способ получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки

Формула изобретения

Способ получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки, заключающийся в измельчении эмбриональных тканей животного, их гомогенизации и экстракции в физиологическом растворе, отделении осадка от раствора, отличающийся тем, что в качестве эмбриональных тканей берут мышечные ткани животного, гомогенат выдерживают в течение 10 - 20 ч, а после экстракции выдерживание раствора осуществляют в течение 24 0,5 ч, затем после отделения образовавшегося осадка полученный раствор дополнительно разбавляют физиологическим раствором до достижения концентрации белка в нем 15 - 25 мг/мл и добавляют к нему консервант в количестве не менее 0,05%, после отделения образовавшейся взвеси раствор выдерживают в течение 48 ч, стерилизуют и термостатируют его в течение не менее 3 суток при 36^oC, после чего раствор выдерживают 30 - 40 суток при температуре, не превышающей 15^oC, и удаляют образовавшуюся взвесь, а раствор подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим указанного взаимодействия устанавливают, исходя из контрольной пробы получаемого средства.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологии и медицине.

Дифференциация клетки происходит при различных физиологических процессах в организме и в первую очередь при нарушениях функции иммунной системы и соответствующих последствий этого нарушения, в частности - образовании злокачественных опухолей, нарушении кровотворения и т.п.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки и предназначенного для лечения и профилактики рака (Патент Франции N 2451193, 1979 г.).

Известный способ состоит в измельчении эмбрионов животных, их гомогенизации в физиологическом растворе, получении экстракта эмбрионального комплекса веществ и отделении образовавшегося осадка посредством фильтрования, после чего к фильтрату добавляют антибиотик. В результате осуществления указанной последовательности действий получают лечебный препарат полного эмбрионального комплекса. Лечение полученным препаратом состоит в необходимом курсе инъекций.

Способ-прототип достаточно прост в выполнении, однако он не может обеспечить получение высокоэффективного препарата, поскольку не предусматривает расщепления высокомолекулярных предшественников и активизацию регуляторных пептидов. Полученный препарат содержит форменные элементы и высокомолекулярные белки, что в значительной мере определяет его побочное действие, проявляющееся в аллергии и в ее грозном осложнении - анафилактическом шоке.

Задачей настоящего изобретения является создание способа получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки, который посредством совокупности предусматриваемых в нем действий и режимов, направленных на активизацию одних белково-пептидных компонентов и нейтрализацию других, обеспечивает высокую эффективность получаемого препарата и исключает его побочное действие.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки, заключающемся в измельчении эмбриональных тканей животного, их гомогенизации и экстракции в физиологическом растворе, отделении осадка от раствора, согласно изобретению в качестве эмбриональных тканей берут мышечные ткани животного, гомогенат выдерживают в течение 10 - 20 часов, а после экстракции выдерживание раствора осуществляют в течение 24 0,5 часа, затем после отделения образовавшегося осадка полученный раствор дополнительно разбавляют физиологическим раствором до достижения концентрации белка в нем 15 - 25 мг/мл и добавляют к нему консервант в количестве не менее 0,05%, после отделения образовавшейся взвеси раствор выдерживают в течение 48 часов, стерилизуют и термостатируют его в течение не менее 3-х суток при температуре 36^oC, после чего раствор выдерживают 30 - 40 суток при температуре, не превышающей 15^oC, и удаляют образовавшуюся взвесь, а раствор подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим указанного взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства.

Авторами предложенного способа предусмотрены особенности получения белково-пептидного комплекса (БПК), представляющего собой средство, обладающее определенной специфичностью и необходимым качеством.

Использование в качестве сырья эмбриональных мышечных мягких тканей животного отвечает специфичности получаемого средства. Выдерживание гомогената указанных тканей в течение 10 - 20 часов обусловлено биосинтезом экстремальных белков, от природы которых зависит качество получаемого лечебного средства. При времени больше указанного происходит ухудшение качества препарата, т.к. образуются некротические белки, вызывающие токсикоз. При меньшем времени выдержки также получают препарат низкого качества.

После экстракции БПК в физрастворе предложено выдерживать раствор в течение 24 часов - при таких условиях достигается максимальная полнота экстракции, при выдержке раствора за пределами указанного времени резко изменяется качество получаемого препарата. В процессе выдержки формируются предшественники активных белков, которые и определяют специфичность препарата.

