рекомбинантная плазмидная днкрtv241, способ конструирования рекомбинантной плазмидной днкрtv241, способ конструирования плазмиды, содержащей ген cry iii a в составе транспозона tn917cat, штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, активный против колорадского жука

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTV241, обеспечивающая экспрессию гена дельта-эндотоксина cryIIIA Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis размером 16,3 т.п.н., содержащая следующие конструктивные элементы: полную последовательность векторной плазмиды pTV24 размером 12,4 т.п.н.; полную последовательность BamHI - Bgl II - фрагмента ДНК Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis размером 2,9 т.п.н.; интактный ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis cryIIIA, встроенный в последовательность транспозона Тп917 cat; ген устойчивости к тетрациклину (tet); ген устойчивости к хлорамфениколу (cat) в составе транспозола Тп917 cat; генетические элементы плазмиды pE194, обеспечивающие репликацию плазмиды pTV24 и входящие в состав данной плазмиды; гены и структурные элементы, необходимые для миграции транспозона Тп 917 cat; сайты расщепления эндонуклеазой EcoRI с координатами 0; 6, 9 и 7,4 т.п.н.; сайты расщепления эндонуклеазой Pts I с координатами 8,4 и 13,7 т.п.н.; сайт расщепления эндонуклеазой Bam HI с координатой 9,1 т.п.н.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTV241, заключающийся в том, что смесь ДНК плазмиды pUC19 и Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis расщепляют эндонуклеазой HindIII, обрабатывают смесью клетки Eschrichia coli JM103, отбирают бесцветные колонии на среде Мак-Конки с ампициллином, отобранные колонии проверяют на наличие последовательностей ДНК, гомологичных соответствующим последовательностям cryIIIA гена, из клеток одной из колоний, содержащих указанные последовательности, выделяют ДНК-плазмиду с геном cryIIIA Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, обозначенную pBTT51, далее плазмиду pBTT51 расщепляют эндонуклеазами BamHI и Bgl II, полученные фрагменты смешивают с фрагментами ДНК плазмиды pVT24, подвергнутой гидролизу эндонуклеазой BamHI, фрагменты соединяют с помощью ДНК-лигазы и трансформируют ими посредством электропорации клетки Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, высевают трансформанты на агаризованную среду, содержащую хлорамфеникол (Cm), выделяют из Cm-устойчивых клеток плазмидные ДНК, проводят их рестрикционный анализ и отбирают целевую рекомбинантную плазмидную ДНК pTV24, в структуре которой BamH I - Bgl II - фрагмент плазмиды pTV241 размером 2,9 т.п.н. встроен в BamH I -сайт плазмиды pTV24 и cryIIIA ген находится в прямой ориентации по отношению к гену, определяющему устойчивость к эритромицину.

3. Способ конструирования плазмиды, содержащей ген cryIIIA в составе транспозона Тп917cat, размером около 50 т.п.н., заключающийся в том, что рекомбинантную плазмидную ДНКpTY241 передают с помощью электропорации в клетки штамма Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni DC, отбирают трансформированные клоны по устойчивости к хлорамфениколу (Cm), отобранные клоны скрещивают с бесплазмидным штаммом Bacillus cereus, устойчивым к рифампицину (Rf), и из клеточных клонов, устойчивых к хлорамфениколу и рифмапицину (Cm^r Rf^r), выделяют целевую коньюгативную плазмиду, в состав которой транспозон Тп917 cat с геном cryIIIA включился в результате его транслокации из pTV241.

4. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37, содержащий коньюгативную плазмиду, полученную, как описано в п.3 формулы, активный против колорадского жука.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis (cryIIIA), активного против колорадского жука, в составе транспозона, способ конструирования данной рекомбинантной плазмидной ДНК, способ конструирования конъюгативной плазмиды с этим транспозоном и энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis, содержащий рекомбинантную плазмиду с сrуIIIА-геном и продуцирующий Coleoptera-специфический кристаллический дельта-эндотоксин и бета-экзотоксин.

