способ получения гирудина из медицинских пиявок

Формула изобретения

Способ получения гирудина путем высушивания медицинских пиявок 96%-ным этанолом, отличающийся тем, что после высушивания пиявку растирают, порошок суспендируют в воде, кипят в течение 3 - 15 мин, центрифугируют, надосадочную жидкость хроматографируют через сефадекс G-25, собирают первый белковый пик и подвергают аффинной хроматографии на калликреине, иммобилизованном на водорастворимом носителе, собирают несвязавшуюся часть и целевой продукт высушивают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам получения природных антикоагулянтов, блокирующих активность тромбина, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, медицинской промышленности.

Известен способ получения гирудина (1), взятый нами в качестве прототипа. Он заключается в следующем: голодных пиявок высушивают в 96% этаноле в течение 24 часов. Головки пиявок длиной 10-15 мм гомогенезируют и высушивают до сухого порошка. Экстрагируют порошок в 40% ацетоне при 40^oC в течение 30 минут. Подводят значение pH надосадочной жидкости до 5,0 с помощью уксусной кислоты, отбрасывают осадок. При pH 1,8 в надосадочную жидкость вносят 10% трихлоруксусную кислоту и экстрагируют ацетоном при 0^oC в течение 60 минут. Полученный осадок промывают ацетоном, эфиром и лиофилизируют. Растворяют в воде полученный сухой остаток, осуществляют электродиаму через целлофановую мембрану в течение 30 минут. Получают надосадочную жидкость, экстрагируют 40% ацетоном, осаждают гирудин. Осадок экстрагируют 55% водным раствором п-пропанола, собирают надосадочную жидкость и лиофилизируют. Растворяют сухой остаток в небольшом количестве воды, проводят препаративный электрофорез на бумаге, элюируют активную фракцию и лиофилизируют.

Данный способ имеет следующие недостатки:

- громоздкость, трудоемкость, длительность процесса получения гирудина,

- низкий выход целевого продукта: из 20 кг пиявок (10000 шт) получают 35 мл гирудина с активностью 8,500;

- загрязненность целевого продукта примесными белками.

Целью предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков и получение высококачественного продукта гирудина, природного ингибитора фермента тромбина.

Поставленная цель достигается тем, что водный раствор лиофильно высушенных пиявок прогревают в кипящей водяной бане в течение 3-15 минут, центрифугируют, проводят гель-фильтрацию надосадочной жидкости через сефадекс G-25, собирают первый белковый пик, связывают с калликреином плазмы крови, иммобилизированном на водорастворимом носителе, собирают несвязавшуюся часть и упаривают раствор до сухого остатка.

Приводим конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1.

Берут 100 медицинских пиявок (200 г). Высушивают в 96% этаноле, растирают в порошок и суспендируют в дистиллированной воде, центрифугируют при 2500 об/мин, в течение 20 минут. Надосадочную жидкость прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 минут. После охлаждения отделяют осадок центрифугированием при 2000 об/мин, в течение 20 минут, концентрируют надосадочную жидкость в роторном испарителе и пропускают через сефадекс G-25 в колонке размером 50х1,5 мм. Собирают первый белковый пик (с мол.м. от 6 до 8,5 кДа) и подвергают аффинной хроматографии на калликреинагарозе. Несвязавшуюся с калликреином часть раствора собирают и лиофилизируют.

Активность гирудина - 8500 AT IH Ед/мг.

Количество гирудина - 7 мг.

При электрофорезе - одна полоса с мол.м. 7100 Да.

Пример 2.

Берут 100 медицинских пиявок (205 г). Гомогенезируют в измельчителе тканей, суспендируют в дистиллированной воде, инкубируют 30 минут при 37^oC, затем отделяют осадок центрифугирования. Раствор прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 минут, затем охлаждают, центрифугируют, собирают надосадочную жидкость и упаривают ее до минимального объема (1,5 мг) в роторном испарителе. Наносят на колонку (50х1,5 мм) с сефадексом G-25 и собирают первый белковый пик, который подвергают аффинной хроматографии на калликреите плазмы крови, иммобилизованном на сефарозе.

Собирают несвязавшуюся с калликреином часть раствора и лиофилизируют.

Пример 3.

Готовят водный экстракт из разрушенной ультразвукомокультуры бактерии-симбиота медицинских пиявок, центрифугируют при 40000 об/мин в течение 40 минут. Получают надосадочную жидкость, которую подвергают процедурам, указанным в примере 1.

Пример 4.

Берут 20 г. Пиявита (порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок), полученного из 200 г замороженных пиявок. Проводят водную экстракцию, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость прогревают в кипящей водяной бане в течение 8 минут, затем после охлаждения центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость упаривают до минимального объема (2 мл), наносят на колонну (50 х 1,5 мм) с сефадексом G-25, собирают первый белковый пик и подвергают его аффинной хроматографии на калликреин-агарозе. Несвязавшуюся часть раствора собирают и лиофилизируют.

При прогревании водного раствора высушенных пиявок в кипящей водяной бане менее 3 минут конечный продукт имеет низкую активность в пересчете на белок. Невозможно выделить гирудин, так как только разрушение дестабилазы приводит к освобождению связанного с ней гирудина, а термическая обработка дестабилазного комплекса недостаточна для денатурации липопротеидной структуры молекулы дестабилазы.

При прогревании же более 15 минут происходит не только разрушение дестабилазы, но и денатурация всех белковых компонентов. Как видно из таблицы, конечный продукт, получаемый по заявляемому способу, обладает высокой антитромбиновой активностью. Способ прост, нетрудоемок и дает выход гирудина в 20 раз больше, чем способ-прототип.

Способы тестирования.

1. Определение антитромбиновой активности:

Антитромбиновую активность определяют по времени свертывания 0,1 мл 0,3% раствора фибриногена в присутствии 0,1 мм раствора тромбина, содержащего одну международную единицу активности. Удлинение времени свертывания в 2 раза соответствует 2 антитромбиновым единицам гирудина (AT IH).

2. Электрофоретический анализ проводили в системе Лемли, используя 12,5% полиаприламидный гель в присутствии 2М мочевины.

Источники информации.

1. Markwardt F. Die solirung und chemiche Characterisierung des a Hirudins. Hoppe Seyleris Zeitschriffur physiologische Chemic, 308, 147-156, 1957.