) в конце ее, а в качестве активирующих зонд соединений используют 1-этил-3(3"-диметиламинопропил)карбодиимид или N-оксибензотриазол.

В отличие от аналога (III), образование ковалентной связи происходит селективно при взаимодействии активированной фосфатной группы зонда с пространственно сближенной межнуклеотидной фосфатной группой НК в месте, непосредственно примыкающем к двуспиральному участку олигонуклеотидный зонд - НК, а введение в качестве ковалентной связи замещенной пирофосфатной дает возможность направленного контролируемого расщепления указанных комплексов по этой связи с образованием исходных соединений и тем самым использовать предлагаемые соединения для зондирования активных центров ферментов нуклеинового обмена и их аффинной модификации.

Соединения (I) и (II) получаются при взаимодействии активированной концевой фосфатной группы олигонуклеотидных зондов с пространственно сближенной межнуклеотидной фосфатной группой комплементарного участка НК по схеме:

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

или

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где

R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;

R", R"", R""" -остатки нуклеиновой кислоты;

X - спейсерная группы;

Y - активирующая фосфат группа.

Реакция протекает при выдерживании смеси НК и комплементарного ее участку активного олигонуклеотидного зонда, растворенных в эквимолярных соотношениях в водных буферных растворах при pH 6,0 - 9,0. При этом образуется замещенная пирофосфатная межнуклеотидная связь. Выход целевого продукта достигает 75%.

Отличие предлагаемого способа получения ковалентно-связанных комплексов (I) и (II) от способа получения аналога (III) состоит в использовании более простых по конструкции и способу получения компонентов реакции - активных олигонуклеотидных зондов, а также тем, что данную реакцию проводят в более широком интервале pH (6,0 - 9,0).

Использование этих зондов позволяет получать ковалентно-связанные комплексы с новым типом ковалентной связи. При этом исключается дополнительная стадия введения реакционноспособной группы, представляющей собой аналог азотистого иприта, который является достаточно дорогостоящим и труднодоступным препаратом. Это делает предлагаемые ковалентно-связанные комплексы более доступными и расширяет сферу их применения. Особенность конструкции олигонуклеотидных зондов дает возможность получать ковалентно-связанные комплексы с двумя ковалентными связями - одновременно по 3"- и 5"-концам олигонуклеотидных зондов и повысить селективность их образования, что также расширяет сферу применения этих соединений. Образование замещенной пирофосфатной связи в процессе получения ковалентно-связанных комплексов дает возможность их контролируемого избирательного расщепления под действием нуклеофильных агентов, в том числе и нуклеофильных групп ряда аминокислот, входящих в активные центры белков нуклеинового обмена, и тем самым открывает перспективы аффинной модификации и более детального изучения последних.

Предлагаемый способ получения ковалентно-связанных комплексов позволяет существенно расширить интервал значений pH, в котором возможно протекание данной реакции, вплоть до 9,0. Важно отметить, использование таких значений pH невозможно для аналога, поскольку в этом случае наблюдается гидролиз гликозидной связи с последующим разрушением углеводофосфатного остова нуклеиновых кислот [2].

Совокупность указанных отличительных признаков позволяет упростить процесс, сократить длительность приготовления ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК, снизить их стоимость за счет использования недорогостоящих компонентов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Синтез

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

0,04 о.е. смеси эквимолярных количеств олигонуклеотидного зонда (X) (см. таблицу) и гептадекануклеотида

d(GTAAAACGACGGCCAGT) (IX)

(суммарная нуклеотидная концентрация 10-3 М) обрабатывали 0,2 М раствором КДИ в морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем ионы двухвалентного металла, при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции осуществляли методом гель-электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей, образующихся при получении ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК приведена на фиг. 1. Выделение продуктов реакции из реакционной смеси проводили элюцией с ПААГ. Выход целевого продукта составил 75% (см. таблицу).

Образование ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотидных зондов (XI - XV) с гептадекануклеотидом (IX) под действием КДИ проводили аналогично. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 1. Выходы целевых продуктов приведены в таблице. Снижение температуры до 0oC не оказало существенного влияния на выходы образующихся продуктов.