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis - продуцент дельта-эндотоксина против колорадского жука (SU патент 1814520 МПК А 01 N 63/00). Однако данный штамм обладает недостаточно высокой инсектицидной активностью.

Известен штамм Bacillus thuringiensis, синтезирующий белки, токсичные против насекомых отряда Соlеорtега, известны последовательности этих токсинов и кодирующих их генов (патент ЕР 0498537 A2 С 12 N 15/32,1992).

Однако приведенные в этом источнике сведения носят общий характер и не содержат подробной информации о возможных способах конструирования новых штаммов и их характеристиках. Кроме того, данные гены кодируют токсины, отличные от токсина сгуIIIА-типа, продуцируемого заявляемым штаммом Bacillus thuringiensis.

Задача изобретения - создание штамма Bacillus thuringiensis - продуцента биоинсектицида комбинированного действия для борьбы с колорадским жуком и другими жесткокрылыми насекомыми.

Создана рекомбинантная плазмидная ДНК pTV241, обеспечивающая экспрессию гена дельта-эндотоксина cryIIIA Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis размером 16,3 т.п.н., содержащая следующие конструктивные элементы:

полную последовательность векторной плазмиды pTV24 размером 12,4 т.п.н;

- полную последовательность Bam HI-Bgl II-фрагмент ДНК B.thuringiensis subsp.tenebrionis размером 2,9 т.п.н;

- интактный ген дельта-эндотоксина B.thuringiensis subsp. tenebrionis cryIIIA, встроенный в последовательность транспозона Тп917 cat;

- ген устойчивости к тетрациклину (tet);

- ген устойчивости к хлорамфениколу (cat) в составe транспозона Тп917 cat;

- генетические элементы плазмиды pE194, обеспечивающие репликацию плазмиды pTV24 и входящие в состав данной плазмиды;

- гены и структурные элементы, необходимые для миграции транспозона Тп917 cat;

- сайты расщепления эндонуклеазой EcoRI с координатами 0; 6,9 и 7,4 т.п. н;

- сайты расщепления эндонуклеазой Pst I с координатами 8,4 и 13,7 т.п.н;

- сайт расщепления эндонуклеазой Bam HI с координатой 9,1 т.п.н.

Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTV241, заключается в том, что смесь ДНК плазмиды pUC19 и B.thuringiensis subsp. tenebrionis расщепляют эндонуклеазой HindIII, обрабатывают ДНК-лигазой, трансформируют обработанный смесью клетки Escherichia coli JM103, отбирают бесцветные колонии на среде Мак-Конки с ампицилином, отобранные колонии проверяют на наличие последовательностей ДНК, гомологичных соответствующим последовательностям cryIIIA гена, из клеток одной из колоний, содержащих указанные последовательности, выделяют ДНК-плазмиду с геном cryIIIA B.thuringiensis subsp. tenebrionis, обозначенную pBTT51, далее плазмиду pBTT51 расщепляют эндонуклеазами Bam HI и Bgl II, полученные фрагменты смешивают с фрагментами ДНК плазмиды pTV24, подвергнутой гидролизу эндонуклеазой Bam HI, фрагменты соединяют с помощью ДНК-лигазы и трансформируют ими посредством электропорации клетки бесплазмидного штамма B.thuringiensis subsp. kurstaki высевают трансформанты на агаризованную среду, содержащую хлорамфеникол (Cm) выделяют из Cm-устойчивых клеток плазмидные ДНК, проводят их рестрикционный анализ и отбирают целевую рекомбинантную ДНК pTV241, в структуре которой Bam HI-Bgl II-фрагмент плазмиды pBTT51 размером 2,9 т.п.н. встроен в Bam HI-сайт плазмиды pTV241 из cryIIIA ген находится в прямой ориентации по отношению к гену, определяющему устойчивость к эритромицину.

