способ выделения возбудителя чумы от эктопаразитов, например блох

Формула изобретения

Способ выделения возбудителя чумы от эктопаразитов, например блох, включающий введение биопробным животным подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в смеси с желтком куриного яйца, гепаринизированный кровью животного-донора, кортизоном в количестве 5-7 мг и ингибиторами, и последующее исследование патологического материала с места введения, отличающийся тем, что в качестве животных-доноров используют кроликов, исследуемый материал сначала смешивают с гепаринизированной кровью донора в соотношении 1: 0,5-1: 0,7, затем добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, в качестве ингибиторов используют калий теллуристокислый и генцианвиолет в количестве 0,01-0,03 и 0,001-0,003 мг соответственно, а при бактериологическом исследовании патологического материала в твердую питательную среду добавляют 0,02-0,03 мкг/мл генцианвиолета.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при бактериологическом исследовании эктопаразитов на чуму.

Известен бактериологический метод выделения чумного микроба от блох путем посева их суспензии на питательные среды для выращивания указанного возбудителя ("Основы лабораторной техники при работе с возбудителями особо опасных инфекций". Алма-Ата, 1982, с. 43-44).

Недостатком этого метода является невозможность его применения при исследовании блох, содержащих небольшое количество бактерий, а также насекомых погибших, загнивших или мацерированных от длительного нахождения в воде или в физиологическом растворе, поскольку в них развивается посторонняя микрофлора, затрудняющая выделение чумного микроба.

Известен способ индикации возбудителя чумы, направленный на ускорение процесса (а.с. СССР N 1707080, кл.C 12 Q 1/04, 23.01.92, Бюл. N 3).

Способ включает введение белым мышам подкожно в область спины 0,5-1 мл исследуемой пробы в одном шприце с таким же объемом смеси гепаринизированной крови морской свинки и желтка куриного яйца в соотношении 1:1 - 7:3 и добавлением кортизона в дозе 5-7 мг на одно животное, а фиксацию мазков-отпечатков с места введения осуществляют в течение 10-20 мин в хлороформе.

Использование этого способа позволяет ускорить процесс индикации возбудителя чумы до 24-48 ч благодаря его интенсивному локальному размножению и накоплению. Однако указанный способ не предусматривает выделение чистой культуры чумного микроба и при высеве патологического материала с места введения на твердые питательные среды имеет место подавление специфического роста возбудителя чумы сопутствующей микрофлорой.

Наиболее близким к заявляемому является способ лабораторной диагностики чумы, направленный на ускорение выделения и идентификации чумного микроба (Патент РФ N 2077591, кл. C 12 Q 1/04, N 33/569, опубликован 20.04.97 г., Бюл. N 11).

Способ включает введение биопробным животным (белым мышам) в область спины 0,5-1 мл суспензии в физиологическом растворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5 - 1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5 - 0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,002-0,005 мг натрия азида, 0,02-0,1 мг кадмия хлористого, патологический материал для исследования берут с места введения.

Использование этого способа позволяет обнаружить единичные клетки возбудителя чумы с помощью экспрессных методов спустя 24-48 ч от начала исследования, а выделить и идентифицировать чумной микроб через 36-72 ч. Однако указанный способ не предусматривает исследование блох и не обеспечивает полного подавления роста сопутствующей микрофлоры, характерной для данных насекомых, в результате выделение чистой культуры чумного микроба от эктопаразитов затруднено или невозможно.

Целью изобретения является ускоренное обнаружение и выделение чистой культуры возбудителя чумы от блох, контаминированных посторонней микрофлорой.

Поставленная цель достигается тем, что биопробным животным (белым мышам) вводят подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии 1-10 блох в физиологическом растворе, смешанной с гепаринизированной кровью кролика в соотношении 1:0,5 - 1:0,7 и с добавлением затем в смесь 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона, 0,01-0,03 мг калия теллуристокислого, 0,001-0,003 мг генцианвиолета, бактериологически исследуют только место введения, патологический материал которого высевают на пластины твердой питательной среды, содержащей 0,02-0,03 мкг/мл генцианвиолета.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Предварительно добавляемая к исследуемой суспензии блох гепаринизированная кровь кролика обусловливает переход измененных клеток возбудителя чумы в обычные с интенсивным образованием специфического антигена фракции 1, создает благоприятные условия для задержки, размножения и накопления чумного микроба только на месте введения до развития генерализованного процесса. Добавление к исследуемому материалу калия теллуристокислого и генцианвиолета подавляет рост посторонней микрофлоры в пробах и обеспечивает получение чистой культуры чумного микроба от эктопаразитов. Добавление в твердую питательную среду генцианвиолета при бактериологических исследованиях также способствует получению чистой культуры возбудителя чумы, необходимой для проведения идентификации и определения антибиотикочувствительности.