Пример 2

0,1 о. е. олигонуклеотидного зонда (X) растворяли в 10 мкл 50% водного раствора диметилформамида (ДМФА). К раствору добавляли 2 М раствор N-оксибензотриазола в 50% ДМФА и 7 мг КДИ. Реакцию проводили в течение 2,5 ч при 8oC. Синтезированный с количественным выходом N-оксибензотриазоловый эфир выделяли высаживанием 2% раствором перхлората лития в ацетоне и затем к нему добавляли эквимольное количество гептадекануклеотида (IX), растворенного в N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N"-2-этаносульфонатном буфере (pH 8,75), содержащем ионы двухвалентного металла. Смесь инкубировали при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции и выделение продуктов осуществляли как в примере 1. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей, образующихся при получении ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК приведена на фиг. 2. Выход целевого продукта составил 50% (см. таблицу).

Образование ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотидных зондов (XI - XV) с гептадекануклеотидом (IX) методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводилось аналогично. Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 2. Выходы целевых продуктов приведены в таблице.

Пример 3

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

Синтез соединения (XVII) под действием КДИ и методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводили как описано в примерах 1 и 2 соответственно, используя в реакциях олигонуклеотидный зонд (XIII) (см. таблицу) и комплементарный ему 20-звенный олигонуклеотид d(ATGCGTTGTTCCATACAACC) (XVIII). Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 3. Выход целевого продукта достигал 40%.

Пример 4

Синтез

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

где X= ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

Синтез соединения (XIX) под действием КДИ и методом N-оксибензотриазоловых эфиров проводили как описано в примерах 1 и 2 соответственно, используя в реакциях олигонуклеотидный зонд (XV) (см. таблицу) и гептадекануклеотид (IX). Радиоавтограмма гель-электрофореза реакционных смесей приведена на фиг. 2. Выход целевого продукта достигал 65%.

В таблице приведены выходы продуктов реакций образования ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК, полученных при взаимодействии олигонуклеотидных зондов (X - XVI) с комплементарными участками НК.

Испытания ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК

Проведенные исследования по изучению гидролитической устойчивости и свойств синтезированных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК показали, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах (pH 6,0 - 8,5, 20oC), не содержащих сильных нуклеофилов, по крайней мере в течение 48 часов, а при -20oC могут храниться в течение нескольких месяцев. В то же время в присутствии таких нуклеофилов, как первичные, вторичные и третичные амины происходит расщепление замещенной пирофосфатной связи с образованием исходных соединений по схеме:

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

При обработке этих соединений 15% водным раствором уксусной кислоты или 0,1 н водным раствором NaOH также наблюдается образование исходных соединений.

Свойства полученных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК иллюстрируются следующими примерами.

Пример 5

0,01 о. е. соединения (VIII) обрабатывали 15% водным раствором CH3COOH при 50oC в речение 2 ч. На фиг. 4. приведен радиоавтограф гель-электрофореза продуктов этой реакции. Гидролиз изучаемого соединения проходил на 10%.

Пример 6

0,1 о. е. соединения (VIII) выдерживали в 0,1 н NaOH при 20oC в течение 12 ч. Радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов этой реакции приведена на фиг. 4. В результате реакции наблюдается количественный гидролиз (VIII) с образованием исходных соединений.

Пример 7

0,01 о. е. соединения (VIII) выдерживали в 0,5 М водном растворе этилендиамина (ЭДА) (pH 8,0) при 37oC в течение 1 сут. На фиг. 4 приведен радиоавтограф гель-электрофореза продуктов реакции аминолиза этого соединения. Как видно из этой фиг., при обработке соединения (VIII) ЭДА происходит количественное расщепление модифицированной связи и наблюдается образование ЭДА-производного гептадекануклеотида (IX).