Способ конструирования конъюгативной плазмиды, содержащей ген cryIIIA в составе транспозона Тп917 cat, размером около 50 т.п.н., заключается в том, что рекомбинантную ДНК pTV241 передают с помощью электропорации в клетки штамма B. thuringiensis subsp. morrisoni DC, отбирают трансформированные клоны по устойчивости к хлорамфениколу (Cm), отобранные клоны скрещивают с бесплазмидным штаммом Bacillus cereus, устойчивым к рифампицилину (Rf), и из клеточных клонов, устойчивых к хлорамфениколу и рифампицину (Cm Rf), выделяют целевую конъюгативную плазмиду, в состав которой транспазон Тп917 cat с геном cryIIIA включился в результате его транслокации из pTV241.

Предложен штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37, содержащий конъюгативную плазмиду, полученную, как описано выше, активный против колорадского жука. Регистрационный номер в Центральной коллекции микроорганизмов Российского акционерного общества "Биопрепарат" ЦКМ В - 65И.

Штамм получен в результате конъюгационного переноса плазмиды с cryIIIA-геном из B.cereus в клетки стрептомицин-устойчивого акристаллического варианта штамма B.thuringiensis subsp. thuringiensis 98.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Вегетативные клетки штамма палочковидной формы длиной 2,6 - 5,5 мкм, шириной 1,7-1,9 мкм, в логарифмической фазе роста подвижные, грамположительные, расположены одиночно, попарно или в цепочках из нескольких клеток, в стационарной фазе роста спорулируют и образуют параспоральные кристаллические белковые включения квадратной формы. На МПА колонии серовато-белого цвета, округлые со слегка волнистыми краями, непрозрачные.

Физиолого-биохимические признаки.

Усваивает глюкозу, маннозу, сахарозу, целлобиозу, салицин, гидролизует крахмал, эскулин, пептонизирует молоко, образует лецитиназу и уреазу, восстанавливает нитраты. По Н-антигену относится к I-серотипу. Оптимальная температура роста 28-30^oC.

Генетические особенности штамма.

Несет плазмиду с транспозоном Тп917 cat-cryIIIA. Молекулярная масса плазмиды - около 50 т.п.н. Проявляет устойчивость к хлорамфениколу (5-10 мкг/мл) и эритромицину (1 мкг/мл), детерминируемые геном cat и erm в составе транспозона.

Условия хранения штамма.

Штамм может храниться в лиофильно-высушенном состоянии или в столбиках 0,7% агаризованной среды под вазелиновым маслом после споруляции клеток.

Штамм непатогенен для теплокровных животных.

Преимущества такого штамма, перед другими штаммами В. thuringiensis, используемыми для биологического контроля колорадского жука:

- более высокая инсектицидная активность

- уменьшение риска формирования популяций насекомых устойчивых к биоинсектициду.

На чертеже показана карта плазмиды pTV241.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Из клеток штамма B.thuringiensis subsp. tenebrionis, синтезирующего энтомоцидный белок против личинок колорадского жука, выделяют ДНК. Бактерии выращивают в 1 л среды LB до поздней логарифмической фазы роста при 30^oC, клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 50 мл TES-буфера (0,01 М трис-HCl, pH 8,0, 0,001 М ЭДТА, 0,1 М NaCl) и добавляют 5 мл раствора лизоцима (20 мг/мл). Суспензию клеток инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, затем добавляют 3 мл 20%-ного раствора додецилсульфата натрия. Лизат экстрагируют дважды равным объемом смеси хлороформа и изоамилового спирта (24: 1). Препарат ДНК обрабатывают РНК-азой (конечная концентрация 50 мкг/мл) в течение 1 ч при 37^oC и осаждают этанолом. Чистоту и концентрацию препарата ДНК определяют спектрофотометрически. Затем смешивают 0,1 мкг ДНК плазмиды pUC19, выделенной из клеток Escherichia coli и очищенной в градиенте плотности CsCl в присутствии бромистого этидия и 2 мкг ДНК B.thuringiensis subsp. tenebrionis и гидролизуют эндонуклеазой HindIII (10 ед.) в 50 мкл буфера Б (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол). ДНК осаждают добавлением двух объемов этанола, растворяют в буфере ТЕ (10 мМ трис-HCl, pH 7,4, 1мМ ЭДТА, pH 8,0) добавляют буфер для лигирования (конечная концентрация - 66 мМ трис-HCl, pH 7,5, 5 мМ MgCl₂, 5мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ) и ДНК - лигазу фага Т4 (1 ед/мкг ДНК). Концентрация ДНК составляет около 50 мкг/мл. Реакцию проводят при 8-10^oC в течение ночи.