На этой стадии биосинтеза образуется осадок нерастворимых белков (тканевых, плазматических и др.), их отделяют, а полученный раствор дополнительно разбавляют физраствором до достижения концентрации белков 15 - 20 мг/мл, таким образом задают оптимальные условия для последующего проведения протеолиза.

Добавление к полученному раствору консерванта в количестве не менее 0,05% предназначено для противомикробного, противогрибкового и т.п. обеззараживания получаемого препарата.

Образовавшуюся взвесь, представляющую собой белки, мембраны, структурные белки, липидные частицы и др., отделяют, поскольку последующий процесс аутолиза будет распространяться и на них, что неблагоприятно отражается на качестве лечебного средства.

Оставшийся раствор выдерживают в течение 48 часов. Экспериментально доказано, что этого времени достаточно для завершения процессов агрегации частиц. Полученный раствор стерилизуют для удаления вирусов, бактерий, хламид, грибков и т.п. Стерилизацию можно выполнить любым из принятых в данной области методом в соответствии с требованиями ВОЗ.

Следующие действия над полученным раствором БПК относятся к аутолизу. Термостатирование раствора осуществляют в течение не менее 3-х суток при температуре 36 2^oC.

Выбор времени термостатирования при данной температуре обусловлен достижением максимальной специфичности получаемого лечебного средства.

Процессы, происходящие на этой стадии, могут быть определены как инактивация ростового фактора и, кроме того, при этом большие белки расщепляются на куски, что делает получаемый препарат неиммуногенным.

Дальнейшее выдерживание раствора в течение 30 - 40 суток при температуре не выше 15^oC определено следующими факторами - при этих условиях мягко заканчивается процесс аутолиза с одновременной агрегацией образовавшихся частиц, которые отделяют.

Оставшийся раствор БПК подвергают протеолизу на иммобилизованном протеолитическом ферменте, например, на заполненной им колонке.

Изобретение поясняется примером конкретного выполнения.

Для получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки, берут эмбриональные мышечные ткани крупного рогатого скота. Отобранное сырье измельчают, гомогенизируют при температуре, не превышающей 8^oC, гомогенат выдерживают в течение 16 часов, разбавляют охлажденным физиологическим раствором, затем после экстракции раствор дополнительно выдерживают при температуре 4 - 8^oC в течение 24 часов.

В процессе выдерживания образуется осадок, который отделяют центрифугированием при скорости 3000 об. в течение 1 часа при температуре 2 - 4^oC.

Полученный раствор разбавляют физиологическим раствором до достижения концентрации белка в нем 21 мг/мл, добавляют по каплям консервант, например хиназол, до достижения его концентрации в растворе БПК 0,05%. Затем отделяют образовавшуюся взвесь посредством пропускания раствора через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и выдерживают фильтрат в течение 48 часов.

После этого производят стерилизацию раствора, например, посредством пропускания его в асептических условиях через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Полученный таким образом стерильный раствор герметически закрывают и термостатируют в течение 3 - 4 суток при температуре 36^oC. После термостатирования раствор выдерживают 35 суток при температуре, не превышающей 15^oC, образовавшуюся взвесь отделяют центрифугированием, а фильтрат дополнительно пропускают через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Полученный раствор БПК пропускают через колонку (при температуре 25 - 30^oC), заполненную агарозой 4B, иммобилизованной ферментом, например трипсином.

Скорость элюции раствора БПК устанавливают исходя из соответствия электрофореграммы элюата с контрольной электрофореграммой БПК.

Полученную жидкость в асептических условиях стерилизуют путем пропускания ее через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего заливают в ампулы и запаивают.

Полученное средство представляет собой прозрачную жидкость с легким желтым оттенком без запаха, которая может смешиваться с водой или физиологическим раствором в любых соотношениях. При температуре 20 0,2^oC жидкость имеет плотность 1,0106 г/см, показатель преломления при температуре 20 0,3^oC - 1,3410 0,0004, водородный показатель pH 6,5 - 7,0.

На чертеже представлена контрольная электрофореграмма полученного препарата.

Таким образом, в результате заявленного способа получено лечебное средство, регулирующее дифференциацию клетки ("Пропес"), на которое имеется фармстатья и которое широко испытано на больных. Средство признано как высокоэффективное при лечении заболеваний, сопровождающихся нарушением дифференциации клетки.