Способ осуществляется следующим образом. Приготовленных для исследования эктопаразитов (от 1 до 10 блох) тщательно промывают 70^o спиртом, затем двукратно отмывают в стерильной воде или физиологическом растворе, растирают в 3-5 каплях физиологического раствора в фарфоровой ступке, предварительно обоженной пламенем спирта и обмытой стерильным физиологическим раствором. После растирания эктопаразитов в ступку добавляют стерильный физиологический раствор до 0,5-1 мл. Полученную суспензию смешивают с гепаринизированной кровью кролика в соотношении 1:0,5 - 1:0,07, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, а также кортизон, теллурит калия и генцианвиолет из расчета 5-7 мг, 0,01-0,03 мг и 0,001-0,003 мг соответственно на одно животное. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят двум белым мышам подкожно, в область спины. При этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого, плавным движением надавливая на поршень, вводят нужное количество материала.

Биопробных животных умерщвляют хлороформированием на 1 и 2 сутки после заражения. Грызунов прикрепляют к вскрывочной доске приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом животного захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницами, в образовавшееся окошечко вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрезы кожи, обходя по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью.

Место введения подвергают бактериологическому, серологическому и иммунофлуоресцентному исследованиям. Вначале проводят посев петлей на пластины агара Хоттингера, после чего изготавливают мазки-отпечатки для окраски по Граму и исследования методом флуоресцентных антител. Затем ножницами тщательно срезают ткани места введения, пропитанные кровью, переносят их в стерильные фарфоровые ступки, в которые предварительно наливают 0,5 мл стерильного физиологического раствора, и тщательно растирают пестиком. По 0,2 мл полученной эмульсии вносят в чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по поверхности агаровых пластин. После впитывания эмульсии в агар одну из чашек используют для постановки пробы с фагом, другую - для определения антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом. Оставшиеся грубые частицы тканей места введения в фарфоровых ступках тщательно растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора, полученный гомогенизат переносят в пробирки, обеззараживают по общепринятой методике и используют для постановки серологических реакций. Посевы места введения выдерживают в термостате при 28^oC в течение 2 сут. Возможность использования предлагаемого способа иллюстрируется примерами практического его выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Из расчета на одно животное берут 0,5 мл исследуемого материала, содержащего суспензию одной блохи, смешивают его с гепаринизированной кровью кролика в соотношении 1-0,5, к полученной смеси добавляют 0,5 мл желтка куриного яйца, 5 мг кортизона, 0,01 мг калия теллуристокислого, 0,001 мг генцианвиолета. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины двум белым мышам, которых вскрывают на 1 и 2 сут после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать чумной микроб от блох через 2-3 сут от начала исследования.

Пример 2. Из расчета на одно животное берут 0,7 мл исследуемого материала, содержащего суспензию 5 блох, смешивают его с гепаринизированной кровью кролика в соотношении 1:0,6, к полученной смеси добавляют 0,6 мл желтка куриного яйца, 6 мг кортизона, 0,02 калия теллуристокислого и 0,002 мг генцианвиолета. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины двум белым мышам, которых вскрывают на 1 и 2 сут после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать чумной микроб от блох через 2-3 сут от начала исследования.

Пример 3. Из расчета на одно животное берут 1,0 мл исследуемого материала, содержащего суспензию 10 блох, смешивают его с гепариннизированной кровью кролика в соотношении 1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,7 мл желтка куриного яйца, 7 мг кортизона, 0,04 калия теллуристокислого и 0,003 мг генцианвиолета. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины двум белым мышам, которых вскрывают на 1 и 2 сут после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать чумной микроб от блох через 2-3 сут от начала исследования.

Как показали экспериментальные исследования, заявляемые пределы содержания ингредиентов, входящих в состав инокулята и твердой питательной среды являются оптимальными для достижения поставленной цели, так как при уменьшении их содержания менее заявляемых пределов не происходит ингибиции роста посторонней микрофлоры, а при их увеличении подавляется рост чумного микроба.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в бактериологических исследованиях позволит в кратчайшие сроки получить чистую культуру возбудителя умы от эктопаразитов (блох) с последующим ускоренным проведением дифференциации возбудителя и определения антибиотикочувствительности.