Для получения компетентных клеток культуру E.coli DH-альфа выращивают в среде LB при 37^oC до середины логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием (эту и дальнейшие операции проводят при 2-4^oC). Осадок ресуспендируют в 1/2 первоначального объема 10 мМ раствора CaCl₂, выдерживают 20 мин и после центрифугирования ресуспендируют в 1/50 первоначального объема 50 мМ CaCl₂. Через 12-24 ч хранения при 2-4^oC 0,2 мл суспензии клеток смешивают с 10 мкл раствора, лигированной ДНК (10-50 мкг/мл) и инкубируют 30-60 мин на льду. Трансформационную смесь переносят на 2 мин в водяную баню (42^oC), добавляют к суспензии 1 мл LB, инкубируют 1 ч при 37^oC и высевают на aгаризованную среду Мак-Конки с ампициллином (100 мкг/мл).

Чашки инкубируют при 37^oC в течение ночи и отбирают бесцветные колонии. Из клеток этих клонов выделяют плазмидные ДНК и, используя эти ДНК в качестве матриц, проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Праймерами в ПЦР служат олигодезоксинуклеотиды, имеющие следующую структуру: 5 - GGNNCCAACCAGGATATT - 3 и 5 -CAGACCGCAAGATTTGAT - 3 !

Первый соответствует фрагменту cryIIIA-гена B.thuringiensis subsp. tenebrionis c 1034 по 1051 нуклеотид и второй комплементарен последовательности этого детерминанта с 1215 по 1232 нуклеотид. Последовательности ДНК, исследуемые на наличие гена Coleoptera-специфического инсектицидного белка, амплифицируют in vitro с помощью ПЦР в 50 мкл реакционной смеси, содержащей около 10 мг ДНК, праймеры (концентрация каждого праймера - 0,3 мкМ), 60 мМ трис-HCl, 16 мM (NH3)₂SO₄, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 0,01 % тритона Х-100, 0,01% Твин-20, бычий сывороточный альбумин (0,1 мг/мл), смесь дезоксинуклеозидфосфатов (дАТФ, дЦТФ, и дТТФ - по 0,2 мМ) и 2 ед. Tth - полимеразы; pH смеси - 8,8 при 25^oC. Реакцию амплификации проводят под вазелиновым маслом в течение 30 циклов: 94^oC - 1 мин, 45^oC - 2 мин и 67^oC - 2 мин.

Продукты ПЦР разделяют с помощью электрофореза в геле 2,5-ной агарозы и отбирают клоны, содержащие плазмиды, являющиеся матрицей для синтеза фрагментов ДНК размером около 0,2 т.п.н., при использовании в ПЦР указанных праймеров. Плазмиду, в структуре которой ген дельта - эндотоксина входит в состав HindIII - фрагмента размером около 3 т.п.н. и находится в прямой ориентации по отношению к lac-промотору, обозначают как рВТТ51.

