способ получения овоингибитора
Классы МПК: | A61K38/55 ингибиторы протеаз C12N9/99 инактивация ферментов химической обработкой |
Автор(ы): | Швец Т.В., Козловская Э.П. |
Патентообладатель(и): | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН |
Приоритеты: |
подача заявки:
1997-12-31 публикация патента:
27.04.1999 |
Изобретение относится к медицинской и пищевой промышленности, биотехнологии и биохимии, может найти применение в качестве ингредиента лекарственных препаратов, пищевой добавки, элемента лечебно-профилактического питания. Из белка куриного яйца выделяют нативную фракцию дистиллированной водой, очищают ее на гидрофобном сорбенте полихроме 1, уравновешенном водой. Элюцию активного белка ведут дистиллированной водой с последующей рехроматографией ингибитора на ионообменном сорбенте - SP - Сефадексе G25. Получен овоингибитор с более высоким выходом -19,74 % от исходного белка водорастворимой части белка куриного яйца, с мол. м. 50120 Да и ингибирующей активностью по отношению к трипсину 26,7 ИЕ.
Формула изобретения
Способ получения овоингибитора, предусматривающий выделение активной фракции из белка куриного яйца и ее хроматографическую очистку, отличающийся тем, что выделение осуществляют дистиллированной водой, а очистку - на полихроме 1 с элюцией активного белка водой и рехроматографией на ионообменном сорбенте.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине и пищевой промышленности, биотехнологии и биохимии и касается способа получения овоингибитора протеиназ, который может найти применение в качествен ингредиента лекарственных препаратов, пищевой добавки, элемента лечебно-профилактического питания. Развитие неконтролируемого протеолиза является причиной серьезных нарушений в организме, поэтому интенсивно ведется исследование белков-ингибиторов протеиназ, которые можно использовать в заместительной терапии при лечении заболеваний, сопровождающихся избыточной активацией протеолитических систем организма (воспалительные процессы, панкреатит, злокачественные новообразования). Кроме того, ингибиторы протеолитических ферментов используются для стабилизации белковых медицинских препаратов и ограничения протеолиза в пищевой промышленности. Белковые ингибиторы протеиназ выделяют из различных источников растительного и животного происхождения. Известен способ ингибитора типа Баумана-Бирк (BBI) из сои культурной, включающий следующие стадии: удаление нерастворимых веществ из соевых бобов, обезжиренных гексаном и подвергнутых экстракции водным раствором кислоты, с целью получения растворимых белковых веществ с концентрацией не ниже 50%; добавление к растворимым веществам сои ацетона с целью получения неочищенного концентрата ингибитора; разбавление концентрата водой; удаление нерастворимых веществ из разбавленного концентрата ингибитора и добавление в него ацетона с целью получения растворимого в воде и нерастворимого в ацетоне концентрата ингибитора Баумана-Бирк; высушивание полученного концентрата [1]. Молекулярная масса соевого ингибитора составляет 8000 Да. Изучается возможность использования соевого ингибитора при лечении злокачественных новообразований [2]. Известен способ получения панкреатического ингибитора типа Кунитца из органов крупного рогатого скота [3]. Сущность способа заключается в том, что из отходов производства инсулина путем ионообменной хроматографии, химической очистки, высаливания, гель - хроматографии и осаждения выделяют с высоким выходом субстанцию BPTI медицинского назначения, получившую название ингипрол. Молекулярная масса ингибитора типа Кунитца составляет 6500 Да. Панкреатический ингибитор типа Кунитца является действующим началом лекарственных препаратов, широко используемых в клинической практике, таких как трасилол, гродокс, контрикал и апротинин. Однако существенным недостатком данного ингибитора является его применение в высоких дозах вследствие быстрого удаления из кровотока после внутривенной инъекции, что по-видимому, обусловлено молекулярной массой BPTI. Поэтому весьма актуальным является разработка методов выделения более высокомолекулярных ингибиторов протеиназ из других биологических объектов. Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получения овоингибитора из яичного белка, включающий осаждение ингибитора трихлоруксусной кислотой с ацетоном с последующим диализом и лиофилизацией осадка; сухой осадок растворяют в небольшом объеме воды, pH раствора доводят до 4,0 и наносят на колонку с KM-целлюлозой [4] . Хроматографию осуществляют ступенчатым градиентом: (1) - раствором 0,1 M аммоний - ацетатного буфера (pH 4,0), которым элюируется фракция, содержащая в основном овомукоид; (2) - 0,1 М аммоний-ацетатный буфером (pH 4,9), которым элюируется фракция, содержащие овомукоид и незначительное количество овоингибитора, и (3) - 0,1 М аммоний-ацетатный буфером (pH 5,0) плюс 1 М NaCl, которым элюируется основная часть ингибитора. После диализа и лиофилизации третья фракция была растворена в 0,005 М Трис-HCl буфере (pH 7,6) и отдиализована против такого же буфера в течение 12 час. Диализованный продукт центрифугируют для удаления нерастворимого материала и наносят на колонку с DEAE-целлюлозой (2,3x45 см), уравновешенной 0,005 М Трис-HCl буфером (pH 7,6). Хроматографию осуществляют линейным градиентом 0,005-0,2 М Трис-HCl буфера (pH 7,6). Активные фракции объединяют, обессоливают на сефадексе G-25 и лиофилизируют. Получают овоингибитор с молекулярной массой 48000![способ получения овоингибитора, патент № 2129438](/images/patents/342/2129013/177.gif)
![способ получения овоингибитора, патент № 2129438](/images/patents/342/2129005/946.gif)
1. Патент США N 5217717, 78, 47/00; B 11B 1/00; A 23 L 1/20, 1993. 2. Witschi H., Kennedy A.R. // Carcinogenesis, 1989. V. 10. P2275-2277. 3. Ларионова Н. И. , Балабушевич Н.Г., Гладышева И.П., Мороз Н.А., Казанская Н. Ф. , Полехина О.В., Донецкий И.А. // Вопросы медицинской химии. 1994. Т.40. N 3. С. 25-31. 4. Liu Woo-Hoe, Means Gary E., Feeney Robert E. // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V.229. P. 176-185. 5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A. L., Randall J. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275. 6. Остерман Л.А. // Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М. "Наука". 1981.
Класс A61K38/55 ингибиторы протеаз
Класс C12N9/99 инактивация ферментов химической обработкой