Пример 8

Аналогичным образом, как описано в примерах 5 и 7, был проведен кислотный гидролиз и аминолиз ковалентно-связанного комплекса олигонуклеотид-НК следующей структуры:

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

Радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов этих реакций

Пример 9

Синтез

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

0,04 о.е. смеси эквимольных количеств олигонуклеотидного зонда d(AGTGTGGTTAATGATCTACAGTT)pdRp и олигонуклеотидного зонда pdRpd(CACCAATTACTAGATGTCAATAATTT)p32, где

ковалентно-связанные комплексы олигонуклеотид-нуклеиновая   кислота, способ их получения, патент № 2124522

(суммарная нуклеотидная концентрация 10-3 М) обрабатывали 0,2 М раствором КДИ в морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем ионы двухвалентного металла, при 10oC в течение 2 суток. Контроль за ходом реакции осуществляли методом гель-электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Выделение продуктов реакции из реакционной смеси проводили элюцией с ПААГ.

Пример 10

0,01 о.е. соединения (XXI) обрабатывали 15% водным раствором CH3COOH при 50oC в течение 2 ч. В ходе реакции проходил гидролиз изучаемого соединения с образованием исходных соединений.

Пример 11

0,1 о.е. соединения (XXI) выдерживали в 0,1 н NaOH при 20oC в течение 12 ч. В результате реакции наблюдается количественный гидролиз (XXI) с образованием исходных соединений.

Пример 12

0,01 о. е. соединения (XXI) выдерживали в 0,5 М водном растворе этилендиамина (ЭДА) (pH 8,0) при 37oC в течение 1 сут. В результате реакции происходит количественное расщепление модифицированной связи и наблюдается образование ЭДА-производного исходного олигонуклеотида.

Возможность избирательного расщепления полученных ковалентно-связанных комплексов олигонуклеотид-НК является важным преимуществом этих соединений и открывает новые перспективы их использования в молекулярной биологии и генной инженерии. Таким образом, предложенное техническое решение неизвестно из уровня техники, явным образом не следует из него и может быть без изменения использовано в отраслях народного хозяйства.

Источники информации

1. Власов В.В., Кнорре Д.Г., Кутявин И.В., Мамаев С.В., Подуст Л.М., Федорова О.С. Биоорган. химия. 1987, т. 13, N 9, с. 1221 - 1229.

2. Шабарова З. А. , Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М., 1978, с. 360 - 361.

3. Кнорре Д. Г., Зарытова В.Ф., Бадашкеева А.Г., Федорова О.С. Реакционноспособные производные олигонуклеотидов как геннаправленные биологически активные вещества. М.: "Итоги науки и техники". Сер. Биотехнология. 1991. т. 37, с. 1 - 182.

4. Vlasov V.V., Zarytova V.F., Kutiavin I.V, Mamaev S.V., Podyminogin M. A. Nucl. Acids Res., 1986, v. 14, N 10, p. 4065 - 4076.

5. Годовикова Т. С. , Зарытова В.Ф., Халимская Л.М. Биоорганич. химия, 1986, т. 12, N 4, с. 475 - 481.

Класс C07H21/04 с дезоксирибозилом в качестве сахаридного радикала

набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)
биологический днк маркер для идентификации гена устойчивости к х вирусу картофеля -  патент 2522828 (20.07.2014)
элементы рекомбинантного вектора экспрессии (reves) для усиления экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах -  патент 2518340 (10.06.2014)
способ специфического отбора высокоаффинных молекул днк (днк-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени -  патент 2513700 (20.04.2014)
способ анализа нарушений, связанных с раком яичников -  патент 2511408 (10.04.2014)
набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк аденовируса серотипов 3,4,7,14,21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции -  патент 2511043 (10.04.2014)
способ количественной оценки терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека с помощью полимеразной цепной реакции и дуплекс-специфического анализа, наборы синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления этого способа -  патент 2508407 (27.02.2014)
композиции и способы модуляции экспрессии рецептора фактора роста фибробластов 4 (fgfr4) -  патент 2501803 (20.12.2013)
способ очистки g-богатых олигодезоксирибонуклеотидов -  патент 2501802 (20.12.2013)
способ выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды (варианты) и сосуд из пластика для сорбирования нуклеиновых кислот из жидкой среды -  патент 2495925 (20.10.2013)
Наверх