ДНК плазмиды рВТТ51 трансформируют клетки E.coli GM272, выделяют из клеток трансформантов плазмидную ДНК и гидролизуют рестрикционными эндонуклеазами Bgl II и Bam HI при 37^oC в буфере А (10 мМ трис-HCI, pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол) и буфере Б соответственно. ДНК плазмиды pTV24 расщепляют рестриктазой Bam HI при 37^oC в буфере Б. По окончании реакции гидролиза инкубационные смеси прогревают при 65^oC и вносят 5 М раствор NaCl до конечной концентрации 0.1 М. ДНК осаждают добавлением двух объемов этанола и растворяют в буфере ТЕ.

Гидролизаты ДНК pBTT51 и pTV24 смешивают в соотношении 5:1 и фрагменты ДНК объединяют с помощью ДНК - лигазы, как описано выше. Полноту гидролиза и лигирования ДНК контролируют с помощью электрофореза в геле 0,7%-ной агарозы.

Для трансформации с помощью электропорации культуру бесплазмидного штамма В. thuringiensis subsp. kurstaki выращивают в среде BHIG (сердечно-мозговая вытяжка - 3,7%, глицерин - 0,5%) с перемешиванием на качалке при 28-30^oC в течение ночи, разбавляют в 20 раз и продолжают инкубацию еще 1 ч. Клетки осаждают, промывают средой ЕВ (0,625 М сахароза, 1 мМ MgCl₂), снова центрифугируют и суспендируют в ЕВ (клетки из 5 мл культуры суспендируют в 0,75 мл буфера). Суспензию помещают в ледяную баню (2-4^oC), добавляют 2 мкл раствора лигированной ДНК с концентрацией 50-100 мкг/мл и смесь инкубируют на льду 5 мин. Затем вносят в электродную ячейку с расстоянием между электродами 2,5 мм и проводят одиночный разряд 1500 c продолжительностью 1 мс. Ячейку переносят на лед, инкубируют 5 мин и суспензию клеток из ячейки добавляют к 1,5 мл BHIG. Культуры инкубируют на качалке при 28-30^oC 1 ч и высевают на чашки со средой LB, содержащей хлорамфеникол (5 мкг/мл). Чашки инкубируют в течение суток при 28-30^oC, выросшие колонии отбирают, из полученных клонов выделяют плазмидные ДНК и проводят рестрикционный анализ выделенных плазмид. Отбирают плазмиды, которые переходят в линейную форму при расщеплении Bam HI и имеют размер 16,3 т.п.н. Рекомбинантную плазмиду, содержащую cryIIIA-ген в прямой ориентации по отношению к erm-гену, обозначают как pTV241.

Карта плазмиды pTV241 представлена на чертеже.

Пример 2.

Для конструирования конъюгативной плазмиды с cryIIIA-геном плазмиду pTV241 передают с помощью электропорации в клетки штамма B.thuringiensis subsp. morrisoni DC или другого штамма, несущего конъюгативную плазмиду, и трансформированные клоны отбирают по устойчивости к хлорамфениколу, как описано выше. Трансформанты скрещивают с бесплазмидным штаммом В. cereus, устойчивым к рифампицину (Rf), и в случае использования в качестве донора трансформанта в B. thuringiensis subsp. morrisoni DC, из клеток CMRf- клонов трансконъюгантов выделяют 50 т.п.н. плазмиду, в структуру которой включился транспозон с cryIIIA-геном в результате его транслокации из генома pTV241.

Пример 3.

Для получения штамма B.thuringiensis - продуцента двух токсинов различного механизма действия, бета-экзотоксина и дельта-эндотоксина, активных против колорадского жука и других насекомых отр. Coleoptera, штамм B.cereus, несущий конъюгативную плазмиду из B. thuringiensis subsp. morrisoni DC с cryIIIA-геном, скрещивают сo стрептомицинустойчивым мутантом штамма B.thuringiensis subsp. thuringiensis 98 (ExoCry). Отбор трансконъюгантов проводят на агаризованной среде LB, содержащей стрептомицин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (5 мкг/мл). В клетках трансконъюгантов детектируют продукцию кристаллов дельта-эндотоксина с помощью фазовоконтрастной микроскопии и бета-экзотоксина с помощью тонкослойной хроматографии культуральной жидкости. Синтез энтомоцидного белка cryIIIA-типа подтверждают с помощью метода двойной радиальной иммунодиффузии, используя сыворотку кролика к кристаллическому инсектицидному белку, продуцируемому B.thuringiensis subsp. tenebrionis. Один из клонов трансконъюгантов - продуцентов дельта-эндотоксина cryIIIA-типа и бета-экзотоксина обозначают как В. thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37.

Пример 4.

Оценку инсектицидной активности штамма В. thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37 проводят на личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) первого или второго возраста, отродившихся из одной природной популяции. Бактериальную культуру разводят в 5 раз 0,9% NaCl и готовят серию из пяти разведений культуры с шагом 5. В качестве положительного контроля используют серии разведений спорокристаллических смесей B.thuringiensis subsp. tenebrionis и thuringiensis subsp. thuringiensis. В приготовленные суспензии опускают листья картофеля примерно одного размера, вынимают, дают им высохнуть при 20^oC и помещают в чашки Петри. В качестве отрицательного контроля используют раствор 0,9% NaCl. На каждое разведение используют по 10 личинок жука и по 2-5 листьев картофеля. Учет гибели личинок проводят через 3 суток инкубирования в термостате при температуре 21^oC и фотопериоде 18 ч. Биологическую активность штаммов, выраженную в ЛК₅₀, вычисляют по формуле Кербера в процентах концентрации культуральной жидкости (КЖ) в суспензии:

lg ЛК₅₀= lgСм - (L - 0,5),

где С_м - максимальная из испытанных концентраций;

- логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведения);

L - сумма значений L (доли погибших личинок от числа испытуемых), найденных для всех концентраций с учетом поправки на гибель в контроле по методу Аббота:

L=(p_о-p_к):(l-p_к),

где p_о - доля погибших личинок при испытании культуры;

p_к - доля погибших личинок в контрольном опыте.

Штамм В. thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37 по своей инсектицидной активности (ЛК₅₀ равна 0,21% КЖ) превосходит штаммы В. thuringiensis subsp. tenebrionis (ЛК₅₀= 0,86% КЖ) и В. thuringiensis subsp. thuringiensis 98 (ЛК₅₀= 0,82% КЖ). (Абсолютные значения инсектицидной активности могут отличаться в зависимости от популяции колорадского жука, взятой для анализа).

Предлагаемое изобретение позволяет получить штамм В. thuringiensis - продуцент биоинсектицида комбинированного действия против колорадского жука и других насекомых отр. Coleoptera. Конъюгативная плазмида, в которую был включен транспозон с геном Coleoptera-специфического инсектицидного белка, может быть также легко передана в клетки других штаммов В.thuringiensis с целью конструирования продуцентов, синтезирующих токсины в комбинациях, отличных от представленных в данном изобретении.

Положительный эффект предлагаемого изобретения достигается за счет свойств сконструированной новым способом плазмиды pTV241 по наличию в ее структуре транспозона с детерминантом инсектицидного белка cryIIIA-типа, способного транслоцироваться в бациллах, и генетических элементов сконструированной новым способом конъюгативной плазмиды с cryIIIA-геном, определяющих ее способность к передаче и автономной репликации в клетках B.thuringiensis.

Синтез в клетках предлагаемого штамма B.thuringiensis subsp. thuringiensis IPM-37 двух токсинов с различными механизмами действия определяет более чем в 3 раза высокую активность этого штамма по сравнению с другими штаммами B. thuringiensis, используемыми для борьбы с колорадским жуком. Это свойство позволяет также снизить риск формирования популяций насекомых, устойчивых к биоинсектициду.